Prévia do material em texto
4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 ENTREVISTA TerapiaCelular Brasil sai na frente na terapia celular em humanos em todo o mundoBrasil sai na frente na terapia celular em humanos em todo o mundoBrasil sai na frente na terapia celular em humanos em todo o mundoBrasil sai na frente na terapia celular em humanos em todo o mundoBrasil sai na frente na terapia celular em humanos em todo o mundo Entrevista concedida a Edmilson Silva 4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Quatorze pacientes ficaram livres da fila de transplantes e voltaram a ter vida normal, depois de receberem células-tronco, injetadas diretamente no coração, em terapêutica revolucionária conduzida por pesquisadores do Pró-Cardíaco, da UFRJ e do Texas Heart Institute Um grupo de brasileiros colocou o País à frente no que há de mais revolucionário em termos da chamada medicina regenerativa , ao utilizar, em 14 pacientes - todos portadores de doenças coronarianas crônicas- , células-troncopara recuperar as áreas lesadas de seus corações. O sucesso da terapia celular foi tanto que os pacientes, todos com idades entre os 50 e 80 anos e para os quais a única alternativa médica seria apenas a realização de transplante, já após a 5ª semana da intervenção, recuperaram o tão sonhado bem-estar roubado pela doença. Dessemodo, voltaram a fazer coisas simples, masmuito significativas, tais como fazer uma caminhada,morar sozinho de novo, ou tomar um banho sem precisar parar no meio para descansar ou ter alguémpara enxugá-lo. Os resultados dessa bem-sucedida empreitadamédico-científica, que abre uma fronteira no tratamento do coração, ao injetar diretamente nomúsculo cardíaco 30milhões de células-tronco, retiradas damedula óssea dopróprio paciente, serão publicados, em breve, na mais conceituada revista da área, a Circulation. Prova de que, quando se tem um objetivo comum, é possível somar esforços entre duas áreas tidas, até então, pelos profissionais do setor, como incompatíveis, a terapia celular é fruto de três anos de trabalho conjunto entre pesquisa básica e clínica. Nesta entrevista para Biotecnologia, um dos principais integrantes desse grupo de cientistas, o jovemHans FernandoDohmann, coordenador do Laboratóriode InternaçõesCardiovascularesdoHospital Pró-Cardíaco, de apenas 37 anos, 13 dos quais dedicados à Cardiologia, dá detalhes sobre essa terapêutica pioneira e revolucionária, feita emparceria compesquisadores da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e do Texas Heart Institute. Dohman prevê que a terapia celular estará disponível para ser empregada em hospitais universitários, em breve, e representará uma revolução principalmente no tratamento da Doença de Chagas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 5 BC&D - Como começou o seu inte- resse pela terapia celular ? Hans Dohmann - Na verdade já tínhamos uma linha de pesquisa que trabalhava com o sistema de catéteres usado agora para implantar as células- tronco. E o começo de tudo se deu com o desenvolvimento desse catéter especial, em uma parceria com o Te- xas Heart, do estado do Texas, nos EstadosUnidos. BC&D - Que catéter é este ? Hans Dohmann - É um catéter com- pletamente diferente do que se usa hoje em Medicina, pelo fato de dispor de um pequeno sensor na ponta que nos dá uma localização muito precisa, espacialmente falando. E ele foi espe- cialmente desenvolvido, justamente pensando em se tratar o coração com a injeção de células, gens ou substân- cias. Com a qualidade do equipamen- to, poderíamos acertar o tratamento de forma muito melhor do que com a tecnologia disponível hoje. Com a téc- nica dos catéteres convencionais, não haveria como fazer a injeção no mús- culo endocárdico (parte interna do coração). BC&D - Quando é que vocês deci- diram injetar células-tronco para recuperar as áreas lesadas do co- ração ? Hans Dohmann - No início da pes- quisa, há quatro anos, a gente pensava em trabalhar com fator de crescimen- to, terapia gênica na verdade. Uma apresentação sobreperspectiva douso desse catéter especial na terapia celu- lar, realizadaemumencontro emHam- burgo, na Alemanha, nos empolgou a usá-lo para a injeção das células. Daí, passamos a estudar e nos preparar para fazer isso, uma vez que naquela época não havia praticamente nada sobre terapia celular. Sobre medula óssea, então, é que não havia nada mesmo. Tinha alguma coisa sobre o uso de células-satélite de músculo es- quelético. BC&D - E como é que se deu o desenvolvimento da tecnologia propriamente dita ? HansDohmann - Emerson Perin, um brasileiro radicadonos EstadosUnidos e que trabalha no Texas Heart, come- çou a estabelecer contatos com o De- partamento de Pesquisa de lá e eu, à procura de alternativas de pesquisa básica, acabei chegando a Radovan Borojevic e Antonio Carlos Paes de Carvalho, ambos pesquisadores da Universidade Federal doRiode Janeiro (UFRJ). Para nossa grata surpresa, a competência desses colegas está aci- ma de qualquer suspeita, além do fato de os interesses científicos terem se reunido: tínhamos como colocar as células, todo o know-how clínico, e eles o conhecimento sobre células- tronco. A partir dessa conjunção de interesses, fomos convidados a integrar o Instituto do Milênio de Bioengenharia Tecidual e neste projeto ficou determinado que caberia ao Hospital Pró-Cardíaco de- senvolver o uso da terapia celular em doenças coronarianas, dentro das di- versas perspectivas que aquele Insti- tuto têm. BC&D - Uma queixa freqüente é a de que pesquisa básica e clínica estariam em campos opostos. Não foi o que aconteceu neste caso. Hans Dohmann - No nosso caso, além do resultado científico, uma das grandes coisas boas é a demonstração clara de que a relação entre pesquisa clínica e básica é necessária, simples. As necessidades entre as duas são, na verdade, complementares. A ciência básica nos dá condição de trabalhar, mas há o nosso papel, que é o de fazer chegar as células-tronco ao coração, via implante, e, além disso, desenhar o cenário clínicopara encontrar amelhor formadedemonstrar o resultado. E isto é umprocessomuito complexo. Como escolher o modelo que primeiramente beneficie o paciente, que esse benefí- cio ocorra com o menor risco possível e, terceiro, que dentro da rigorosidade metodológica, você consiga, de forma efetiva, demonstrar algum resultado, científicamente falando. BC&D - Mas apesar de toda essa complexidade, a terapia celular é um sucesso. Hans Dohmann - Acabamos deci- dindopela criaçãode vascularização e, com isso, conseguimos identificar e submeter ao transplante uma parcela de doentes da população que não tinha outro tratamento convencional a receber. Portanto, tudo que eles tives- sem de efeito, seria, efetivamente, decorrente do uso das células-tronco. Escolhemos pacientes para os quais a medicina não tinha mais nada a ofere- cer, a não ser o transplante cardíaco. BC&D - De que doenças esses pa- cientes eram portadores ? Hans Dohmann - De doença coro- nariana crônica, tipo angina, com as artérias coronárias entupidas, coração grande, já dilatado caracterizando a insuficiência cardíaca junto.Decidimos trabalhar com esses 14 pacientes, pri- meiro porque foi o melhor modelo para o uso da terapia celular; segundo, porque a doença coronária é a que a equipe do Hospital Pró-Cardíaco tem mais experiência, e, terceiro, pelo fato de essa doença ser a mais comum, a quemais mata as pessoas. Outra razão principal é a de que o modelo é socialmente justificável, ao provocar um impacto positivo muito grande na recuperação da qualidade de vida de muitas pessoas. Havia um grupo-controle, constituído por seis pacientes, que apenas foram acompanhados,duranteaprimeira fase, para servir de parâmetro, mas dentro de um mês ou dois meses, eles tam- bém serão submetidos à terapia celu- lar. BC&D - Quando foi feito o primei- rocaso e quais foram os resulta- dos obtidos ? Hans Dohmann - Há mais de um ano: exatamente no dia 16 de dezem- bro de 2001. O mais importante de tudo foi a demonstração da segurança do procedimento, e já que o protocolo desenhado se pautou em exeqüibili- dade e segurança, conseguimos pro- var que dá para fazer. Não houve nenhumadificuldadedentrodoque foi planejado, no que diz respeito à retira- da, transporte e separação de células. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 5 O principal gol é que aonde antes o sangue chegava com dificuldade - o que caracteri- za a angina nessa coronária- passou a ser melhor irrigada. Em alguns casos, a melhora da irrigação foi de 100% 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Apesar de ser muita coisa nova ao mesmo tempo, tudodeu certo, quando poderia alguma coisa sair errada. Gra- ças a Deus, tudo funcionou bem. A informaçãomais importante de todas é que a terapia celular não fez mal a ninguém, aindamais se considerar que os doentes submetidos à terapia esta- vam em estado muito grave, alguns dos quais já em filas de transplante. BC&D - Do ponto de vista fisiológi- co, como poderia ser descrito esse bom funcionamento da terapia ? Hans Dohmann - O principal gol é que aonde antes o sangue chegava com dificuldade - o que caracteriza a angina nessa coronária - passou a ser melhor irrigada. Em alguns casos, a melhora da irrigação foi de 100%, em outros parcial e em apenas dois casos ela não ocorreu. E para estes casos, há explicações técnicas possíveis. Obvia- mente que se aprende fazendo. Em suma, a célula-tronco tem capacidade de melhorar a perfusão sanguínea de determinada área do coração. Em de- corrência dessamelhorada chegadado sangue, a força do coração também melhorou. Onde havia isquemia, dei- xou de ter, e, com isso, o coração passou a contrair com mais força. O tamanhodo coraçãodiminuiu, aumen- tou a força,melhorou a perfusão, dimi- nuíram as arritmias, quando havia o medo de que elas aumentassem. En- fim, com o uso das células-tronco, a fisiologia do tecido cardíaco se dá com mais facilidade. BC&D - E sob a ótica da qualidade de vida, quais foram os ganhos que os pacientes obtiveram ? HansDohmann - Seja por protocolos de cunho científico, que avaliam a qualidade de vida, seja pela própria conversa comos indivíduos, amelhora foi enorme. Muito além do que, since- ramente, se poderia esperar. Um paci- ente que tinha que parar no meio da refeição para descansar e que no final do banho a esposa tinha que ajudar a enxugá-lo, porque ficava muito cansa- do, me liga determinado dia, todo feliz da vida, para contar que havia acabado de dar uma caminhada em volta do Maracanã - cuja área do entorno próxi- mo é de 1.700 metros de comprimen- to. Isto apenas oito semanas depois da realização da terapia. Alguns pacientes já voltaram a trabalhar, quando não faziam isto antes, devido aos proble- mas cardíacos. Um outro paciente, de seus 50 anos, passou a morar com a mãe, porque não se sentia bem, mas como agora está recuperado, decidiu voltar a morar sozinho, e a senhora ficou chateada com isso. Para mim, o mais fascinante é a vida humana que está por trás disso. BC&D - Quando será feita a publi- cação dos resultados dessa expe- riência bem-sucedida ? Hans Dohmann - Os resultados já vem sendo apresentados em congres- sos nacionais ou internacionais, desde meados de 2002. Com relação à publi- cação em revista científica, posso adi- antar que os dados já seguiram para a Circulation. BC&D - Passo a passo, como é que as células-tronco são injetadas no coração do paciente ? Hans Dohmann - O paciente chega às 7h no hospital, às 7:15h está deitado no leito, monitorado, sedado. Faz-se, então, umapunção na crista ilíaca pos- terior, de onde se retira entre 40 ml a 50 ml de aspirado medular, produto queéencaminhadoao laboratóriopara o processo de separação de células. Basicamente, células mononucleares de medula óssea. Nesse meio tempo, o paciente é submetido a um cateteris- mo, para que seja feito o mapeamento em que escolhemos as áreas para inje- ção das células. As injeções são feitas com a ajuda desse catéter especial, que, na verdade, foi adaptado para funcionar como uma fina e enorme seringa móvel. Com as 20 ou 25 inje- ções, espalhamos as células em toda a área lesada, da forma mais uniforme- mente possível. Em cada um desses pontos, injetamos 0,2 ml de células- tronco, porque foi verificado no es- tudo com animais (porcos, devido ao fato de que a biomecânica circu- latória é muito parecida com a de humanos) que se essa quantidade for maior, as células são rejeitadas. Ao todo, portanto, injetamos 4ml a 5ml de concentrado celular. BC&D - Essa técnica está sendo usada em outro lugar do Brasil, ou mesmo do mundo ? Hans Dohmann - Sob forma de pesquisa sim, mas sempre visando o uso de células de músculo esque- lético. Depois de nossos comunica- dospioneiros emcongressosnoano passado, grupos da Coréia, Estados Unidos e Europa estão começando a anunciar seus resultados. BC&D - Além das doenças coro- narianas, em que outras doen- ças os pacientes podem ser be- neficiados com essa técnica ? Hans Dohmann - A Doença de Chagas, e graças ao trabalho que vem sendo desenvolvido pelo Ins- tituto do Milênio de Bioengenharia Tecidual, através da equipe de Ri- cardo dos Santos, do Centro de Pes- quisasGonçaloMoniz, da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) em Salva- dor,Bahia. BC&D - Há algum limite etário para o uso da terapia celular ? Hans Dohmann - Ainda não te- nho essa resposta final, mas posso dizer que o nosso protocolo limita em 80 anos de idade e os resultados são bons. A grandedúvida é a quan- tidadedecélulas-troncoque sepode encontrar em indivíduos mais ve- lhos e quanto elas ainda poderão se tornar ativas, em comparação com células-tronco encontradas em um adulto jovem ou em uma criança. Na minha opinião, funciona igual- mente tanto em jovens quanto em adultos.Tantoque, nopróximopro- tocolo, pretendodeixar a idade libe- rada. Se o indivíduo está ativo, lúci- do e tem condições clínicas de se submeter ao procedimento cirúrgi- co, não vejo porque não fazê-lo. A minha sensação é de que não deve ter um efeito tão pleno quanto o de uma célula jovem, mas elas ainda têm algo a oferecer. 