DETERMINAÇÃO DE BACTERIA EM SOLO

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METODOLOGIAS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS DO SOLO
 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO:
O solo contém uma grande variedade de microrganismos, incluindo bactérias, fungos, protozoários, algas e vírus. Apesar desta diversidade, os microrganismos cultiváveis predominantes entre a microflora do solo são fungos e de bactéria heterotróficas do domínio Bacteria. É, contudo, de ter em consideração que a flora microbiana presente numa amostra de solo depende de várias características do solo particular em estudo (p. ex. dá humidade, do pH, da temperatura, do conteúdo em oxigénio gasoso e da composição em material orgânico e inorgânico.
Estima-se que somente 1 a 9% das células viáveis de microrganismos presentes no solo são capazes de formar colónias em meios de cultura laboratoriais, como é o caso dos meios TSA ou PDA a usar neste trabalho laboratorial. Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo correspondem principalmente a células viáveis, mas não cultiváveis.
1.1 Os microbiologistas têm chegado a esta conclusão, com base, por exemplo, na comparação, relativamente a uma mesma amostra de solo, entre o número de células que formam colónias em meios de cultura laboratoriais, e o número total de células observáveis com o microscópio de fluorescência após a coloração das células presentes nessa amostra com compostos fluorescentes (como, por exemplo, o “acridine orange” que cora todas as células e permite distinguir células viáveis e células mortas). 
 Fig. 1- uma amostra de solo agrícola (colhida numa horta). 
1.2 Proposta de trabalho experimental
Isolar e contar, a partir de uma amostra de solo, colônias de microrganismos pertencentes aos grupos das bactérias heterotróficas e dos fungos miceliais.
Recorre-se a diluições sucessivas de uma suspensão da amostra de solo em solução salina (contendo 0.9% (p/v) em NaCl), e ao espalhamento de um volume conhecido (0.1 ml) das suspensões diluídas, em meios de cultura agarizados com composição apropriada para a multiplicação celular de cada tipo de microrganismo a isolar. Neste trabalho utilizar-se-á, concretamente, o meio PDA (“Potato Dextrose Agar”) suplementado com o antibiótico clorotretracilina para o isolamento de fungos filamentosos, e o meio TSA (“Tryptic Soy Agar”), que é um meio não-selectivo, para o isolamento de bactérias heterotróficas diversas.
2.Material necessário: 
Fig. 2 - Material laboratorial.
Amostra de solo (aproximadamente 1 grama) colhida num recipiente previamente 
esterilizado na autoclave. 
Nota:
Colher, de preferência, uma amostra de um solo rico, por exemplo de um jardim ou de um terreno agrícola;
Frascos Schott contendo 100 ml de solução salina (0.9% (p/v) em NaCl) esterilizada;
Placas de Petri contendo os meios sólidos PDA suplementado com clorotetraciclina (10 µg/ml) ou TSA;3 tubos de vidro rolhados, contendo 9 ml de solução salina (0.9% (p/v) em NaCl) esterilizados;Pontas de plástico para pipetas automáticas esterilizadas;Contador de colónias.
 
 Procedimento experimental; 
Pesar 1 grama da amostra de solo; 
Junto à chama do bico de Bunsen, transferir 1 grama da amostra de solo para o frasco contendo 100 ml de solução salina esterilizada; 
Agitar vigorosamente a suspensão de solo preparada no passo anterior, de modo a obter uma suspensão homogénea da amostra de solo e a facilitar a suspensão na água da maior parte das células dos microrganimos adsorvidas nas partículas de solo;
Junto à chama do bico de Bunsen, transferir 1 mL da suspensão original (preparada acima) para tubos de ensaio contendo 9 ml de solução salina estéril, de modo a diluir a suspensão de 10-1 (ou, 1:10). Faça diluições sucessivas até 10-4 (1:10000) (figura 2). 
Nota
Ter o cuidado de agitar vigorosamente a suspensão obtida após cada diluição (figura 3), antes de proceder à diluição seguinte.
Proceder ao espalhamento das suspensões diluidas no passo anterior, sobre meio sólido adequado contido em placas de Petri. Para tal, junto à chama do bico de Bunsen, transferir 0.1 ml da suspensão original e de cada uma das suspensões diluídas no passo 4, para a superfície de meio PDA suplementado com clorotetraciclina (até à diluição 10-3) ou de meio TSA (até à diluição 10-4), contidos em placas de Petri convenientemente identificadas (figura 4).
Espalhar as suspensões diluídas sobre o meio sólido com uma vareta de vidro em L esterilizada por imersão em álcool etílico e passada pela chama do bico de Bunsen (figura 5). 
Após passagem da vareta pela chama para queimar o álcool, deixar arrefecer convenientemente antes de se utilizar para espalhar a suspensão celular na superfície do meio sólido.
Incubar as placas à temperatura ambiente, durante 3 a 5 dias; Conte as colónias isoladas em cada placa. 
Com base nessa contagem, faça estimativas do nº de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) de cada um dos dois grupos de microrganismos presentes num grama de solo.
Faça ainda uma descrição sumária das características morfológicas das colónias isoladas de cada um dos dois grupos de microrganismos pesquisados.
Fig 3 - Colónias de bactérias heterotróficas em meio TSA 
 (diluição 10-2).
 
 
Fig. 4 - Colónias de fungos em meio PDA com clorotetraciclina (diluição 10-2)
3. Atividade de auto avaliação 
Resultados experimentais que podem ser obtidos no caso de uma amostra de solo agrícola (colhida numa horta),Isolamento de colónias de bactérias heterotróficas (em meio TSA):
São observáveis, em média, 12 tipos diferentes de morfologia de colónias. 
 
Fig. 8 - 354 colónias (diluição 10-2 (1:100). 
Fig. 9 - 61 colónias (diluição 10-3 (1:1000).
Isolamento de colónias de fungos miceliais (em meio PDA com clorotetraciclina):
São observáveis, em média, 4 tipos diferentes de morfologia de colónias. 
Fig. 10 - 49 colónias (diluição 10-2 (1:100).
O número de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) de bactérias heterotróficas em 1 grama do solo analisado na ordem de grandeza 107-108
Com base nos resultados obtidos relativos ao isolamento de colónias de bactérias heterotróficas em meio TSA:
4. Conclusão;
 
No solo agrícola analisado, bactérias heterotróficas são mais abundantes e apresentam maior diversidade do que fungos miceliais.
Meio TSA - Diluição 10-2 (ver figura 8).Meio PDA com clorotetraciclina - Diluição 10-2 (ver figura 10).As figuras 8 e 10 permitem comparar o número e os diferentes tipos morfológicos de colónias isoladas na superfície dos meios TSA ou PDA, onde foi espalhado um determinado volume da suspensão de solo diluída 10-2. Com base nessa comparação, é possível indicar que, entre os microrganismos cultiváveis nos meios de cultura usados, as bactérias heterotróficas parecem ser mais abundantes (maior número de colónias) e apresentar maior diversidade (tipo de colónias mais diversificado) do que os fungos miceliais.
As colónias de bactérias isoladas no meio TSA não representam a totalidade da flora bacteriana presente no solo agrícola analisado.
Os microbiologistas estimam que cerca de 91 a 99% da flora microbiana do solo correspondem principalmente a células que, apesar de poderem estar funcionalmente ativas, não são capazes de formar colónias nos meios de cultura laboratoriais.
Bibliografia: http://e-escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp