CQ+Aula+15+ +Controle+Microbiologico+ +Teste+de+Endotoxinas+Bacterianas

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12/02/2017 
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Disciplina: Controle de Qualidade 
Aline Teixeira 
Belo Horizonte 
2017 
CONTROLE DE QUALIDADE 
MICROBIOLÓGICO 
 
TESTE DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS 
Faculdade Pitágoras 
Curso: Farmácia 
 Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do LAL 
 
 Teste do LAL (Lisado de Amebócitos de Limulus)  
1973 o lisado foi reconhecido como indicador 
sensível de endotoxinas bacterianas 
 1980: aprovado pelo FDA para detecção de 
endotoxinas  Incluído na Farmacopeia Americana. 
 Método com sensibilidade 10X maior que teste do 
coelho. 
 Pirogênios não oriundos de bactérias gram-
negativas?? 
 
 
 
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Teste de Endotoxinas Bacterianas 
 Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do LAL 
 
 Obtenção do LAL: 
 Caranguejo ferradura Limulus polyphemus ou do Tachypleus 
tridentatus 
 Limulus  sangue azul (hemocianina). 
 Limulus  único tipo de célula sanguínea: amebócito  
coagula quando em contato com endotoxinas bacterianas 
 Obtenção dos amebócitos  sangramento por punção 
cardíaca: após coleta sangue, caranguejo é identificado e 
jogado ao mar. 
 Sangue coletado: centrifugado, lisado, liofilizado. 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
Aline Teixeira 2017 
A. Limulus polyphemus; 
B. Extração da hemolinfa 
(amebócitos); 
C. Recolhimento dos 
amebócitos; 
D. Tratamento do extrato 
(lise dos amebócitos). 
 
Aline Teixeira 2017 
Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do 
LAL 
 
 Fundamento do método: 
 Mecanismo da reação (LAL + endotoxina): 
 
• Reação enzimática, cálcio dependente. 
• A reação de coagulação (formação do gel) é iniciada 
com a presença de endotoxina. 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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 Cascata enzimática levando à coagulação do LAL 
 
Fator C Fator C ativado 
 
 Fator B Fator B ativado 
 
 Proenzima Enzima ativada (coagulase) 
 
 Coagulogênio [Cadeias peptídicas A e B] + [cadeia C] 
 
 
 Gel protéico 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
Endotoxina/Ca2+ 
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 Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do 
LAL 
 
 Metodologias Farmacopeicas: 
 
A) Método de gelificação  baseado na formação 
do gel 
B) Métodos fotométricos: 
 
B.1) MÉTODO TURBIDIMÉTRICO 
B.2) O MÉTODO CROMOGÊNICO 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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 Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do LAL 
 
A) Método de gelificação 
 
 Mais simples e amplamente utilizado. 
 Reagentes (água) e materiais (vidrarias) apirogênicos 
(calor seco  250°C/30min ou 200°C/1h). 
 Kit LAL e endotoxina E. coli (liofilizados). 
 LAL: disponível nas sensibilidades de 0,03; 0,06; 0,125 e 0,25 
UE/mL 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do LAL 
 
A) Método de gelificação 
 
 Procedimento do teste do LAL: 
 
 Volumes iguais de reagente LAL e da solução-amostra são 
transferidos a tubos de ensaio. 
 Homogeneização e incubação em banho de água a 37oC/1h. 
 Ponto final da reação: verificado pela remoção dos tubos e inversão 
a 180ºC. 
 Teste positivo para endotoxinas: presença do gel que se mantém 
sólido durante a inversão. 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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Teste de endotoxinas bacterianas  Teste do 
LAL 
 
A) Método de gelificação 
 
 Etapas na realização do teste: 
 
1) Teste para confirmação da sensibilidade rotulada do LAL: 
 Sensibilidade do lisado (): determinar a menor [ ] de endotoxina capaz 
de formar gel firme e confirmar a sensibilidade declarada pelo 
fabricante (rótulo do LAL) 
 Para realização do teste são utilizadas soluções de endotoxina padrão 
nas concentrações: 0,25; 0,5; 1 e 2. 
 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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1) Teste para confirmação da sensibilidade rotulada do LAL: 
 As soluções de endotoxina são adicionadas ao tubo contendo 0,1mL de 
LAL reconstituído (ensaio em quadruplicata). 
 Deve ser incluído um controle negativo (quadruplicata) 
 
 Reação positiva: formação de gel firme que mantem sua integridade 
quando tubo é invertido em 180° 
 
 Reação negativa: não há formação de gel firme, ou se forma gel 
viscoso que não mantém integridade quando invertido. 
 
A sensibilidade encontrada pelo lisado deve estar entre 
0,5  e 2  
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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1) Teste para confirmação da sensibilidade rotulada do LAL: 
 Exemplo: Sensibilidade rotulada do LAL: 0,12UE/mL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Média do log do ponto final = 
 Antilog = UE/mL =  calculado 
 Avaliação: 
 Controle negativo: 
  calculado: 0,06 ≤ ≤ 0,24 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
C- PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - - 
2 + + - - - 
3 + + + - - 
4 + + - - - 
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1) Teste para confirmação da sensibilidade rotulada do LAL: 
 Exemplo: Sensibilidade rotulada do LAL: 0,12UE/mL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Média do log do ponto final = -0,996 
 Antilog -0,996 = 0,10 UE/mL =  calculado 
 Avaliação: 
 Controle negativo: OK 
  calculado: 0,06 ≤ 0,10 ≤ 0,24 OK 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
C- PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - - 0,12 -0,9208 
2 + + - - - 0,12 -0,9208 
3 + + + - - 0,06 -1,2218 
4 + + - - - 0,12 -0,9208 
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2) Validação do ensaio: Teste de inibição ou potencialização 
 
 Determina o grau de inibição/ativação que o produto exerce nas reações de formação 
do gel. 
 Inibição: principal razão pelo qual os estudos de validação são requeridos. Agentes 
oxidantes, antioxidantes e proteolíticas são inativadores enzimáticos 97% dos casos 
são resolvidos com diluição da amostra em água apirogênica. 
 Ativação (potencialização): fenômeno raro 
 Teste: contaminar amostra com endotoxina e verificar se há formação de gel 
quando em contato com LAL. 
1. Amostra  amostra (apirogênica) + LAL  4 réplicas 
2. Controle positivo da amostra  soluções de endotoxina (0,25; 0,5; 1 e 2 ) em 
amostra + LAL  4 réplicas 
3. Controle negativo  água apirogênica + LAL  2 réplicas 
4. Controle positivo  soluções de endotoxina em água apirogênica (0,25; 0,5; 1 e 2 
) + LAL  2 réplicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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2) Validação do ensaio: Teste de inibição ou potencialização 
 
 Exemplo: sensibilidade rotulada do lisado: 0,12 UE/mL 
 
 Tabela 1: Resultados da amostra e controle positivo da amostra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Média do log do ponto final = 
 Antilog: = =  calculado 
 
 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
Amostra PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - - 
2 + + + - - 
3 + + + - - 
4 + + - - - 
A amostra usada na 
validação deve ser 
apirogênica! 
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2) Validação do ensaio: Teste de inibição ou potencialização 
 
 Exemplo: sensibilidade rotulada do lisado: 0,12 UE/mL 
 
 Tabela 1: Resultados da amostra e controle positivo da amostra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Média do log do ponto final = -1,0713 
 Antilog: -1,0713 = 0,08 UE/mL =  calculado 
 
 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
Amostra PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - - 0,12 -0,9208 
2 + + + - - 0,06 -1,2218 
3 + + + - - 0,06 -1,2218 
4 + + - - - 0,12 -0,9208 
A amostra usada na 
validação deve ser 
apirogênica! 
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2) Validação do ensaio: Teste de inibição ou potencialização 
 
 Exemplo: sensibilidade rotulada do lisado: 0,12 UE/mL 
 
 Tabela 2: Resultados dos controles positivo e negativo 
 
 
 
 
 
 
 Média do log do ponto final = -0,9208 
 Antilog: de -0,9208 = 0,12 UE/mL =  calculado 
 Avaliação dos resultados: 
 Réplicas das amostras negativo OK 
  calculado do controle positivo da amostra  0,06 ≤ 0,08 ≤ 0,24 OK 
 Réplicas do controle negativo  negativo OK 
  calculado do controle positivo  0,06 ≤ 0,12 ≤ 0,24 OK 
 Interpretação: a amostra pode ser ensaiada pelo método! 
 