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Um paciente que tinha que parar no meio da refeição para descansar, me liga determinado dia para contar que havia acabado de dar uma caminhada em volta do maracanã Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 7 BC&D - E no outro extremo, as crianças, principalmente as que nascem com problemas cardíacos, podem ser beneficiadas pela técni- ca ? Hans Dohmann - Acho que no futuro haverá alguma aplicabilidade,mas aí já é um campo bastante diferente, visto que as doenças congênitas, na maioria das vezes, são de mal-formação. Próteses que se usamhoje, tais comoos homoen- xertos, usados para substituir válvulas cardíacas, por exemplo, passarão a ser produzidas tambémcomcélulas-tronco, para ficar um tecido mais apropriado. Entretanto, desconheço qualquer pes- quisa nessa área. BC&D - Você falou em desenho de protocolos novos, mas na verdade o que vocês fizeram foi a produção de conhecimento e isto dá muito trabalho. Hans Dohmann - É verdade. Cada método utilizado o foi pela primeira vez neste cenário clínico de transplantes autólogos de células de medula óssea para coração. Portanto, não havia base alguma sequer para raciocinar a partir daquilo. Você tem que sentar, repetir, imaginar, raciocinar; às vezes as coisas são diretas, outras nem tanto assim. Às vezes, os resultados são diferentes dos que você estava acostumado a ver. E você se pergunta: meu Deus, o que foi que aconteceu aqui, até receber outras informações e concluir umaoutra idéia e aí, então, propô-la à comunidade cientí- fica,que é o ponto que a gente - uma equipe de, no mínimo 40 pessoas - chegou. Nós partimos do zero e estamos fazendo tudo obedecendo aos rígidos padrões internacionais de realização de pesquisa. Quando se está abrindo uma fronteira do conhecimento, você não pode vender gato por lebre, nem passar por santo milagreiro. BC&D - A experimentação direta em humanos não envolve mais riscos ? Hans Dohmann - Para nós clínicos, esta fase que estamos fazendo é justa- mente a de testar a segurança da técnica. Tanto é que agora em 2003, ou 2004, pretendemos ampliar a quantidade de pacientes, para ver se os resultados encontrados se confirmam na fase em que testaremos a eficácia. Temos que lembrar quenós estamos aqui animados, felizes, mas são apenas 14 doentes. Temos que ter responsabilidade com isso e é essa a razão de ampliarmos o número de pacientes. Não acredito que isso vá acontecer com a nossa pesquisa não, mas há vários relatos na medicina completamente diferentes dos pioneiros. BC&D - Pelo que vem sendo obser- vado, , em quanto tempo a terapia celular estaria disponível à popu- lação? Hans Dohmann - Acho que será rápido: dois anos, dois anos e pouco, até porque os resultados têm sidomais animadores do que normalmente são. Tem despertado interesse planetário. Há muita gente se mexendo para pes- quisar nessa área. E se nos novos estu- dos com os grupos ampliados de paci- entes, em breve, os resultados forem tão bons quanto os que temos registra- do até agora, não vejo qualquermotivo bioético razoável para a Associação Nacional de Vigilância Sanitária (Anvi- sa) não liberar o emprego da terapia celular para uso clínico. Temos que lembrar que ela será usada em indiví- duos que não têm outra perspectiva clínica, a não ser o transplante. E o transplante, todos nós sabemos, não é um problema apenas brasileiro, não vai, nunca, atender às necessidades da população como um todo. Acredito honesta e sinceramente que, em bre- ve, a terapia passará a ser realizada pelo menos nos hospitais universitári- os, ou naqueles que disponham de laboratórios de hemodinâmica, e que tenhaprofissionais comconhecimento suficientes para separar células-tronco. BC&D - Já dá para imaginar quanto custaria a terapia celular ? Hans Dohmann - Se levarmos em consideração apenas o catéter especi- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 7 al, não daria para ser feita por menos de R$ 40 mil. Isto sem falar nos vários anticorpos, todos importados, usados para a separaçãodas células-tronco. Evi- dentemente, que quando você passa a fabricar uma maior quantidade de caté- teres, a tendência do preço é cair. A parte hospitalar não é cara. BC&D - Qual é o tempo de interna- ção do paciente para a realização da terapia ? Hans Dohmann - Os doentes ficam internados 48 horas, até por uma ques- tão de segurança, mas acho que esse tempo poderá ser reduzido, uma vez que nenhum problema foi constatado. Depois disso, o paciente retorna três dias depois e após esse período, vem ao hospital de semana em semana. BC&D - Poderia especificar a quan- tidade, mesmo que aproximada, de células tronco empregadas no tra- tamento? Hans Dohmann - Isso dá em torno de 30milhões de células. Este foi o número máximocomoqual decidimos trabalhar. BC&D - Vocês pretendem usar mais células nas próximas terapias ? Hans Dohmann -Uma de nossas futu- ras linhas de pesquisa é aumentar a quantidade de células-tronco, para ver se tudo funcionará como até agora. BC&D - As células-tronco, poderão ser retiradas somente da própria pessoa ou de terceiros? Hans Dohman - Neste estágio de pesquisa clínica, estamos trabalhando comcélulas autólogas. Parautilizaçãode células de terceiros, ainda temos que aprender algo sobre a imunologia das células-tronco. BC&D - No caso de terceiros, al- guém mais jovem? E nesse caso, haveria possibilidade de rejeição? Hans Dohman - Realmente trabalha- mos com o conceito de que células mais jovens podem ter uma capacidade re- constitutiva maior. No entanto, a confir- mação deste conceito sob o ponto de vista de impacto clínico ainda está por se dar. Por outro lado, sempre a principal questão que norteará a utilização de células de terceiros será o risco de rejei- ção, que não está descartado de forma alguma e só será corretamente avaliado com o avanço do conhecimento das propriedades imunológicas destas célu- las. Temos que lembrar que ela será usada em indiví- duos que não tem outra perspectiva clínica a não ser o transplante 10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Carta ao Leitor BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento KL3 Publicações Fundador Henriqueda Silva Castro Direção Geral e Edição Ana Lúcia deAlmeida Diretor de Arte HenriqueCastro Fº Projeto Gráfico Agência deComunicação IRIS E-mail biotecnologia@biotecnologia.com.br Home-Page www.biotecnologia.com.br Os artigos assinados são de inteiraresponsabilidade de seus autores. ISSN 1414-4522 Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS (International Information System for the Agricultural Sciences andTechnology)daFAOepara aAGROBASE (BasedeDadosda AgriculturaBrasileira). PrezadosLeitores, A revista Biotecnologia está sendo reestruturada, e será, daqui por diante, eletrônica. Pretendemos automatizar cada vez mais oferecendomaior agilidade e intercâmbio. Comunicamos tambémque estamos disponibilizando, no site, todosos artigos anteriores aos nossosusuários. Por enquanto, estamos fazendoos ajustesnecessários. Atenciosamente RevistaBiotecnologia Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 11 Conselho Científico Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde; Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Dr. Naftale Katz - Saúde; Dr. Pedro Jurberg - Ciências; Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Fundação Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN Dr. José Roberto Rogero Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ EntrevistaEntrevistaEntrevistaEntrevistaEntrevista HansDohmann 04 PesquisaPesquisaPesquisaPesquisaPesquisa Bioinformática:ManualdoUsuário 12 Chagas - Fenômeno da Resistência 26 O Contexto Brasileiro para a Bioprospeção 32 Ectomicorrizas: A Face Oculta das Florestas 38 HPV e Câncer 48 MarcadoresMolecularesDominantes (RapdeAflp) 56 MicrorganismosEndofíticos 62 MicropropagaçãodeParicá 78 Milho: Teor de umidade x Atividade de água 84 ÁrvoresGeneticamenteModificadasnaSilvicultura Intensiva 92 Otimização do Processo de Embriogênese Somática em Cacau 100 Fluxo Gênico: Análise do caso de Algodão no Brasil 104 BioconservaçãodeAlimentos 114 Geração de Eletricidade com Biogás de Esgoto: Uma Realidade 120 SeleçãodeLinhagensEnvolvidasnaBiodegradaçãodePesticidas 124 Avaliação da Genotoxicidade em Planta do Cerrado 128 CFLAE: Detector de Aflatoxinas em Milho 134 BiomassaResidual Proveniente da Indústria Viti-Vinicola 142 MarcadorMicrossatélite na Conservação de Germoplasma Vegetal 146 HidrolisadoenzimáticoparadietoterapiadeFenilcetonúricos 152 Proteoma 158 Propagação de CAMU-CAMU 166 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Pesquisa Um guia básico e amplo sobre os diversosaspectos dessa nova ciência Bioinformática: Manual do Usuário Ilustrações cedidas pelos autores Figura 1: O Dogma Central da BiologiaMolecular Francisco Prosdocimi Mestrando emGenética e Especialista em Bioinformática UniversidadeFederaldeMinasGerais franc@icb.ufmg.br Gustavo Coutinho Cerqueira Bacharel emCiência da Computação e Especialista em Bioinformática UniversidadeFederaldeMinasGerais cerca@csr.ufmg.br Eliseu Binneck Doutor em Ciência e Tecnologia de Sementes e Especialista em Bioinformática Embrapa Soja binneck@cnpso.embrapa.br Acácia Fernandes Silva Mestre em Agronomia e Especialista em Bioinformática EmpresaPernambucanadePesquisa Agropecuária acacia@ipa.br Adriana Neves dos Reis Bacharel em Informática e Especialista em Bioinformática Universidade do Vale do Rio dos Sinos adriana@exatas.unisinos.br Ana Carolina Martins Junqueira Mestre emGenética e Biologia MoleculareEspecialistaem Bioinformática Universidade de Campinas anacmj@unicamp.br Ana Cecília Feio dos Santos Mestranda emGenética e Biologia MoleculareEspecialistaem Bioinformática Universidade Federal doPará cecifeio@ufpa.br Antônio Nhani Júnior Doutor em Bioquímica e Especialista em Bioinformática UniversidadeEstadualPaulista nhani@fcav.unesp.br Charles I. Wust Mestrando em Ciências da Computa- ção e Especialista em Bioinformática Universidade Federal de Santa Catarina wust@inf.ufsc.br Fernando Camargo Filho Mestrando em Biotecnologia Vegetal e Especialista em Bioinformática Universidade de Ribeirão preto camargo@odin.unaerp.br Jayme Lourenço Kessedjian Analista de sistemas e Especialista em Bioinformática Embrapa Agrobiologia jayme@cnpab.embrapa.br Jorge H. Petretski Prof. Associado e Especialista em Bioinformática Universidade Estadual doNorte Fluminense jhpetretski@uenf.br Luiz Paulo Camargo Analista de Sistemas e Especialista em Bioinformática Universidade de Ribeirão Preto luizpcam@uol.com.br Ricardo de Godoi Mattos Ferreira Bacharel emCiênciasBiológicas e Especia- lista em Bioinformática UniversidadedeSãoPaulo ricgmf@lineu.icb.usp.br Roceli P. Lima Mestrando em Informática e Especialista em Bioinformática Universidade do Amazonas rossi@horizon.com.br Rodrigo Matheus Pereira Mestrando emMicrobiologia e Especialista em Bioinformática UniversidadeEstadualPaulista rodrigus@fcav.unesp.br Sílvia Jardim Mestre emFarmacologia e Especialista em Bioinformática Embrapa Milho e Sorgo silviajardim@yahoo.com.br Vanderson de Souza Sampaio Mestrando emGenética e Biologia MoleculareEspecialistaem Bioinformática Universidade Federal doPará vander@ufpa.br Áurea V. Folgueras-Flatschart Doutora emMicrobiologia e Especialista em Bioinformática UniversidadeFederaldeMinasGerais folguera@bol.com.br INTRODUÇÃO Do início até meados do século passado os geneticistas e químicos se questionaram sobre a natureza química domaterial genético. Das pes- quisas desenvolvidas, surgiu a conclusãodeque o DNA era a molécula que armazenava a infor- mação genética e, em 1953, sua estrutura quí- mica foi desvendada no clássico trabalho de Watson e Crick. Com a posterior descoberta do código genético e do fluxo da informação bioló- gica, dos ácidos nucléicos para as proteínas, tais polímeros passarama constituir os principais objetos de estudo de uma nova ciência, a Biolo- giaMolecular. Logo surgirammétodos de se- qüenciamentodesses polímeros, principalmente do DNA, que permitiam a investigação de suas seqüênciasmonoméricas constituintes.Desde então, mais de 18 bilhões dessas seqüências já foramproduzidas e estão disponíveis nos ban- cos dedadospúblicos. Na segunda metade da década de 90, com o surgimento dos seqüenciadores automáticos de DNA, houve uma explosão na quantidade de seqüências a seremarmazenadas, exigindo recur- soscomputacionais cadavezmaiseficientes.Além do armazenamento ocorria, paralelamente, a ne- cessidade de análise desses dados, o que tornava indispensável a utilizaçãodeplataformas compu- tacionais eficientespara a interpretaçãodos resul- tadosobtidos. Assimnascia abioinformática. Essanova ciên- ciaenvolveria auniãodediversas linhasdeconhe- cimento a engenharia de softwares, a matemá- tica, a estatística, a ciência da computação e a biologiamolecular.Osprimeiros projetos na área eram compostos por profissionais de diferentes Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 13 áreas da biologia e informática e percebia-se uma certa dificuldade de comunicação: enquantoobiólo- go procurava uma solução que le- vasseemconsideraçãoas incertezas e erros que ocorrem na prática, o cientista da computação procurava uma solução eficiente para umpro- blemabemdefinido.Assim, surgiua necessidade de um novo profissio- nal, que entendesse bem ambas as áreas e fizesse a ponte entre elas: o Bioinformata. Esse profissional de- veria ter o conhecimento suficiente para saberquais eramosproblemas biológicos reais e quais seriam as opções viáveis dedesenvolvimento e abordagem computacional dos problemas emquestão. Dado o sucesso e a importância que alcançaram os projetos Geno- ma e seus desmembramentos, o bioinformata temsidoumprofissio- nal requisitado e raro. No exterior, podemser encontradospelomenos 122cursosde formaçãoembioinfor- mática, em sua grandemaioria cen- tradosnaAméricadoNorteeEuropa (http://linkage. rockefeller.edu/wli/ bioinfocourse/).NoBrasil, entretan- to, até o início deste ano, não existi- am cursos que formassem tais pro- fissionais especializados. Políticas científicas governamentais têmpro- curado incentivara