Averiguação das potenciais atividades biológicas das biomoléculas das sementes da Eugenia involucrata: lectinas e inibidores da cascata da coagulação

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Averiguação das potenciais atividades biológicas das biomoléculas das sementes da Eugenia involucrata: lectinas e inibidores da cascata da coagulação
Izabeli Isidoro dos Santos(PIBIC/Fundação Araucária/Unioeste), Leticia Maria Besen, Cleide Viviane Buzanello Martins, Rosemeire A. Silva-Lucca(Orientadora) 
e-mail: roselucca@uol.com.br 
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Engenharias e Ciências Exatas/Toledo-PR
Grande área e área: Ciências Exatas e da Terra - Química
Palavras-chave: proteínas, hemaglutinação, ensaios antimicrobianos.
Resumo
As lectinas são biomoléculas, presentes na maioria dos seres vivos, e podem ser utilizadas como ferramentas biotecnológicas devido a habilidade de se ligarem seletivamente a carboidratos. As lectinas vegetais desempenham diversos papéis biológicos, dentre eles, destacam-se a atividade antimicrobiana e inseticida, além de estimularem a atividade mitogênica das células do sistema imune humano. Neste trabalho, investigou-se a presença de lectinas nos extratos salinos fracionados por sulfato de amônio (FPD 0-80%) das sementes da espécie Eugenia involucrata, por meio de testes de hemaglutinação e inibição destes, na presença de carboidratos. Também foram realizados ensaios anticoagulantes, bem como testes antibacteriano e antifúngico. As frações FPD 40-80 e FPD 60-80 apresentaram atividade hemaglutinante, que foi inibida pela galactose, confirmando a presença de uma lectina. Adicionalmente, os resultados indicam que em todas as frações da E. involucrata existem potenciais agentes antimicrobianos.
Introdução
As lectinas são proteínas que possuem ao menos um domínio catalítico e se ligam seletiva e reversivelmente a carboidratos, podendo assim, promover aglutinações de hemácias ou células que possuam ao menos dois sítios de ligação para carboidratos. Deste modo, são amplamente utilizadas como ferramentas biotecnológicas. Estas biomoléculas estão presentes na maioria dos seres vivos, entretanto as lectinas vegetais são mais estudadas e dentre os seus papéis biológicos destacam-se a atividade antimicrobiana e inseticida, além de estimularem a atividade mitogênica das células do sistema imune humano (Lam et al., 2011).
Na família Myrtaceae, o gênero Eugenia se revela com espécies de valor comercial, nutritivo com potencial aproveitamento na produção de fármacos (Paim, 2011). Uma espécie pouco investigada é a Eugenia involucrata, nativa do sudeste e sul do Brasil, conhecida como cerejeira-do-rio-grande, utilizada popularmente pelas suas propriedades antirreumática, diurética, antidiarreica e digestiva (Rodrigues & Carvalho, 2001).
O presente trabalho consiste na investigação de substâncias hemaglutinantes (lectinas), anticoagulantes e antimicrobianas no extrato salino das sementes de Eugenia involucrata.
Materiais e Métodos
Os frutos maduros da espécie Eugenia involucrata foram coletados na região de Toledo-PR e Vera Cruz do Oeste-PR. As sementes secas à temperatura ambiente (25ºC) foram trituradas para a produção da farinha.
	Para a obtenção do extrato (EB), 10 g da farinha foram incubados em 50 ml de tampão fosfato de sódio (PBS), 0,1 M, pH 7,4, sob agitação durante 4 horas em refrigerador. O fracionamento do EB foi feito por precipitação com sulfato de amônio, nas saturações de 0-20%, 20-40%, 40-60% e 60-80%. (Pereira, et al., 2008). Em seguida, as frações precipitadas foram dialisadas em água destilada em membrana YM 14 kDa e denominadas FPD 0-20, FPD 20-40, FPD 40-60 e FPD 60-80.
Estas frações dialisadas foram submetidas a ensaios de microaglutinação (Figura 1) em eritrócitos humanos (1%) dos grupos A, B, AB e O, utilizando o método de diluição seriada. Os testes de hemaglutinação foram repetidos para frações aquecidas a 100°C durante 30 minutos. Nos ensaios da especificidade da lectina a monossacarídeos foram utilizados os carboidratos: galactose, glicose, maltose e manose (Silva et al., 2012). Adicionalmente, foram realizados testes da atividade anticoagulante e dosagem de proteínas pelo método de Bradford (Bradford, 1976), utilizando como proteína padrão a albumina do soro bovino (BSA – bovine serum albumin).
As frações precipitadas e dialisadas também foram submetidas a ensaios antibacterianos (Gonçalves, et al. 2005) e antifúngicos (Martins, et al., 2009), utilizando-se 5 µl de cada fração. 
Figura 1 – Teste de hemaglutinação, com um esquema representativo das diluições seriadas e uma foto da microplaca de titulação com resultados negativos e positivos.
Resultados e Discussão
As frações precipitadas e dialisadas FPD 0-20 e FPD 20-40 indicaram a presença de substâncias hemolisantes, inviabilizando a detecção de lectinas. Por outro lado, as frações FPD 40-80 e 60-80, apresentaram atividade hemaglutinante para os quatro grupos de hemácias utilizadas (A, AB, B e O) até a diluição de 1:128.
Dentre os carboidratos testados, apenas a D(+)-galactose inibiu a atividade hemaglutinante da lectina, que manteve a sua atividade após aquecimento a 100°C, indicando lectinas resistentes a altas temperaturas, como a EuniSL extraída das sementes da E. uniflora. (Andrade et al., 2009).
As frações FPD 40-60 e FPD 60-80 coagularam após 30 minutos, sugerindo que na concentração investigada essa substância é pouco eficiente.
A dosagem de proteínas revelou uma concentração estimada de 35 mg/mL para a FPD 0-20, 30 mg/mL na FPD 20-40, 18 mg/mL na FPD 40-60 e 15 mg/mL na FPD60-80 com R²=0,993 para a curva padrão da BSA.
	As tabelas 1 e 2 apresentam os resultados das atividades antifúngica e antibacteriana, respectivamente.
	