 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
C- PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - - 0,12 -0,9208 
2 + + - - - 0,12 -0,9208 
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2) Validação do ensaio: Teste de inibição ou potencialização 
 
 Caso  calculado do controle positivo esteja fora do intervalo 0,5  e 2   amostra 
interfere no teste  realizar a diluição da mesma 
 Calculo da Máxima Diluição Válida (MDV): 
 
MDV = Limite de endotoxina X Potência do produto 
 sensibilidade rotulada do lisado 
 
 Limite endotoxina: expresso na monografia individual do produto 
 Sensibilidade rotulada do lisado: rótulo do produto 
 Potência do produto: rótulo do produto 
 
 
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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Teste propriamente dito 
 
 PARA O ENSAIO DEVEM SER PREPARADAS AS SEGUINTES SÉRIES 
DE TUBOS: 
1. Amostra: soluções da amostra (fatores de diluição 1, 2, 4 e 8) + LAL  2 
réplicas 
2. Controle positivo da amostra  soluções de endotoxina em amostra 
(2 ) + LAL  2 réplicas 
3. Controle negativo  água apirogênica + LAL  2 réplicas 
4. Controle positivo  soluções de endotoxina em água apirogênica (0,25; 0,5; 
1 e 2  ) + LAL  2 réplicas 
 
 O teste não é valido: 
 Se houver formação de gel firme no controle negativo, 
 Se no controle positivo da amostra não houver formação de gel, 
 Ou se o controle positivo apresentar sensibilidade que não esteja entre 0,5 e 2  
 
 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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 Exemplo  Produto: Glicose injetável 
 Sensibilidade rotulada do lisado = 0,12 UE/mL 
 Limite de endotoxina: 0,5 UE/mL 
 
Tabela 1: Resultados dos controles negativos e positivos da amostra. 
 
 
 
 
 
Tabela 2: Resultados do controle positivo. 
 
 
 
 
 
Tabela 3: Resultados da amostra. 
 
 
Réplicas C+ amostra C- 
1 + - 
2 + - 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - 
2 + + + - 
Réplicas 
Fator de diluição da amostra 
PF PF x rot Log (PF x rot) 
1 2 4 8 
1 + + - - 2 
2 + + + - 4 
 Exemplo  Produto: Glicose injetável 
 Sensibilidade rotulada do lisado = 0,12 UE/mL 
 Limite de endotoxina: 0,5 UE/mL 
 
Tabela 1: Resultados dos controles negativos e positivos da amostra. 
 
 
 
 
 
Tabela 2: Resultados do controle positivo. 
 
 
 
 
 
Tabela 3: Resultados da amostra. 
 
 
Réplicas C+ amostra C- 
1 + - 
2 + - 
Réplicas 
Concentração de endotoxina (UE/mL) 
PF Log PF 
0,24 0,12 0,06 0,03 
1 + + - - 0,12 -0,9208 
2 + + + - 0,06 -1,2218 
Réplicas 
Fator de diluição da amostra 
PF PF x rot Log (PF x rot) 
1 2 4 8 
1 + + - - 2 2 x 0,12 = 0,24 -0,6198 
2 + + + - 4 4 x 0,12 = 0,48 -0,3188 
 Avaliação dos resultados: 
 
 Réplicas do controle positivo da amostra  positivo OK 
 Réplicas do controle negativo  negativo OK ENSAIO VÁLIDO 
  calculado do controle positivo  0,06 ≤ 0,08 ≤ 0,24 OK 
 
 Concentração de endotoxina da amostra  0,339 < 0,5 OK 
 
 Interpretação: amostra cumpre o teste de endotoxina bacteriana! 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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Fatores críticos do teste de LAL 
 
 Tempo: deve-se incubar exatamente por 60 ∓ 2 minutos. 
 Temperatura: deve ser controlada rigorosamente em 37 ∓ 1 °C 
 Distúrbios: os tubos devem ser manuseados com cuidado, não 
devem ser expostos a vibrações. 
 pH: deve ser realizado na faixa ótima de 6,0 a 8,0. 
Teste de Endotoxinas Bacterianas 
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Considerações finais 
 
 Vantagens do teste do LAL: 
• Detecta, quantifica níveis sub-pirogênicos de endotoxinas. 
• Relativamente fácil. 
• Não sofre grande interferência (quando comparado com o 
teste de pirogênios em coelho). 
 
 Desvantagem do teste do LAL: 
• Falta sensibilidade para materiais pirogênicos que não sejam 
endotoxinas: muito incomuns em formulações de injetáveis. 
 
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