formaçãodegru- pos de pesquisa e de pessoal nessa área, financiandoprojetos e criando cursos depós-graduação. Em2002, foi implantado o primeiro Curso de Especialização (pós-graduação lato sensu) do LNCC (http://www. lncc.br/~biologia) - do qual forma- mos a segunda turma. Ainda neste ano foi autorizada pela CAPES a criaçãodedois cursosdedoutorado em Bioinformática, um na USP e outro na UFMG (http://www. capes.gov.br/). Parece-nos que cada vez mais a bioinformáticavaisernecessáriapara a análise de dados embiologiamo- lecular e, nesse sentido, o presente artigo foi escrito com o intuito de conter as informaçõesmais relevan- tes para quem deseja começar a trabalhar na área. Assim, tentamos apresentar os principais conceitos relacionadosàbiologiaeàcomputa- ção, os softwaresmais utilizados, os sitesmais freqüentados e asprincipais áreas de interesse. Sistemasoperacionais O sistema operacional (SO) é o principal programa de um computa- dor. Ele é responsável pelo gerencia- mento da memória, pelo acesso aos discos e também intermedeia todo acesso aos componentes físicos da máquina(hardware). Os SOs mais conhecidos e utiliza- dossãoaquelesbaseadosnoWindows, Unix e MacOS. Muitas das aplicações utilizadas embioinformática são com- piladas e distribuídas para a execução em plataformas derivadas do Unix, portanto o conhecimento desse siste- maoperacional édegrande importân- ciapara aquelesquedesejamaprofun- dar-se na área. Apreferência por siste- masbaseadosemUnixdeve-se ao fato de que tais sistemas são normalmente mais confiáveis, gerenciam melhor o trabalho comgrandes quantidades de dadosequealgumasdesuasvariantes, comooLinux,possuemcódigoaberto edistribuiçõesgratuitas. Linguagens de programação Umprofissionalembioinformática, além de saber utilizar os programas produzidosporoutrosprogramadores, deve também ser capaz de desenvol- ver programas aplicativos para lidar com os mais diversos problemas en- contrados durante a análise de dados embiologiamolecular. Paradesenvol- ver, portanto, tais programas, o bioin- formata deve ter conhecimento sobre algum tipo de linguagem de progra- mação. As Linguagensdeprogramação fo- ram criadas para facilitar a especifica- çãode tarefas a umcomputador. Exis- temmilharesde linguagensdeprogra-mação e cada uma delas possui um conjuntodecomandosespecíficosque criamesta interfacehomem-máquina. Das linguagens de programaçãomais utilizadas,podemoscitar:basic,pascal, C, C++, java, cobol e fortran. Entretan- to, a linguagem mais utilizada pelos bioinformatas é, sem sombra de dúvi- da, o PERL. O PERL (Practical Extract andRe- port Language) é uma linguagem de programação, simples e muito rica, alémdedisponível gratuitamente. Foi criada por Larry Wall, originalmente para produzir relatórios de informa- ções de erros, que a disponibilizou na Internet no espírito freeware, pensan- doquealguémpudesseachá-laútil.Ao longo dos anos esta linguagem con- quistoumilhares de adeptos e, através de várias colaborações recebidas para seu aprimoramento, o PERL é hoje conceituado como uma linguagem sofisticada, que possui como ponto forte amanipulaçãode texto,masque, alémdisso,possui todasas característi- cas de uma linguagem de alto-nível genérica. Éessagrande facilidadepara a manipulação de texto que fez do PERL a linguagem mais utilizada no tratamentodedadosde seqüências de DNA e proteínas. OPERLpode ter suas funcionalida- des acrescidas através de módulos, que são distribuídos gratuitamente. Existem módulos para uma gama de aplicações, desdemétodosestatísticos clássicos, aplicações gráficas em 3D, até acesso a internet via programação PERL. O site CPAN (Comprehensive Perl Archive Network http://www. cpan.org) éoprincipalpontodedistri- buiçãodemódulos e de suas respecti- vas documentações. Alguns destes módulos são especialmente dirigidos para aplicações em Bioinformática, destacando-se os módulos bioperl e biographics,queapresentamferramen- tas bastanteúteis para asmais diversas aplicações nesta área. Umaboa interconectividade com bancos de dados é outra característi- ca desejada em uma linguagem de programação.A linguagemPERL atende muito bem a esta demanda através da biblioteca PERL-DBI, um conjunto demódulos que fornece uma interface consistente para solu- ções de integração com bancos de dados. Bancos de dados Emconseqüência da grande quantidade de informações de se- qüências de nucleotídeos e de ami- noácidosque sãoproduzidas atual- mente, principalmente em projetos Genoma, TranscriptomaeProteoma, o uso dos bancos de dados vem as- 14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 sumindouma importância crescente nabioinformática. Um banco de dados pode ser consideradoumacoleçãodedados inter-relacionados,projetadopara suprir as necessidades de um grupo específico de aplicações e usuários. Um banco de dados organiza e es- trutura as informações demodo a facilitar consultas, atualizações ede- leções de dados. A grandemaioria dos bancos de dados é atrelado a um sistema deno- minado SGBD (Sistema de Gerencia- mento de Banco de Dados). Este sistema é responsável por intermedi- ar os processos de construção,mani- pulação e administração dobanco de dados solicitadospelosusuáriosou poroutras aplicações. Existem vários sistemas de geren- ciamento de banco de dados, sendo que cada sistema possui seus prós e contras. Omysql é um sistema muito utilizadopela comunidadeacadêmica e em projetos genoma por ser gratui- to, possuir código aberto e acesso veloz aos dados,mas apresenta certas limitações em suas ferramentas. O postgreSQL também é um SGBD gra- tuito, com ferramentasmuitopodero- sas, entretanto não é muito utilizado pela dificuldadeno seugerenciamen- to.Os SGBDsOraclee SQLServer são robustos e sofisticados,masdevidoao alto custo de suas licenças possuem seuuso limitadoàsgrandes empresas. Bancos de dados públicos embioinformática O investimento contínuo na cons- trução de bancos de dados públicos é um dos grandes motivos do sucesso dos projetos genoma e, em especial, doProjetogenomaHumano.Devidoà magnitudedoconjuntodedadospro- duzidos torna-se fundamental a orga- nização desses dados em bancos que permitamacessoon-line. Os bancos de dados envolvendo seqüências de nucleotídeos, de ami- noácidos ou estruturas de proteínas podemser classificados embancosde seqüências primários e secundários. Osprimeiros são formadospeladepo- sição direta de seqüências de nucleo- tídeos, aminoácidosouestruturaspro- téicas, sem qualquer processamento BOX1 - Exemplo de programa PERL para obter a fita reversa- complementar a partir de uma seqüência de DNA desejada. #!/usr/bin/perl # Seqüência que se deseja utilizar $meuDNA= TTCCGAGCCAATTGTATCAGTTGCCAATAG; # Inverte a ordem da seqüência de DNA $RevCom = reverse $meuDNA; # Troca as bases produzindo a fita complementar $RevCom =~ tr/ACGT/TGCA/; print Minha seqüência invertida é: \n $RevCom; A primeira linha é obrigatória e diz ao programa o caminho onde se encontra o interpretador PERL para que o programa possa achá-lo na hora de sua execução. As linhas seguintes que se iniciam com o sinal de # representam linhas de comentário. As variáveis em PERL são sempre seguidas do sinal de $ e não precisam ser declaradas, cabe ao programador saber como e em que contexto devem ser utilizadas. Os comandos terminam sempre com ponto-e-vírgula e o sinal de =~ está relacionado àutilizaçãodeumaexpressão regular. BOX2 - Principais Sistemas de Gerenciamento de Bancos de dados MySQLhttp://www.mysql.org Acesso livre para download do gerenciador MySQL, como também a várias ferramentasdeconexãocomo:DBI, Java,ODBCeetc.Apresentadocumentação completa. PostgreSQLhttp://www.pgsql.com/ Acesso livre para download do gerenciador PostgreSQL, como também algumas ferramentas. Apresenta documentação completa. ORACLEhttp://www.oracle.com Informações comerciais sobre obancodedados. MicrosoftSQLServerhttp://www.microsoft.com/sql/ Informações comerciais sobre obancodedados. BOX3 - Bancos de Dados mais utilizados em bioinformática Genbankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas. EBIhttp://www.ebi.ac.uk/ Banco de dados europeu de seqüências de DNA. DDBJhttp://www.ddbj.nig.ac.jp/ Banco de dados japonês de seqüências de DNA. PDBhttp://www.rcsb.org/pdb Armazenaestruturas tridimensionais resolvidasdeproteínas. GDBhttp://gdbwww.gdb.org/ Banco de dados oficial do projeto genoma humano. TIGRDatabaseshttp://www.tigr.org/tdb/ Banco com informações de genomas de vários organismos diferentes. PIRhttp://www-nbrf.georgetown.edu/ Bancodeproteínas anotadas. SWISS-PROThttp://www.expasy.ch/spro/ Armazena seqüências de proteínas e suas respectivas características moleculares, anotadomanualmente por uma equipe de especialistas. INTERPROhttp://www.ebi.ac.uk/interpro/ Bancode dados de famílias, domínios e assinaturas de proteínas. KEGGhttp://www.genome.ad.jp/kegg/ Banco comdados de seqüências de genomas de vários organismos diferen- tes e informações relacionadas às suas viasmetabólicas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 15 ou análise. Os principais bancos de dadosprimários sãooGenBank, oEBI (European Bioinformatics Institute), o DDBJ (DNA Data Bank of Japan) e o PDB (Protein Data Bank). Os três primeiros bancos são membros do INSDC (International Nucleotide Se- quenceDatabaseColaboration)ecada umdessescentrospossibilita a submis- são individual de seqüências deDNA. Eles trocam informações entre si diari- amente, de modo que todos os três possuem informações atualizadas de todas as seqüências deDNAdeposita- das em todo o mundo. Apesar disso, cada centro apresenta seus dados de forma particular, apesar de bastante semelhante. Atualmente amaioria das revistas exige que as seqüências iden- tificadaspelos laboratórios sejamsub- metidas a um destes bancos antes mesmodapublicação do artigo. Os bancos de dados secundários, como o PIR (Protein Information Re- source)ouoSWISS-PROT, sãoaqueles que derivam dos primários, ou seja, foram formados usando as informa- ções depositadas nos bancos primári- os. Por exemplo, o SWISS-PROTéumbanco de dados onde as informações sobre seqüências de proteínas foram anotadas e associadas à informações sobrefunção,domíniosfuncionais,pro- teínas homólogas e outros. Os bancos de seqüências também podemser classificados comobancos estruturais ou funcionais. Os bancos estruturais mantêm dados relativos à estrutura de proteínas. Embora a se- qüência de nucleotídeos, a seqüência de aminoácidos e a estruturadeprote- ína sejam formas diferentes de repre- sentar o produto de um dado gene, esses aspectos apresentam informa- ções diferentes e são tratadospor pro- jetos diferentes, que resultamemban- cos específicos. Dos bancos funcionais, o KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) é um dos mais utilizados. Disponibiliza links para mapas meta- bólicos de organismos com genoma completamente ou parcialmente se- qüenciados apartir de seqüências ede busca atravéspalavras-chave. Comocrescentenúmerodedados biológicos que vem sendo gerados, vários bancos de dados têm surgido e anualmente a revista Nucleic Acids Figura 2 Alinhamento de duas seqüências de proteínas Research(http://www3.oup.co.uk/nar/ database/)publicauma listaatualizada comaclassificaçãode todososbancos dedadosbiológicosdisponíveis. Alinhamento de seqüências Oalinhamentode seqüênciaspos- sui uma diversidade de aplicações na bioinformática,sendoconsideradauma dasoperaçõesmais importantes desta área.Estemétododecomparaçãopro- curadeterminarograude similaridade entre duas ou mais seqüências, ou a similaridade entre fragmentos destas seqüências. No caso de mais de duas seqüências oprocesso édenominado alinhamentomúltiplo. É bom lembrar que similaridade e homologia sãoconceitosdiferentes.O alinhamento indica o graude similari- dadeentre seqüências, já a homologia é uma hipótese de cunho evolutivo, e nãopossui gradação: duas seqüências são homólogas caso derivem de um ancestral comumou, casoesta hipóte- se não se comprove, simplesmente nãosãohomólogas. Existemvários programasde com- putador que realizam esta tarefa e a grandemaioria deles pode ser utiliza- do on-line, sem a necessidade de ins- talação. Comoexemplo temosospro- gramas: ClustalW, Multialin, FASTA, BLAST 2 sequences, etc. Oprocesso consiste em introduzir espaços (gaps) entre os monômeros de uma ou mais seqüências a fim de obter omelhor alinhamento possível. A qualidade de um alinhamento é determinada pela soma dos pontos obtidos por cada unidade pareada (match) menos as penalidades pela introdução de gaps e posições não pareadas (mismatch). Matrizesdesubstituição Matrizes de substituição são uma alternativa aos valores fixos depontu- ação paramatches emismatches. Es- Figura 3. Parte de uma matriz de substituição BLOSUM62, utilizada em alinhamentos de seqüências de proteínas. As letras representam os aminoácidos e os números indicam os pontos a serem contabilizados na ocorrência de match (diagonal principal) ou mismatch tas matrizes indicam os diferentes va- lores a seremcontabilizadospara cada par deunidades. Asmatrizesdesubstituiçãosãonor- malmente utilizadas no alinhamento de seqüênciasprotéicas.Assimovalor de cada uma de suas células indica a chance da ocorrência da substituição correspondente ao par de aminoáci- dos destemismatch. As matrizes de substituição mais utilizadas são aquelas pertencentes às famílias de matrizes PAM (Point Ac- ceptedMutation) eBLOSUM.Amatriz PAM1 foi construída atravésda análise demutações entre proteínas homólo- gas com 1% de divergência (1% dos aminoácidos diferentes). As outras matrizes, PAM50, PAM100, PAM250 são extrapolações damatriz PAM1.As matrizes BLOSUM foram construídas tendo como base os alinhamentos do banco demotivos BLOCKS. Umama- triz BLOSUM62 é definida através da análisedas substituiçõesnas seqüênci- as de BLOCKS que possuem menos 16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 que62%de similaridade.As seqüênci- as que ultrapassam este limite são mescladas, e participam da definição da matriz como se fossem uma única seqüência. Alinhamento global e local Quantoàregiãoanalisada,oalinha- mentode seqüênciaspodesergrossei- ramente classificado em dois tipos, o