 Tabela 1: Resultados Testes Antifúngicos
	
	Frações Precipitadas por Sulfato de Amônio (%)
	Fungos
	0-20
	20-40
	40-60
	60-80
	C. gatti
	-
	+
	+
	+
	C. neoformans
	-
	+
	+
	+
	C. krusei
	+
	+
	-
	-
	C. parapsilosis
	-
	-
	+
	-
	C. albicans
	-
	-
	-
	-
	C. tropicalis
	+
	+
	-
	-
 Tabela 2: Resultados Testes Antibacterianos
	
	Frações Precipitadas por Sulfato de Amônio (%)
	Bactérias
	0-20
	20-40
	40-60
	60-80
	Aeromonas caviae
	+
	+
	+
	+
	Aeromonas hydrophila
	+
	+
	+
	+
	Escherichia coli
	+
	-
	-
	-
	Escherichia cloacae
	+
	+
	+
	-
	Escherichia faecalis
	-
	-
	-
	-
	Salmonella typhi
	+
	+
	+
	-
	Staphylococcus aureus
	+
	+
	+
	+
	Shigella
	+
	+
	+
	+
	Pseudomonas
	+
	-
	-
	-
	Serratia marcescens
	+
	+
	+
	+
Conclusões 
Os resultados revelaram que as sementes da E. involucrata possuem uma lectina com especificidade a D(+)-galactose e resistente a altas temperaturas. Por outro lado, todas as frações analisadas apresentaram atividade antibacteriana e/ou antifúngica, indicando a presença de potenciais agentes antimicrobianos, porém serão necessários estudos mais aprofundados para se determinar a sua natureza e seu real potencial. 
Agradecimentos
Fundação Araucária, Unioeste pelo fornecimento dos materiais para a dosagem de proteínas.
Referências
Andrade, C.A.S., Oliveira, M.D.L., Santos-Magalhães, N.S., Correia, M.T.S. & Melo, C.P. (2008). Comparation of interfacial properties of Eugenia uniflora and Triticum vulgaris lectins. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 68(1), 7-12.
Bradford, M. (1976). Analytical Biochemistry. 72, 248-254.
Conceição, H., Melhem, M., Sarpieri, A. & Pires, M.C. (2010). Avaliação do método de disco-difusão para determinação da eficácia da terbinafina in vitro em agentes de micoses superficiais e subcutâneas. Em Anais Brasileiros de Dermatologia. Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil. 
Gonçalves, A.L., Filho, A.A., Menezes, H. (2005). Estudo comparativo da atividade antimicrobiana de extratos de algumas árvores nativas. Arquivos do Instituto Biológico. 3, 353-358.
Gozzi, R.C. (2010).
Martins, C.V.B., Silva, D.L., Neres, A.T.M., Magalha, T.F.F., Watanabe, G.A., Modolo, L.V., Sabino, A.A., Fátima, A. & Resende, M.A. (2009). Curcumin as a promising antifungal of clinicalinterest. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 63, 337-339.
Paim, A.F. (2011). Contribuições para a micropropagação de Eugenia involucrata DC. E Handroanthus chrysotrichus (MART. ex DC) Mattos. Dissertação de Pós-Graduação em Engenharia Florestal, Universidade de Santa Maria, Santa Maria.
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