alinhamento global e o alinhamento local. No alinhamento global, as se- qüênciasenvolvidasdevemseralinha- das de um extremo ao outro, dando origem a apenas um resultado. Já no alinhamento local, procura-se alinhar apenas as regiões mais conservadas, independente da localização relativa decada regiãoemsuaseqüência.Con- sequentemente, este alinhamento tem como resultado uma ou mais regiões conservadas entre as seqüências. Oalinhamento global é freqüente- mente utilizado para determinar regi- ões mais conservadas de seqüências homólogas. Exemplo de programas queutilizamestealinhamentosãoClus- talWeMultialin.Oalinhamento local é geralmente utilizado na procura por seqüências homólogas ou análogas (funcionalmente semelhantes) em bancodedados.Oalgoritmoutilizado pelo programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) realiza este tipode alinhamento. Figura 4: Exemplos de alinhamento global e local. No alinhamento global as seqüências são alinhadas do início ao fim, já no alinhamento local alinha-se as subseqüências conservadas BOX4-Softwaresmaisutilizadosparaoalinhamentodeseqüências ClustalWhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html Versãowebdeumdosprogramasde alinhamentomúltiplomais utilizados (Clustal). Fornece ao usuário uma grande quantidade de parâmetros e de saídas diferentes. Possui interface gráfica ondeos alinhamentospodemser visualizados de forma agradável e alterados. Multialinhttp://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html Programade alinhamentomúltiplo bastante conhecido. Fácil e rápido. Fastahttp://www.ebi.ac.uk/fasta33/ Precursor dosprogramasdealinhamento. Promove serviço de busca em banco de dados de ácidos nucléicos e proteínas. BLAST,BLAST2sequenceshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ BLAST é o programa de alinhamento mais utilizado no mundo. Realiza a buscapor seqüências homólogas embancodedadosde ácidosnucléicos e proteínas.OprogramaBLAST2sequencesconsistenoalgoritmoBLASTpara alinhamentodeduas seqüências. Projetos genoma e transcriptoma Grande parte dos bioinformatas modernos trabalha comdadosdepro- jetos genoma ou transcriptoma. Em projetos genoma adota-se a aborda- gemde fragmentar todo o genoma de umorganismoempequenos pedaços e de seqüenciar tais pedaços, utilizan- do programas computacionais para montá-los e reconstituir a informação genômica inicial. Essaestratégiaéado- tadaprincipalmentedevidoà restrição do tamanho da seqüência que pode ser lidanos seqüenciadores.Mesmoos maismodernos conseguem ler apenas cerca de 1000 pares de base em cada corrida. Emprojetos genomasdeprocario- tos, normalmente realiza-se a quebra doDNAinteirodoorganismodesejado em fragmentos pequenos (através da técnica de shotgun) que são clonados em vetores plasmidiais que serão se- qüenciados em suas extremidades. Após uma primeira etapa de monta- gemdesse genoma, fragmentosmaio- res são clonados em cosmídeos e se- qüenciados. Essa segunda etapa é im- portantepara amontagemdogenoma completo do organismo, já que a pri- meira normalmente produz uma se- qüência incompleta, apresentandoal- guns buracos de seqüência (gaps). Já em projetos genomas de orga- nismos eucariotos, que possuem fre- qüentemente uma enorme quantida- de de DNA, normalmente prefere-se adotar uma técnica conhecida como shotgun hierárquico. Nessa técnica, o DNA inteiro doorganismoéprimeira- mente inserido emgrandes vetores de clonagem,comocromossomosartifici- ais de bactérias (BACs) ou de levedu- ras (YACs). Depois então é realizado um shotgun desses grandes fragmen- tos dos vetores, gerando fragmentos menores que são agora clonados em vetores plasmidiais para o sequencia- mento. Portanto, tais projetos consis- tem de duas etapas, a montagem decada um dos grandes fragmentos clo- nadosnosBACseYACseamontagem final que reunirá as seqüências com- pletas dos BACs e YACs montados para a reconstituição da informação genômica inicial. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 17 Figura 5. a) Na estratégia de shotgun, todo o DNA genômico de um organismo é fragmentado em pequenos pedaços (1), que são clonados em vetores de pequeno porte, como plasmídeos, para o posterior se- qüenciamento. b) Na estratégia de shotgun hierárquico, normalmente utilizada para grandes genomas, realizam-se dois passos. (1) Primei- ramente fragmenta-se o genoma em grandes pedaços, que são clona- dos em vetores de grande porte, como BACs ou YACs. (2) Posterior- mente realiza-se uma segunda etapa de shotgun, onde as seqüências contidas nesses vetores são fragmentadas em pequenos pedaços e clo- nadas em vetores de pequeno porte, que serão sequenciados Muitas vezes, ao invés de ser reali- zado o seqüenciamento genômico de um organismo eucarioto, prefere-se realizar o seqüenciamento sódas regi- ões gênicas, utilizando informações oriundasdeRNAmensageiro (mRNA). Dessa formaérealizadaumabiblioteca de cDNA, representando o conjunto de mRNAs de uma célula, que são clonados em vetores plasmidiais. Os insertos de cDNA presentes em tais vetores são então seqüenciados apar- tir de suas extremidades 5 ou 3, produzindopequenas seqüênciasque irão representar pedaços dos genes expressosnomomentodaextraçãodo mRNA da célula em questão. Esses pedaços seqüenciados representam etiquetas degenes expressos, ouESTs (ExpressedSequenceTags) e umaaná- lise dos genes expressos é uma abor- dagem bastante utilizada na tentativa de entender o funcionamento dome- tabolismo dos mais diversos organis- mos.Comoexemplo,noBrasil aborda- gens transcriptômicas já foramutiliza- dasem largaescalanoprojetodacana- de-açúcar e vêm sendo utilizados em organismos parasitas, como é o caso dos projetos de seqüenciamento de ESTs de SchistosomamansoniemSão Paulo e emMinas Gerais. Como já foi mencionado anterior- mente, normalmente adota-se a estra- tégia de seqüenciamento genômico em organismos cujo genoma é peque- no e que contém baixa quantidade de seqüências repetitivas. Entretanto, a estratégia de seqüenciamentodo trans- criptoma, ouaproduçãodeESTs, nãoé utilizada apenas quando o genoma do organismoémuitogrande.Essaestraté- gia é importante tambémparaestudaro desenvolvimentodosorganismos, pro- duzindobibliotecas de diferentes fases dedesenvolvimentoeobservandoquais genes são expressos em cada momen- to. Tal abordagem tambémé importan- te para estudarmos como ocorre a ex- pressão diferencial de genes em dife- rentesórgãosdeummesmoorganismo, para que possamos entender a função desses órgãos ou como eles realizam funçõesconhecidas. Portantopodemos dizer que as estratégias de seqüencia- mento de genomas e transcriptomas são complementares e ambas devem ser realizadas, quando possível, para que possamos obter informações rele- vantes sobre os organismos que esta- mosestudando. Base calling Os dados brutos provenientes do seqüenciadordeDNAsãonormalmente submetidos diretamente a algum pro- grama de base calling. O base calling consiste no processo de leitura dos da- dos do seqüenciador e identificaçãoda seqüência de DNA gerada, atribuindo ainda um valor de qualidade para cada posição nucleotídica identificada. Nor- malmente cada seqüenciador apresenta umprogramadebasecallingassociado. Entretanto, o programa mais utilizado nessa etapa é o PHRED. O PHRED reconhece dados de se- qüências a partir de arquivos SCF (Stan- dard Chomatogram Format), arquivos decromatogramadosanalisadoresauto- máticosdeDNAABIearquivosMegaBA- CE ESD. Este software reconhece a se- qüência de nucleotídeos a partir do ar- quivodedadosbrutosdo seqüenciador, atribui valores de qualidade às bases constituintesdaseqüêncianucleotídicae gera arquivos de saída contendo infor- mações sobre o basecall eos valores de qualidade.O valor de qualidade das se- qüênciasanalisadaspodeserencontrado nos arquivos FASTA e PHD. De acordo comEwing etal (1998) as atribuiçõessegurasdevaloresàs seqüên- cias nucleotídicas são proporcionadas pela implantação de um algoritmo que tem como base os métodos de Análise deFourier.Oalgoritmoanalisa asquatro bases e prediz a provável região central dospicoseasdistâncias relativasentreos picos da seqüência de DNA. O valor de qualidadeatribuídoacadabaseéobtido pela fórmula a seguir, que calcula a probabilidadedeerronobasecall, onde oPeéaprobabilidadedeumabaseestar errada. PHRED Quality = -10 log (Pe) Aspontuações inseridasnosarquivos de saída do PHRED representam a pro- babilidade logarítmicanegativaemesca- la de erro de um base call; portanto, quanto maior o valor de qualidade do PHRED, menor a probabilidade de ter ocorridoumerro. Sócomoexemplo,um valordePHRED20paraumadetermina- daposiçãonucleotídica significaqueela apresenta uma chance em 100 de estar errada. Já um valor de PHRED 30 signi- fica que determinada base apresenta uma chance em 1000 de ter havido um erro no base calling. Esses valores são importantes para determinar se uma re- giãoprecisa ser resseqüenciada. Mascaramento de vetores A estratégia freqüentemente adota- da após a realização do base calling é a 18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 procurapor regiõesde contaminantes na seqüênciaproduzida. Regiões con- taminantes são partes da seqüência obtidaquenão representamoDNAou o cDNA que se deseja analisar. Tais regiões representam, normalmente, partes dos vetores de clonagem onde as seqüências de interesse foram inse- ridasoupedaçosdeDNAadaptadores utilizados durante a construção das bibliotecas. Como essas regiões não representam as seqüências que se deseja analisar, elas devem ser retira- dasoumascaradasporumprograma.E aqui, o programa mais utilizado é o Cross_match. Esse é, na verdade, um programapara a comparação de duas seqüências e é preciso utilizar como entrada um arquivo apresentando a seqüência dos vetores que se deseja mascarar. O que o Cross_match faz é comparar a seqüência desejada como arquivo de seqüências de vetores e, ondeoprogramaencontrar similarida- deentreas seqüências, ele irámascarar (acrescentando letras X) a seqüência deentrada.Assim,osnucleotídeosdas seqüênciasdeentrada similares a regi- ões de vetores de clonagem serão alteradosparaXenão atrapalharãoos processosposteriores de análise com- putacional. Agrupamento de seqüências Após a geração de arquivos sem contaminantes, contendoa identifica- çãodasbaseseaqualidade, todasessas informações são repassadas a um sof- twaredemontagemcomooPHRAP,o CAP3ouoTIGRAssembler.O softwa- remaisutilizadonessaetapa,oPHRAP (Phragment Assembly Program) é o programa responsável pela leitura das informações do basecall emontagem dos pequenos fragmentos de DNA seqüenciadosemseqüênciasmaiores, os contíguos (contigs). Este programa possui diversos pontos chaves para a obtençãoderesultado final satisfatório, como: construção de seqüência do contíguo através de um mosaico de partes das seqüências com alta quali- dade; utilização de informações da qualidade dos dados computados in- ternamente e de implementações fei- tas pelos usuários para aumentar a qualidadedamontagem;apresentaex- tensivas informações sobre a monta- gem realizada (incluindo valores de qualidadesparaa seqüênciadoscontí- guos). Emprojetos genomaespera-se obter, na saídadoPHRAP, a seqüência montadadocontíguogenômico. Jáem projetos trancriptoma esperamos ob- ter as seqüências de cada dos genes expressos após a execução deste sof- tware de montagem. Avisualizaçãoeediçãodasseqüên- cias geradas após a montagem são realizadas normalmente através do programaPhrapviewouConsed. Figura 6: Interface do programa Consed BOX5-Programasmaisutilizadosemprojetosgenomaetranscriptoma PHREDhttp://www.phrap.orgSoftware para a realização do base calling e a produção do cromatograma processado. CROSS-MATCHhttp://www.phrap.org Software para a comparação entre duas seqüências de DNA. Normalmente utilizadopara omascaramentode regiões representando vetores em seqüên- cias genômicas ou de cDNA. Distribuído juntamente com o PHRAP. PHRAPhttp://www.phrap.org Software mais utilizado para a realização do agrupamento de seqüências (clustering analysis) e montagem de contíguos genômicos. CAP3http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.html Software utilizado para o agrupamento de seqüências e montagem de contíguos genômicos. Utiliza umalgoritmodiferente doPHRAP. CONSEDhttp://www.phrap.org Softwaremaisutilizadoparaavisualizaçãodos resultadosobtidospor softwares deagrupamentodeseqüências.Permiteaediçãodasbases seqüenciadas, além dediversos outros recursos. O processo de anotação gênica Uma vez obtidos os dados do seqüenciamento dasmoléculas deDNA é preciso saber o que representa cada umadas seqüênciasnucleotídicasprodu- zidas.Aanotaçãoconsiste simplesmente no processo de identificação dessas se- qüências. Emprojetos genoma, estepro- cesso normalmente é realizado em três etapas: anotação de seqüências de nucleotídeos, de seqüências protéicas e deprocessosbiológicos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 19 Figura 7: Etapas da anotação em projetos genoma e as perguntas que se deseja responder em cada uma delas Apartir da anotaçãode seqüências nucleotídicasprocura-se,primeiramen- te, identificar anaturezadeumadeter- minada seqüência. Devemos desco- brir se tal seqüência está inserida em uma região gênica, se representa uma molécula de RNA transportador ou RNAribossômico, sepertenceaalgum tipo de região repetitiva já descrita ou seapresenta algummarcadorgenético conhecidoemseu interior.Oprincipal objetivo dessa etapa é construir um mapadogenomadoorganismo, posi- cionandocadaumdospossíveisgenes e caracterizando as regiões não-gêni- cas. Nesta fase, alguns programas de predição gênica são usados para a localização depossíveis genes nas se- qüências de DNA. A procura por ele- mentos comoocódonde iniciaçãode proteínas (a trinca de nucleotídeos ATG)e códonsde terminaçãonames- ma fase de leitura são utilizados por alguns desses programas. O tamanho delimitado por esta janela de leitura é freqüentemente utilizadopara definir uma determinada região como sendo gênica ou não. Alguns outros progra- mas sãocapazesde identificar, depen- dendo do genoma analisado, regiões gênicas codificadoras (éxons) e não codificadoras (íntrons). Alguns exem- plos são oGenomeScan e oGenScan. Em projetos de trancriptômica, onde se utiliza a abordagem de seqüencia- mento de ESTs, essa etapa não é realizada, uma vez que todas as se- qüências produzidas se restringem a regiões gênicas. Mapeados os genes, a etapa se- guinte consiste em identificar quais proteínas são codificadas, enisso con- siste o processo de anotação das se- qüências protéicas. Nessa etapa, pro- cura-semontarumcatálogodosgenes presentesnoorganismoestudado,dan- do-lhes nomes e associando-os a pro- váveis funções. No caso de projetos genoma, deseja-se identificar onúme- ro total degenespresentesnoorganis- mo seqüenciado, já que há informação da seqüência de DNA de todo o geno- ma. Já em projetos transcriptoma, a tarefa consiste em identificar os genes expressosnoorganismoemumadeter- minada condição. Apesar de não ser capaz de identificar todos os genes de umdeterminadoorganismo,osprojetos de transcriptômica podem permitir a identificação de genes expressos em diferentes tecidos e fases de desenvol- vimento, alémdepermitir a observação daqueles que apresentam variantes de splicing. Portanto,nessaetapadaanota- ção, o principal objetivo é identificar e caracterizar cadaumadasproteínas co- dificadas pelos mRNAs presentes no organismo estudado em determinada condição. A parte mais interessante e desafia- dora dosprocessos de anotaçãogênica é relacionar, finalmente, a genômica comos processos biológicos, e essa é a etapadeanotaçãodosprocessosbioló- gicos. Essa etapa é comum a projetos genomae transcriptoma. Identificados os genes, devemos agora tentar relaci- oná-losdemodoaobtermosummapa funcionaldoorganismoestudado.Nes- se pontodeve-se identificar quais vias bioquímicas estão completas ou in- completas no organismo e quais vias alternativas ele possui. Aqui é funda- mental a participação de biólogos es- pecialistas emdiversas áreas para que se possa descobrir como ometabolis- modoorganismopode influenciar seu modo de vida e seu comportamento. Esse é o momento onde é possível levantar várias hipóteses que relacio- nemo funcionamentodosorganismos comseusdadosgenômicos.Taishipó- teses devem ser testadas experimen- talmente, por pesquisadores que tra- balhemcomoorganismoestudado. Como é realizada a anotação Até aqui foi mostrado o que é normalmente feito em um processo de anotação gênica. Vejamos agora como tal processoé realizado. Lincoln Steindefiniumuitobemcomoaconte- ce a sociologia dos projetos de anota- ção gênica. Ele dividiu o processo de anotação de genomas em três etapas: a fábrica, o museu e a festa. BOX6 Principais softwares utilizados durante a anotação gênica RepeatMaskerhttp://repeatmasker.genome.washington.edu/ Utilizado para a identificação e omascaramento de regiões repetitivas freqüentemente encontradas em genomas. Genscanhttp://genes.mit.edu/GENSCAN.html Utilizado para a predição de genes em genomas eucarióticos. Seu método de predição é baseado em cadeias escondidas deMarkov. tRNAscan-SEhttp://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE/ Utilizado para encontrar genes de tRNA em uma seqüência genômica. BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Utilizadopara encontrar similaridades entre seqüências denucleotídeos e proteínas contra bancos de dados com grande número de seqüências dos mais diversos organismos. É umdosprincipais programas utilizados na identificaçãodos genes. Interprohttp://www.ebi.ac.uk/interpro Utilizadopara realizar buscas contra diferentes bancos dedados dedomínios e famílias de proteínas. Integra os serviços do Pfam, PRINTS, ProDom, PROSITE, SMART, TIGRFAMs e SWISS-PROT. GeneOntologyhttp://www.geneontology.org Consórcio destinado a produzir umvocabulário comuma ser aplicado para a classificação dos genes presentes em organismos eucarióticos. Cada gene é classificado em três níveis: funçãomolecular, processos celulares e localizaçãocelular. 20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Na primeira etapa trabalham ape- nas as ferramentas de bioinformática, funcionando em larga escala, como umafábrica.Assim,as seqüênciasobti- daspassamporumagrandediversida- dedeprogramas,quedevemajudaros anotadoresa identificá-laseagrupá-las para a próxima fase. A segunda etapa necessita de es- pecialistas que observem os dados obtidos na primeira etapa pelas ferra- mentas automáticas eque, comocura- dores de um museu, identifiquem as seqüências de acordo com critérios pré-definidos. Após a identificação dos genes, é feita a anotação dos processos. Nesse momento deve-se promover a intera- ção entre vários anotadores, bioinfor- matas ebiólogosespecialistas emdife- rentes áreas enoorganismoestudado. Nessa festa deve-se discutir como as informaçõesobtidasnas etapas anteri- ores podem estar relacionadas com a biologia doorganismoemquestão. A era pós-genômica Umadas característicasmais fasci- nantes da explosão, ocorrida nos últi- mos 10 anos, de projetos e consórcios destinados a compor o genoma com- pletodosmaisdiversosorganismos, foi o estabelecimento de abordagens e tecnologias que permitiram um estilo linha-de-montagemnaobtenção,em temposcadavezmais curtos, dequan- tidades industriais de seqüências de ácidos nucleicos (DNAeRNA). Agora começamosaenfrentaroproblemade interpretar e adicionar significado a essas seqüências. Temos agoraque, a partir dos bancos dedados existentes, processarecorrelacionarosdadosbru- tos transformando-oseminformaçãoe apartir desta informaçãogerar conhe- cimento, que é a informação testada experimentalmente.Nofinal, estanova etapa promete ser uma jornada, pro- vavelmente sem fim, através das pro- teínas, suas estruturas e funções, vias metabólicase interaçõescelulares.Esta mudança do foco de atenção, dos áci- dos nucleicos para as proteínas, tem sido utilizada para batizar esta nova etapa da pesquisa biológica em larga escalacomoEraPós-Genômica.Con- tudo, trata-se apenas de mais uma etapa e, certamente, não aúltimapara que os frutos dos programas de se- qüenciamento de genomas possam ser colhidos. Etapas estas que foram previstas pelo Projeto do Genoma Humano. Das cinco metas a serem atingidas, o estudo da expressão de proteínas e a obtenção de mapas de interaçãoproteína-proteínaocupamo segundoe terceiro estágios, dos quais seesperaomaior impactoeconômico, levandoàdescoberta denovasdrogas e reduzindo o seu tempo de entrada nomercado. Resumidamente,naEraPós-Genô- mica procura-se estudar a expressão dos genes codificados pelo genoma dos organismos, tecidos, células ou compartimentos celulares em deter- minadas condições fisiológicas (por exemplo, uma doença, uma situação de estresse ou ainda a administração de uma droga). Tentando entender a resposta a essas condições, são alvos deestudos: a ativaçãoou repressãode determinados genes, a indução de mudanças no estado pós-traducional dasproteínasequalquerprocessoque resulte na modificação do número e/ ou da composição das proteínas exis- tentes. Análise da Expressão Gênica Lembrando do dogma central da biologia (DNA→mRNA→Proteína), é facil perceberquepodemosavaliar a expressãogênica atravésdaanálisede transcritos (mRNA). Emorganismoseucariotos, a facili- dadede isolamentodosmRNAs (usan- dooligonucleotídeospoli-T para cap- turar os mRNAs pela cauda poli-A), a possibilidadeda transcrição reversado mRNA para cDNA (usando a técnica de RT-PCR) e o domínio das técnicas de seqüenciamento emmassa de cD- NAs tornarampossível a análise quali- tativa e quantitativa, em larga escala, dos genes transcritos em organismos, tecidos e células. Desta forma, nos projetos Transcriptoma, como já co- mentado, é feito o seqüenciamento parcial de cDNAs representativos da população de mRNA de maneira a permitir a identificação de diferentes transcritos (pela comparação das se- qüências do cDNA) e sua abundância na população (pelo número de vezes em que cada transcrito é seqüencia- do). As técnicasmais usadas são as de ESTs e SAGE (Serial Analysis of Gene Expression).Nestaúltima técnica,mais recente, são gerados e seqüenciados concatâmeros de fragmentos de cD- NAs com apenas 10 ou 17 nucleotíde- os de cada mensageiro, respectiva- mentedenominadosSAGEtagseSAGE long tags. DNA chips e Microarrays Uma outra forma de análise de transcritos, que permite a busca de transcritos de genes específicos na populaçãodosmRNAsexpressos, usa o já conhecidoprincípiodahibridação deDNAasondasmoleculares.Asmais novas versões da técnica são os DNA chips eosmicroarrays, quepermitem a análise simultânea da expressão de milhares de genes. Nestas duas técni- cas, respectivamente,oligonucleotíde- osou fragmentosdecDNAconhecidos são ligados a uma lâmina de vidro e, em cada experimento de hibridação, osmRNAsdedois tipos celulares dife- rentes ou de células em duas condi- ções patológicas ou tratamentos são analisados. As duas populações de mRNAs são amplificadas e marcadas comdiferentes corantes fluorescentes (cianinas ou Cys), um verde e outro vermelho. Ao hibridarem com cada gene (oligo ou cDNA) aplicado sobre a lâmina de vidro, a cor verde ou vermelha de cada ponto (ou spot) indicaráqueessegeneestá sendomais transcrito em um tipo ou condição celular doquenooutro. A cor amarela indicará que o gene é transcrito igual- mente em ambos os tipos ou condi- ções celulares. Alémdisso, amaior ou menor intensidadedecadacor indicará maioroumenornível deexpressãodo gene. A enorme quantidade de dados geradanosexperimentosdeDNAchips emicroarrays são analisados por sof- twares específicos que envolvem métodosde inferência estatística.Uma etapa bastante importante na fase de análise dos resultados é a que chama- mos de normalização. Usando como referência os spots de genes controles (sabidamente expressos ou reprimi- dosnos tecidosoucélulas estudados), o que se busca é, basicamente, retirar dosvaloresdecada spota influênciade Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 21 manchas espúrias (background) e de variações do processo de hibridação. Desta forma, apósanormalização, tor- na-se possível a comparação de spots de uma mesma lâmina ou de experi- mentosdiferentes. Emumaetapapos- terior, programasde clusteringprocu- ram identificar e agrupar os spots su- per-expressos, reprimidosouquenão temexpressão alteradanos tecidos ou célulasanalisadas.Apesardosmétodos de análise empregados, a falta de re- produtibilidadedos resultados aindaé umaqueixabastantecomum.Ousode maior númerode réplicas de cada spot e/ouabuscademétodosde inferência estatística mais adequados parecem ser úteis para a validaçãodestes resul- tados. Mais recentemente, comnovas téc- nicas para isolamento de mRNA de procariotos, projetos de ESTs e de microarray também têm sido desen- volvidosparaestesorganismos.Vários grupos de pesquisa em todo o Brasil estão iniciando projetos nesta área. Apenas como exemplo, entre os vári- osprojetosbrasileirosnestaárea temos o projeto Cooperation for Analysis of Gene Expression (CAGE) (http:// bioinfo.iq.usp.br/ehttp://www.vision. ime.usp.br/~cage/) e oProjetoGeno- ma Raízes da Embrapa Soja (http:// www.cnpab.embrapa.br/pesquisas/ gp.html). Projetos Proteoma Um problema que surge com a abordagem descrita acima, de avalia- ção da expressão gênica a partir da análise dos mRNAs transcritos, é que nemsempreaquantidadedeummRNA reflete a quantidade da proteína cor- respondente expressa na célula e, as- sim, não podemos relacionar direta- mente essa proteína a uma funçãonas células.Por isto,umaoutraabordagem, embora muito mais trabalhosa, tem sido usada para avaliar a expressão gênica: a análisedasproteínas expres- sas. Esta contrapartida protéica do genomaéconhecida comoproteoma. Por permitir relacionar diretamente a umaproteínadeterminada função,esta abordagem constitui um instrumento particularmente poderoso para eluci- darosmecanismoscelulares relaciona- BOX7 Exemplos de Projetos Transcriptoma: Procuram avaliar quais são os genes expressos, e quanto deles é expresso, a partir do seqüenciamento parcial dosmRNAs transcritos. Dadosobtidospela técnicadeSAGEpodemser consultadosnapáginahttp:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/. JánobancodbESTestãodepositadasESTs dediversosProjetosTranscriptomadesenvolvidos em todoomundo (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/). Mais informações sobre DNA Chips eMicroarrays Nestas técnicas, a verificação da expressão de genes específicos é feita em experimentos de hibridação em lâminas de vidro contendo milhares de fragmentos de DNA. Na página http://cmgm.stanford.edu/pbrown/, do pioneiro da técnica de microarray,Dr. PatrickBrown,hámais explicações, um forumdediscussão e bancos de dados demicroarrays. Na página http://ihome.cuhk.edu.hk/ ~b400559/array.html há informações sobre os equipamentes necessários, uma tabeladecomparaçãodosprogramasdeanálisemaisusados,noçõesde estatística aplicadas amicroarrays, sugestões de bibliografia, etc. Programa gratuíto para análise demicroarrays ScanAlyse: escrito porMichael Eisen, o programa pode ser obtido gratuita- mente napágina http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm.Assinandoum ter- mo de compromisso, o autor permite, inclusive, o acesso ao código-fonte. dos ao desenvolvimento de doenças, ao mecanismo de funcionamento decompostos químicos (por exemplo, fármacos) e identificar novos alvos terapeuticos. As bases experimentais daproteô- mica não são novas e pertencem ao arsenal clássico da bioquímica, mas houve, nos últimos anos, um salto qualitativo e quantitativo sem prece- dentes.Esse salto foi resultadodegran- des investimentos privados na busca de abordagensmais agressivas e rápi- das no isolamento, identificação e ca- racterização de proteínas, no mesmo estilo industrial que caracterizou a era genômica.O isolamentodeprote- ínas em grande número, inicialmente repousavanas técnicaseletroforéticas, comoaeletroforesemonoebi-dimen- sional em géis de poliacrilamida. Em- bora tais técnicas certamente sempre venhama ter umpapel importante em qualquer laboratório de proteômica, nota-se hoje uma tendência cada vez maior nousoda cromatografia líquida dealtaeficiência, comousodecolunas capilares, no desempenho desta tare- fa.A identificaçãoecaracterizaçãodas proteínasdependedeumconjuntode tecnologias (com certeza as que mais sofreram incrementonodesempenho) envolvendo a espectrometria de mas- sa, a ressonância magnética nuclear, alémde recursos computacionais para aarmazenagem,análise e compartilha- mento dos diversos tipos de dados geradosporestas tecnologias (imagens degéisbidimensionais, sequênciaspro- téicas, estruturas protéicas, espectros de massa, etc.). Nos últimos anos a espectrometria demassa, emconjunto comacromato- grafia líquidadealtaperformance, vem se tornando a abordagem preferida para identificarecaracterizarproteínas, devido essencialmente a três motivos. O primeiro é o desenvolvimento de novosmétodospara ionizaçãodepro- teínas e peptídeos, especialmente o MALDI e o ESI (Matrix-Assisted Laser Dessorption-IonizationeElectroSpray Ionization). O segundo é o desenvol- vimentode recursosdabioinformática, permitindo a análise de dados obtidos por espectrometria demassas emban- cos genômicos ede sequências protéi- cas. Eo terceiro éque a espectrometria demassas fornece informaçãodetalha- da de modificações pós-traducionais, emparticular as fosforilações e glicosi- lações. 22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 BOX8 MALDI e ESI MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Umaamostra deproteína oupeptídeo émisturada comum largo excesso de umamatriz, formadaporumasubstânciaqueabsorvenoultra-violeta, eposta para secar. Um laser comumcomprimento de onda que seja absorvido pela matriz, em um compartimento sob vácuo, incide sobre a amostra seca e fragmentos ionizadosda amostra são carreadospela vaporizaçãodamatriz e capturados por um campo elétrico do analisador demassas. ESI - ElectroSpray Ionization Umvoltagemaplicada emuma fina agulha contendo uma solução protéica, gera uma névoa de pequenas gotículas da solução, contendo pequeno número de moléculas protéicas. A redução das gotículas por evaporação acaba colocando em fase gasosa as proteínas ionizadas. Elas são então capturadas pelo analisador de massas. A grande vantagem desta técnica é permitir oacoplamentodiretodeumsistemacromatográficodealtaeficiência ao espectrômetro demassas, possibilitando a análise em fluxo contínuo de misturas protéicas complexas. No Brasil, apenas agora começa- mos a montar grupos de pesquisa nesta área. Merecem destaque as re- desdeproteômicaemSãoPaulo, sedi- ada no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (http://www.lnls.br/), eno Riode Janeiro (http://www.faperj.br/ interna. phtml?obj_id=219). As técnicas experimentais expos- tas acima, alémdeofereceremrespos- tas à curiosidadehumana, constituem formas inovadoras napesquisa para o combate de problemas globais como diabetes, câncer, hemofilia, etc... Na prática, independentemente do nú- BOX9 - Links interessantes Eletroforese bi-dimensional em géis de poliacrilamida (PAGE-2D) http://us.expasy.org/ch2d/protocols/ http://www.aber.ac.uk/parasitology/Proteome/Tut_2D.html Cromatografia líquida de alta eficiência, com o uso de colunas capilares (HPLC) http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm http://www.ionsource.com/tutorial/capillary/introduction.htm Espectrometria deMassas (MS) http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/ms/ms.htm Software gratuíto para análise de PAGE-2D - Melanie DesenvolvidonoSwissProt, estádisponíveldiretamentenapáginadoSwiss Prot, http://www.expasy.org/ ou num link na página http:// www.science.gmu.edu/ ~ntongvic/Bioinformatics/software.html, que dá acesso amuitos outros programas debioinformática. mero de proteínas codificadas pelo genoma da espécie humana (o que ainda hoje é discutido), é previsível que em alguns anos possamos co- nhecer de 4000 a 10000 proteínas- alvo, sobre as quais medicamentos poderão agir. Para termos uma idéia da grandeza destes números, todo o arsenal terapêuticoqueconhecemos hoje atua sobre apenas 500 delas. O número de drogas disponíveis hoje nosEUA,derivadasdestasnovas tec- nologias, chegoua103noanopassa- do (21 delas foram aprovadas em 2000). Modelagemmolecular Aindaneste sentido, procurando associar proteínas a suas funções, a bioinformáticapodeedeverá trazer, nas próximasdécadas, suasmaiores contribuições àbiologia.Oconheci- mento da estrutura terciária de uma proteína constitui uma informação valiosa para determinação de sua função,poispodepermitir a identifi- caçãodedomíniosconhecidos,como sítios catalíticos, sítios de modifica- ção alostérica e outros. Além disso, tendo as estruturas tridimensionais das proteínas deter- minadas, podemos então realizar pesquisasmais direcionadasno sen- tidodeencontrar inibidores, ativado- res enzimáticos eoutros ligantesque permitam a produção de fármacos mais eficientes eespecíficos: o alme- jado Desenvolvimento Racional de Fármacos (RationalDrugDesign). Atualmente a abordagem mais eficaznadeterminarçãodaestrutura terciáriadeproteínaséaquelaque se utiliza de técnicas experimentais comoNMR (RessonânciaMagnética Nuclear) e cristalografiapordifração de raios-X. Dezenas de milhares de protéinas tiveramsuasestruturas ter- ciáriasconhecidasatravésdestesmé- todos e têm fornecido dados para o desenvolvimento de programas de modelagem e para a modelagem por homologia. Entretanto osméto- dos experimentais são, frequente- mente,procedimentosdispendiosos e de difícil execução. Além disso, existem limitações técnicas quedifi- cultamadeterminaçãodeváriaspro- teínas. A obtenção de cada proteína pura é um desses fatores limitantes. Outro fator é a dificuldade de crista- lizaçãodasproteínas, etapanecessá- ria para a determinaçãode estrutura por difração de raios-X. Este é um problema comum em proteínas de membrana ou glicosiladas. Mesmo usandorobôsparaaceleraroproces- so experimental, estas e outras difi- culdades fazem com que a determi- nação de novas estruturas protéicas nãoconsigaacompanhar avelocida- de de obtenção de dados dos proje- tos genoma. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 23 Figura 8: Estrutura terciária e quaternária daDeoxi- hemoglobinahumanaobtida por Difração de Raios X e depositada no PDB. A molécula é um tetrâmero, composta por 4 cadeias, e ligada a 4 átomos de ferro A modelagem molecular é um método alternativo, não experimental, que permite, com base nos conheci- mentos da estereoquímica dos amino- ácidos e nas informaçoes adquiridas das estruturas terciárias já resolvidas, prever a conformação de proteínas a partir da seqüência primária dos ami- noácidos. Uma das formas de se realizar a modelagem de proteínas é utilizar como referência uma ou mais protéi- nas homólogas e de estrutura terciária já conhecida. Este tipo de modelagem é conhecido como modelagem por homologia ou modelagem comparati- va, e, por enquanto, é a abordagem que obtém melhores resultados. O primeiro passo do processo é a pequi- sa de proteínas homólogas em bancos de dados de estruturas terciárias de proteínas. O PDB (ProteinDatabase Bank) é o mais utilizado para este fim. A seguir, deve ser realizado o alinha- mento das seqüências de aminoácidos das protéinas homólogas e a proteína- alvo (o programa Clustal, citado ante- riormente no artigo, pode ser usado). A modelagem, propriamente dita, é rea- lizada através de softwares como o Modeller, SWISS-MODEL, 3D-PSSM, dentre outros. Esses programas nor- malmente procuram encontrar a estru- tura terciária que melhor se aproxime da disposição dos átomos das proteí- nas utilizadas comomodelo, e aomes- mo tempo atenda às restrições este- reoquímicas. Após a definição de uma estrutura candidada, esta pode ser ava- liada através de outros softwares de verificação de restrições estereoquími- cas, como o programa Procheck. A modelagem por homologia é um processo iterativo de ajuste de parâ- metros e verificação dos resultados. Normalmente é necessário que o pro- cesso seja repetido várias vezes até que uma estrutura terciária adequada seja obtida. Além disso, a modelagem de proteínas, como um todo, é uma técnica heurística: mesmo que a estru- tura obtida concorde perfeitamente com todas as restrições impostas, não há garantias de que esteja correta. Deve-se lembrar que uma estrutura bastante semelhante à real pode ser o suficiente para formulação de novas hipóteses e atingir as expectativas do usuário desta técnica. Uma abordagem recente, que pos- sui um crescente números de adeptos e acumula bons resultados, é a mode- lagem através de threading de prote- ína. Esta técnica é baseada na compa- ração da proteína em questão com modelos descritivos dos enovelamen- tos de proteínas homólogas. Nesses modelos sãodescritas: a distância entre os resíduosde aminoácidos, a estrutura secundária de cada fragmento e as características fisico-químicas de cada resíduo. Entretanto, um grande desejo dos que trabalham com proteínas é o de- senvolvimento deprogramas realmen- te eficientes para a modelagem ab initio, ou seja, que sejam capazes de predizer a estrutura terciária de uma proteína, tendo como informação ape- nas a seqüênciados resíduosdeamino- ácidos e suas interações fisico-quími- cas, entre si e com o meio. Programas assim existem hoje mas têm muito a melhorar para que possamos confiar unicamente no seu resultado. No geral, a modelagem de proteí- nas através de programas de computa- dor é um campo de pesquisa recente e aindanãogerou softwares de eficiên- cia comprovada. Para estimular o de- senvolvimento de programas de mo- lelagem molecular de proteínas, foi criado um evento para a avaliação desses softwares denominado CASP (Critical Assesment of Structural Pre- diction). A cada dois anos este evento reúneosmais conhecidos pesquisado- res desta área, que são desafiados e suas diferentes metodologias avalia- BOX10 Programas e sites relacionados commodelagem e estrutu- ras de proteínas PDBhttp://www.rcsb.org/pdb/ Mais famoso e completo banco de dados de estrutura de proteínas. Proteinexplorerhttp://molvis.sdsc.edu/protexpl/ Programaderivado doRasMol para a visualização de estruturas de proteínas. SWISS-PDBviewerhttp://www.expasy.org/spdbv/ Programa para a visualização e análise da estrutura de várias proteínas ao mesmo tempo. Permite a realização de mutações de aminoácidos, altera- ções em pontes de hidrogênio, ângulos de torção e distâncias entre átomos. Modellerhttp://guitar.rockefeller.edu/modeller Um dos programas mais utilizados para a modelagem de proteínas por homologia. SWISS-MODELhttp://www.expasy.org/swissmod Programa via web para a modelagem de proteínas por homologia. PROCHECKhttp://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html Programa que checa a qualidade estereoquímica de uma estrutura de prote- ína, gerando análises gráficas sobre a geometria espacial da proteína, resí- duopor resíduo. Librahttp://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/libra/LIBRA_I.html Programa on-line que utiliza threadingpara encontrar uma seqüência de resíduos de aminoácidos quemelhor se adequem a uma estrutura terciária conhecida e vice-versa. CASPhttp://predictioncenter.llnl.gov/Center.html Critical Assesment of Structural Prediction. Competição que avalia os softwares de predição de estrutura de proteínas. 24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 das. Nesta competição cada grupo re- cebe seqüências de proteínas tiveram sua estrutura resolvida experimental- mente por NMR e/ou cristalografia por difração de raios X, mas que ainda não foram publicadas. Vence o grupo que conseguir prever ab initio, com maior exatidão, a estrutura do maior número proteínas. Apesar dos esforços, até hoje não houve 100% de acerto. Métodos em filogenética molecular Umadas aplicaçõesmais antigas da bioinformática é a de desenvolvimen- to de programas que, a partir das seqüências deDNAou de proteínas de diferentes organismos, sejam capazes de reconstruir a relação de parentesco entre as espécies, o que chamamos de sistemática molecular, ou de recons- truir o parentesco entre as espécies associando essas informações a uma escala temporal, o que chamamos de filogenia molecular. A representação gráfica desses resultados é feita na forma de árvores filogenéticas. Atualmente, árvores filogenéticas são extremamente comuns em artigos que abordam assuntos de biologia molecular, refletindo o reconhecimen- to de que estas árvores representam uma maneira legítima de entender os processos biológicos e a evolução dos mais diversos caracteres. Estes estudos e as ferramentas criadas para este fim têm aplicações tão diversas como pro- curar entender a origem do homemou reconstituir a história epidemiológica da AIDS a partir de dados do genoma do vírus HIV. Para realizar inferências a respeito das relações de parentesco entre orga- nismos, tomando comobase seqüênci- as de DNA ou proteínas, o primeiro passo é identificar seqüências de inte- resse que apresentem ancestralidade comum, ou seja, que sejam homólo- gas. Para isto, muitas vezes estas se- qüências são escolhidaspor similarida- denos grandesbancosdedadosdispo- níveis na rede, sem que tenhamos, sobre elas, dados das funções bioquí- micas e biológicas que possam confir- mar sua homologia. Por isso, é impor- tante ressaltar que, ao fazermos uma reconstrução filogenética, a escolha de seqüências homólogas é fundamental para gerar uma árvore confiável, pois só assim teremos certeza de que esta- remos comparando um mesmo marca- dor que apresenta similaridades entre vários organismos a partir de uma ori- gem comum, garantindo que eles com- partilhamummesmoancestral.Quando não se comparam caracteres homólo- gos, pode-se incidir no erro de conside- rar similaridades sem origem comum e, portanto, com histórias evolutivas dife- rentes. Uma das formas de avaliar esta escolhaé incluir nas análises, seqüências de grupos externos (organismos com historia evolutiva conhecida em relação ao grupo em estudo), que funcionam como controles no processo de recons- trução de parentescos. Uma vez selecionadas as seqüências homólogas dos organismos de interesse e de grupos externos, será necessário realizar o alinhamento múltiplo entre elas e então gerar árvores filogenéticas a partir de métodos de distância ou de caracteres discretos (máxima parcimô- nia ou máxima verossimilhança) para podermos realizar a inferência filogené- tica desejada. Para tanto, os seguintes métodos são freqüentemente utilizados pelos softwares: Métodos de Distância Funcionam basicamente em dois passos, sendo que o primeiro deles é a redução das variações entre seqüências alinhadas a valores de distância dispos- tos em uma matriz. No segundo passo, estes valores sãoutilizadosna reconstru- ção filogenética. Um dos métodos de distância mais comuns é a chamada distância p, que expressa o número de sítios variáveis entre duas seqüências com relação ao total de sítios compara- dos. Além deste,existem também mui- tos outrosmodelos evolutivos utilizados para o cálculo de distâncias genéticas, comoo Jukes-Cantor, Kimura 2 parâme- tros, Tajima e Nei e Tamura 3 parâme- tros. Na reconstrução filogenética, os algoritmosmais utilizados sãooUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) e o Neighbor-joi- ning, que realizamuma série de cálculos com amatriz de distância gerada a partir do alinhamento para estimar a árvore filogenética. Máxima Parsimônia (MP) Este método baseia-se na teoria de que a melhor hipótese para explicar um processo é aquela que requer o menor número de passos. Para a análise filoge- nética, isto significa que a árvore que possuir ummenor númerodemudanças (substituições) para explicar os dadosdo alinhamento é a mais próxima da real. Na MP não há a fase de cálculo de distância, sendo que as árvores são cal- culadas diretamente dos dados do ali- nhamento. Entretanto, estametodologia requer muitomais tempo quando se usa a busca exaustiva de árvores, uma vez que o computador precisa reconstruir todas as árvores possíveis para esco- lher aquelas com um número mínimo de mudanças, que são chamadas de árvoresmaisparcimoniosas. Para contor- nar este problema do tempo, existem também algoritmos heurísticos de re- construção filogenética, mas é preciso lembrar que, nestes casos, a árvore final pode ser subótima. Máxima Verossimilhança (MV) Este método baseia-se na reconstru- ção filogenética através da busca por umaárvore quemaximize aprobabilida- dedos dados observados.Neste sentido, o método de MV calcula as probabilida- des associadas a diferentes topologias e cada uma delas com as variações nos tamanhos dos ramos, considerando o modelo evolutivo escolhido. Portanto, encontrar a árvore mais verossímil en- volve não somente a análise das topolo- gias possíveis, mas também das varia- ções de comprimento de ramos para cada topologia. Destemodo, o emprego de algoritmos heurísticos pode auxiliar enormemente na busca pela árvore ide- al, já que o tempo computacional au- menta de acordo com o número de espécies e de parâmetros considerados na análise. A cada vez que um programa de filogenia molecular é rodado para gerar uma árvore sobre o conjunto de dados escolhidos, o resultadopode ser diferen- te. Por isso, para validar uma árvore filogenética, o que se faz é rodar repeti- das vezes o programa escolhido e, esta- tisticamente, testar cada ramopara esco- lher um a um aqueles commaior proba- bilidade de ocorrência para a composi- ção final da árvore. Ométodo estatístico mais usado nessas análises é o chamado bootstrap. O bootstrap funciona gerando con- juntos modificados de dados, obtidos aleatoriamente a partir dos dados do alinhamento. Para cada conjunto aleató- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 25 BOX11 - Programas mais utilizados na análise filogenética Clustal Programapara o alinhamentomúltiplo de seqüências Acessoon line - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ Downloaddo clustal X para diversas plataformas - http://inn- prot.weizmann.ac.il/software/ClustalX.html PAUP 4.0 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony and other methods) - http://paup.csit.fsu.edu/ Análises filogenéticas utilizandométodosdedistância,máximaparcimônia emáximaverossimilhança PHYLIP (Phylogeny Inference Package) inferências filogenéticas http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html MEGA (Molecular EvolutionaryGenomeAnalysis) - http:// www.megasoftware.net/ Inferências filogenéticas commétodos de distância e parcimônia. Downloadgratuito. Treeviewhttp://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview Software gratuito para edição gráfica e impressão de árvores filogenéticas rio de dados obtidos é estimada uma árvore. As novas árvores, geradas a partir dos conjuntos modificados dos dados de entrada, são comparadas. Cada um dos ramos da árvore final recebe então um valor de probabilida- de, que é obtido do número de novas árvores onde esse ramoocorreudividi- do pelo número total de novas árvores estimadas. Probabilidades altas indi- cam que, mesmo com algumas altera- ções, os dados suportam o ramo ao qual essa probabilidade se refere e probabilidades baixas significam que, com a amostra analisada, não se pode ter certeza de que determinado ramo seja correto. CONSIDERAÇÕES FINAIS Tentamos abordar nesse artigo os principais tópicos desenvolvidos em bioinformática. Este artigo não preten- de esgotar cada um dos assuntos abor- dados,mas imaginamosqueos leitores interessados poderão encontrar mais informações e trilhar seupróprio cami- nho visitando os links e observando as referências sugeridas. Agradecimentos Sendo este trabalho fruto do apren- dizado obtido no II Curso de Especia- lização em Bioinformática, realizado de agosto a novembro de 2002 em Petrópolis - RJ, os autores gostariamde agradecer principalmente ao CNPq pelo suporte financeiro concedidopara a realização do curso e ao LNCC (Labo- ratório Nacional de Computação Cien- tífica) por sediar este evento, em es- pecial à coordenadora do curso, Ana TerezaVasconcelos.Agradecemos tam- bém a todos os nossos professores: Darcy de Almeida, Richard Garratt, Glaucius Oliva, Patricia Palagi, Marie Anne Van Sluys, Cláudia Russo, Ana- maria Camargo, Helena Brentani, San- dro de Souza, Jorge de Souza, Luiz Gonzaga, Frank Alarcon, Fernanda Raupp, Daniele Quintella, Helio Bar- bosa,AlexandrePlastino,Dorival Leão, MarcosGrivet, SimoneMartins e a todo o pessoal do Laboratório de Bioinfor- mática do LNCC. Agradecemos também a nossos orientadores e às instituições e órgãos de financiamentonacionais e estaduais pelo apoio dado a cadaumdenóspara aparticipaçãonoCursodeEspecializa- ção em Bioinformática do LNCC. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Altschul SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generati- on of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402. 1997. 2. Baxevanis AD, Ouellette BFF. Bio- informatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins. Ed. Wiley-interscience. 2nd ed. 2001. 470p. 3. Clote P, Backofen R. Computatio- nal Molecular Biology: An in- troduction. John Wiley & Sons, LTD. 2000. 286p. 4. Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabi- lities. Genome Res 8:186-94. 1998. 5. Frishman D et al. Comprehensive, comprehensible, distributed and intelligent databases: cur- rent status. Bioinformatics Revi- ew, 14, 551-561. 1998. 6. Huang X, Madan A. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Biol 9: 868-877. 1999. 7. Hunt SP, Livesey FJ. Functional genomics. Oxford University Press. 2000. 253p. 8. Matioli RM. Biologia Molecular e Evolução. Ed. Ribeirão Preto: Ho- los, 2001. 202 p. 9. Nei M, Kumar S. Molecular evolu- tion and phylogenetics. 1 Ed. New York: Oxford, 2000. 333 p. 10. Lander ES et al. Initial sequen- cing and analysis of the human genome. Nature 409:860-921. 2001. 11. Li WH, Graur D. Fundamentals of molecular evolution. 2. Ed. Sunderland: Sinauer Associates, 2000.480p. 12. Prosdocimi F et al. Clustering of Schistosoma mansoni mRNA sequences and analysis of the most transcribed genes: impli- cations in metabolism and bio- logy of different developmen- tal stages.Mem Inst OswaldoCruz 97: 61-69. 2002. 13. Schena M. Microarray Analysis. Ed. John Wiley & Sons. 2002. 14. Setubal JC, Meidanis J. Introducti- on to Computational Molecular Biology. Brooks Cole Publishing Company. 1997. 296p. 15. Stein L. Genome annotation: from sequence to biology. Nat Reviews 2: 493-505. 2001. 16. Strohman R. Five stages of the Human Genome Project. Nat. Bio- technol 17, 112. 1999. 17. Schwartz RL. Learning Perl. Ed. OReilly & Associates, Inc. 1993. 247p. 18. Tisdall JD. Beginning Perl for Bioinformatics. Ed. OReilly & Associates, Inc. 2001. 368p. 19. Venter JC et al. The sequenceof the human genome. Science 29:1304-51. 2001. 26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Pesquisa Identificação de regiões do Genoma importantes no controle da doença Foto cedida pelos autores CHAGAS FenômenodaResistência Foto cedida pelos autores Figura 1: Estante ventilada para a manutenção de animais em condições sanitárias e de ambiente controladas Luiz Augusto Corrêa Passos Responsável pelo Laboratório de Genética e Criopreservação CEMIB / UNICAMP S.P. Júlia Keiko Sakurada Profa. Dra. do Departamento de Microbiologia e Imunologia Membro do Conselho Científico do CEMIB / UNICAMPS.P. Ana Maria Aparecida Guaraldo Profa. Dra. do Departamento de Parasitologia Diretora do CEMIB / UNICAMP S.P. Silvia Colleta Barreto da Costa Ortiz Diretora do Centro de Bioterismo FM/USP S.P. Humberto de Araújo Rangel Prof. Dr. do Departamento de Microbiologia e Imunologia Pesquisador doCEMIB /UNICAMP S.P. Jean Louis Guenet Unité de Génétique des Mammifères Institut Pasteur França Resenha histórica O crescimento da pesquisa cien- tífica, revelando importantes des- cobertas na área da saúde, se ini- ciou há pouco mais de um século, quando epidemias varriam cons- tantemente os continentes, diziman- do as populações ou acarretando alterações profundas em suas con- cepções e conduta. Embora a utilização de animais, como modelo experimental, tenha sido concebida na Grécia antiga, o impulso definitivo para a sua utili- zação somente ocorreu no século XVII, com a Revolução Científica que promoveu uma mudança de atitude frente à vida, transferindo a confiança e fé depositadas no cu- randeirismo para os serviços médi- cos (Parascandola, 1994). A investigação científica sempre foi um fator decisivo para a confi- ança na terapêutica médica. Confi- amos porque sabemos que antes de experimentados pela primeira vez no ser humano, uma droga, um procedimento ou uma simples re- comendação, foram investigados em várias espécies de animais de laboratório, sendo atualmente exi- gido que os protocolos sejam de- senvolvidos em condições que não provoquem dor ou sofrimento des- necessários. No século XX, os mamíferos, especialmente camundongos e ra- tos, foram eleitos, devido aos seus parâmetros biológicos, os princi- pais modelos para uso em pesqui- sa nas diversas áreas (Paton, 1984). Em decorrência de características particulares, foram estabelecidas, como referência para o teste de drogas e procedimentos, o uso de 5 espécies: camundongo, rato, ha- mster, cobaio e coelho (Rothshi- eld, 1994). O pós-guerra, da década de 50, desencadeou um acentuado avan- ço nas pesquisas, aumentando a utilização de animais de laborató- rio. Em sua obra de 1984, Willian Paton relaciona, de forma clara, o número de animais utilizados e a melhoria na qualidade de vida das populações. Segundo o autor, en- tre 1890 e 1980, o número de expe- rimentos que utilizavam animais saltou de pouco mais de 1000 para Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 27 mais de 1.000.000, anualmente. Os benefícios decorrentes deste uso se estendem desde a descoberta da vacina tifóide até o desenvolvimen- to de anticorpos monoclonais e a biotecnologia na década de 80. Além do aumento do número de experiências com animais, também foi decisiva a criação de uma Ciên- cia, pluridisciplinar, voltada para o estudo dos modelos animais, reu- nindo especialistas das mais dife- rentes áreas. Como conseqüência, dispomos hoje em dia, de modelos animais padronizados do ponto de vista sanitário, genético e de ambi- ente e de equipamentos (Figura 1) que permitem manter esses ani- mais em condições controladas, eliminando a interferência de fato- res alheios ao delineamento expe- rimental e aumentando a sensibili- dade e a confiabilidade dos resul- tados experimentais. A década de 60 cristalizou nos países desenvolvidos, esta nova mentalidade, com conseqüências sobre todo o sistema de produção e cuidados com os modelos ani- mais (Beall e cols 1971; Dillehay e cols 1990; Menendez, 1985). Desta forma, os animais de laboratório passaram a ser padronizados con- duzindo ao estabelecimento de di- ferentes linhagens de camundon- gos tais como isogênicas, heteroge- néticas, recombinantes isogênicas, congênicas e mutantes entre ou- tras, cada uma delas atuando como ferramentas essenciais para o entendimento de fenômenos bio- lógicos. Origens dos camundongos atualmente utilizados na experimentação biomédica Os camundongos utilizados ti- veram a sua origem há cerca de 1 milhão de anos, da derivação de 4 subespécies: domesticus (oeste eu- ropeu); molossinus (Japão); mus- culus (leste europeu, Russia e norte da China) e castaneus (oeste da Ásia, sudoeste da Ásia e sul da China). Recolhidos em cativeiro, repre- sentantes do roedor silvestre eu- ropeu e leste asiático, constituem- se hoje nos mais próximos ances- trais (aproximadamente 200 anos) dos camundongos utilizados na pesquisa biomédica (Silver, 1995). Uma vez no cativeiro, os animais puderam ser acasalados progra- madamente, obtendo-se linhagens com características genéticas dife- rentes umas das outras, o que contribuiu sobremaneira para a pesquisa biomédica, com refle- xos no desenvolvimento científi- co. Por aceitarem bem acasalamen- tos endogâmicos absolutamente consangüíneos, camundongos e ratos, acasalados entre irmãos por várias gerações, formam popula- ções de animais muito homogê- neas do ponto de vista genético (Godard, & Guenet, 1999). Algumas destas linhagens con- sangüíneas foram determinantes para muitos dos benefícios da me- dicina atual. George Snell, por exemplo, realizou acasalamentos entre linhagens possuidoras de MHC diferentes e obteve um mo- delo animal que foi fundamental à compreensão científica dos me- canismos envolvidos na rejeição de tecidos transplantados. Observa-se que, enquanto al- gumas linhagens são dizimadas pela infecção causada por um de- terminado patógeno, outras não o são, indicando que o ba- ckground genético está direta- mente relacionado ao fenômeno da resistência. Moulia e cols (1996) citam como exemplo as infecções promovidas por agentes como Plasmodium falciparum, Toxo- plasma gondii, Schistossomaman- soni, Trichinella spiralis, Leishma- nia sp, onde a noção de modelo animal é ainda mais complexa, pois os mecanismos genéticos im- portantes neste determinismo po- dem envolver mais que um gene. A observação de que a infec- ção por T. cruzi, em diferentes linhagens isogênicas, apresenta desde uma alta susceptibilidade até uma forte resistência (Trisch- mann, 1984), justifica o interesse em se buscar novos modelos que auxiliem o entendimento de doen- ças causadas por protozoários. Doença de Chagas A doença de Chagas está entre os principais problemas de saúde da América do Sul, comprometen- do a qualidade de vida das popula- ções carentes. No início da década de 90, estimava-se um total de 17 milhões de pessoas infectadas (WHO, 1991) e em meados desta mesma década, levantamentos apontaram para um total de 16 mi- lhões e outras 90 milhões de pesso- as expostas ao risco de infecção pelo T.cruzi (Wanderley & Corrêa, 1995), (Wizel e cols, 1998). Apesar dos recentes sucessos na interrupção da transmissão ve- torial, em alguns países como o Brasil, resta ainda infectado, um contingente de cerca de 6 milhões de pessoas, com uma população de risco em torno de 20 milhões de habitantes (Goldenberg & Krieger, 1997). O agente causal da doença, T.cruzi, é um parasito intracelular, que possui um ciclo biológico com- plexo e apresenta várias cepas dis- tintas (Brener e cols, 1980), com alta capacidade de adaptação fisio- lógica e uma ampla variabilidade genética, inclusive relacionada à severidade da doença (Macedo & Pena, 1998). Este protozoário infecta vários tiposcelulares e tem a capacidade de evadir-se do vacúolo parasitófo- ro inicialmente produzido, prolife- rando lentamente, imerso no cito- plasma das células, o que dificulta a ação da resposta imune e de drogas. Após uma curta fase aguda caracterizada por uma alta parasi- temia, grande disseminação e uma importante imunossupressão (Mi- noprio e cols, 1989), o hospedeiro consegue controlar as formas circu- lantes ou tripomastigotas, entran- do em uma fase crônica que se caracteriza por um parasitismo teci- dual e uma parasitemia dificilmen- te detectável (Soares e cols, 2001). Isto resulta em dificuldade no esta- 28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 belecimento de protocolos efici- entes para o tratamento na fase crônica da doença e ressalta a importância de estudos que vi- sem a favorecer a manipulação imunológica durante a fase aguda da infecção (Costa e cols, 1998). Nos seres humanos, a princi- pal causa de morbidade e morta- lidade é o comprometimento car- díaco, que ocorre em cerca de 30% dos indivíduos infectados, representando atualmente, cerca de 2 milhões de pessoas (Cunha Neto, 1999). Os mecanismos rela- tivos à resistência ao estabeleci- mento desta cardiopatia chagási- ca, são ainda assunto de intenso debate, havendo, entretanto, o consenso da importância da cons- tituição genética do indivíduo, no desenvolvimento da doença. Os ensaios laboratoriais ne- cessários à compreensão destes mecanismos genéticos, são, por razões óbvias, realizadas em mo- delos animais definidos genetica- mente. Aspectos genéticos da resistência à infecção pelo T.cruzi. No início dos anos 80, pesqui- sadores investigando a resistên- cia ao T.cruzi, em camundongos de diferentes linhagens isogêni- cas, concluíram que o controle da parasitemia e a capacidade de sobreviver à fase aguda da infec- ção dependiam de fatores genéti- cos, ainda não identificados, rela- cionados à constituição genética do parasito (Macedo & Pena, 1998; Andrade e cols, 1985) e do hospe- deiro (Eksi e cols, 1996; Moulia, 1996). Com relação ao hospedeiro, os resultados obtidos por Trisch- mann, indicaram ser o Complexo Maior de Histocompatibilidade (H2), presente no cromossomo 17, importante para a resistência, conformepode ser observado, ana- lisando-se o comportamento de camundongos isogênicos das li- nhagens C57BL/6 e DBA/2 e seus respectivos híbridos F1 e F2 após desafio com o parasito. Conclusão semelhante foi obti- da por Wrightsman e cols (1984) realizando experimentos com as linhagens C57BL/10, C57BL/6 e BALB/c. A realização de ensaios, utili- zando linhagens recombinantes isogênicas (Bailey, 1971), abriu nova discussão acerca da impor- tância de mecanismos genéticos no fenômeno da resistência ao T.cruzi. Este modelo animal é desenvolvi- do a partir de duas linhagens isogênicas acasaladas por pelo menos 20 gerações e, como conse- qüência, os animais derivados se- rão homozigotos em todos os alelos, sendo entretanto, ora de uma li- nhagem isogênica parental origi- nal, ora da outra. Trabalhando com linhagens recombinantes isogênicas (BXH-2) derivadas do fenótipo re- sistente (C57BL/6) e susceptível (C3H/HeJ), Trischmann identificou que esses recombinantes eram mais susceptíveis à infecção pelo parasi- to, quando comparados às linha- gens parentais isogênicas originais. Tal fato conduziu à hipótese da ocorrência de uma mutação, du- rante o processo de obtenção da- quela linhagem recombinante, a qual estaria relacionada à incapaci- dade dos animais controlarem a proliferação do T. cruzi. Desta forma, postulou-se a hi- pótese da resistência ser um fenô- meno de caráter poligênico, com a participação de genes localizados fora do Complexo Maior de Histo- compatibilidade (Trischmann, 1984; Wrightsman e cols, 1984). Estes achados estimularam o de- senvolvimento do presente traba- lho, que teve como principal obje- tivo, identificar as regiões cromos- sômicas envolvidas com a resistên- cia à cepa Y2 de T. cruzi. Para tanto, foram utilizados camundongos, oriundos de diferentes programas de acasalamento que, depois de infectados, foram analisados pela reação de polimerase em cadeia (PCR), com marcadores molecula- res para microsatélites, presentes em amostras de DNA dos indivídu- os que resistiram à infecção. Análise da resistência à infecção experimental pelo T.cruzi. Animais isogênicos, experimen- talmente infectados, apresentam um comportamento diferenciado. Ca- mundongos da linhagem A/J mor- rem, ainda na fase aguda da infec- ção, com um inóculo constituído de baixas quantidades de parasito (como por exemplo 101 formas san- guícolas de tripomastigotas), en- quanto animais C57BL/6 podem sobreviver com doses elevadas, como por exemplo 105 formas de parasitas. A existência de linha- gens isogênicas, que exibem fenó- tipos intermediários, sugere que o determinismo genético da resistên- cia ao parasito está sob o efeito de um controle complexo e que, a capacidade de animais inoculados resistirem à infecção é função da expressão de genes oriundos de diferentes regiões do genoma dos animais. A identificação destas re- giões, seguida de sua análise, po- derá contribuir significativamente para a compreensão do fenômeno da resistência. Identificação dos cromossomos e das regiões relacionadas à resistência. Determinação da dose discriminatória Inicialmente, animais oriundos das linhagens isogênicas de fenóti- po resistente (C57Bl/6) e susceptí- vel (A/J) foram desafiados com di- ferentes doses de parasito, a fim de se determinar a dose discriminató- ria. O ensaio foi realizado inoculan- do-se grupos de animais, de ambas as linhagens, com 101, 102, 103, 104 e 105 formas de tripomastigostas. Todos os animais da linhagem A/J morreram com a dose de 101 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 29 parasitos e por esta razão foram considerados susceptíveis. Entre- tanto, o uso da maior dose admi- nistrada (105 parasitos) conduziu à morte de 50% da população de animais da linhagem C57Bl/6, que por esta razão foi considerada re- sistente. Com base nestes resultados, du- rante todo o experimento foi utili- zado um inóculo constituído de 104 formas de tripomastigota sanguíco- la, injetado intraperitonialmente. Observou-se que somente os ani- mais com fenótipo resistente so- brevivem, diferentemente daque- les com fenótipo susceptível ou intermediário. Análise da transmissão da resistência Para uma melhor compreensão do mecanismo de herança, presen- te no fenômeno da resistência, fo- ram realizados testes em animais híbridos F1, produto do acasala- mento realizado entre camundon- gos isogênicos C57BL/6 de fenóti- po resistente e A/J de fenótipo sus- ceptível. Uma vez que apresentam meta- de de cada um dos parentais isogê- nicos originais, resistentes e sus- ceptíveis, estes animais são homo- gêneos, ou seja, têm a mesma com- posição genética. A sobrevivência encontrada, após o desafio com a dose discrimi- natória de parasito, foi similar à observada na linhagem isogênica de fenótipo resistente, indicando que a resistência à fase aguda da infecção podia ser transmitida e apresentava um caráter dominan- te. Identificação das regiões relacionadas com a resistência. A partir destes achados e com acasalamentos programados, foram produzidos animais recombinan- tes de segunda geração, (B6A)F2, (obtidos por intercrosss entre CROMOSSOMO CROM. 7 CROM. 11 CROM. 14 CROM. 17 CROM. 19 MARCADOR MOLECULAR D7Mit27 D7Mit82 D7Mit301 D7Mit222 D11Mit162 D11Mit83 D11Mit135 D14Mit7 D14Mit265 D17Mit16 D17Mit176 D17Mit66 D19Mit40 D19Mit19 D19Mit100 POSIÇÃO 23 25 46,6 52,6 8 16 17 44 48 18 22 24 25 26 27 Nº DE ANIMAIS TESTADOS 71 77 68 76 55 68 51 77 77 37 68 64 7577 53 X2 8,83 17,57 13,03 8,92 1,80 26,82 2,57 3,16 19,47 0,89 11,41 0,38 2,79 18,43 6,4 p 0,012088593 0,000152902 0,001481492 0,011556279 0,406569663 1,49742E-06 0,276840507 0,206403543 5,92487E-05 0,640218379 0,003326341 0,82902912 0,248246436 9,96062E-05 0,040839186 Tabela 1: Regiões relacionadas com a resistência encontrada nos animais (B6A)F2 Tabela 2 Regiões cromossômicas comuns a (B6A)F2r e RIS* Marcador Molecular Posição Linhagens Recombinantes Isogênicas Grupo I Grupo II BXA1 BXA7 BXA2 BXA4 D7Mit82 25 B B A A D7Mit145 26,4 B B A A D11Mit83 16 A A B A D14Mit265 48 B B B B D17Mit176 22 B B B A D19Mit19 26 B B A B 30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 animais F1 resistentes). Estes ani- mais foram desafiados e 43% so- breviveram, descartando a hipó- tese de uma herança monogênica para o fenômeno da resistência usando-se como referência os re- sultados observados na popula- ção de animais F1. Além disso, a análise estatística realizada com este grupo de animais F2, apre- sentou forte desvio do esperado (75% como alelo dominante e 25% como alelo recessivo) no valor do qui-quadrado: x2 = 40,34 p= 2,13e-10. Não obstante estas considera- ções, ficou demonstrado que a recombinação genética, decorren- te da segregação independente, dissociou fortemente os alelos envolvidos com a resistência, uma vez que o número de animais que sobreviveram foi inferior a 50% dos inoculados. Além disso, o número de indivíduos resisten- tes sugeria que o fenômeno era poligênico, fato comprovado pos- teriormente na avaliação genéti- ca destes animais. Amostras de tecidos dos so- breviventes foram retiradas e pro- cessadas a fim de se extrair o DNA para a definição da constitui- ção genética de cada animal (geno- tipagem), com a reação de PCR, utilizando-se marcadores molecu- lares (primers) dirigidos para mi- crosatélites polimórficos. Foram uti- lizados 147 primers, escolhidos de forma a cobrir todas as regiões do genoma, e capazes de reconhecer exclusivamente cada uma das li- nhagens parentais isogênicas ori- ginais de fenótipo resistente e sus- ceptível. Os resultados encontrados es- tão apresentados na Tabela 1 e indicam que as regiões, em dese- quilíbrio para o fenótipo resisten- te, estão presentes nos cromosso- mos 7, 11, 14, 17 e 19. Comportamento de linhagens recombinantes isogênicas derivadas das linhagens parentais isogênicas originais frente ao T.cruzi. A partir de uma busca realizada junto ao genome informatics do Jackson Laboratory (www.jax.org), foram escolhidas linhagens recom- binantes isogênicas (BXA) para de- safio nas mesmas condições dos grupos anteriores. O comportamento destes ani- mais, após o desafio, permitiria estabelecer uma relação entre as regiões presentes neste grupo ex- perimental e aquelas identificadas nos grupos anteriores. Assim, os animais desafiados puderam ser separados em dois grupos, onde os animais do grupo I, que apresentaram uma mortali- dade média de 40% foram conside- rados de maior sobrevivência, en- quanto os animais do Grupo II, que apresentaram uma mortalidade média de 55% (BXA2) e 65% (BXA4), foram considerados de menor so- brevivência. A comparação dos resultados encontrados nestes animais (BXA), com os observados anteriormente na população (B6A)F2r, revelou uma correspondência entre as regi- ões, conforme pode ser observado na Tabela 2. O grupo de maior sobrevivência apresenta 4 regiões em correspon- dência àquelas identificadas na po- pulação (B6A)F2. Por outro lado, os animais do grupo II apresentam apenas 2 (linhagem BXA4) e 3 (li- nhagem BXA2) regiões das identifi- cadas anteriormente. Tais resultados sugerem, que estas regiões, apresentam genes capazes de interferir no fenômeno da resistência, os quais poderiam ser transmitidos através de acasala- mentos programados, de forma a se produzir um novo modelo para a investigação da doença: uma li- nhagem congênica resistente. A produção do modelo congênico para a resistência: uma nova ferramenta. Animais albinos, provenientes de híbridos (B6A)F2, que sobrevi- veram ao desafio com 104 parasi- tos, foram retroacasalados com o parental susceptível. A progênie deste retroacasalamento (backcross) foi expandida (intercross) e desafi- ada (figura 2). Esta linhagem con- gênica, em desenvolvimento, mes- mo apresentando uma grande par- ticipação do genoma da linhagem Figura 2 - Representação Esquemática da Obtenção doModelo Congênico Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 31 susceptível, possui um nível de resistência superior, em pelo me- nos 100 vezes, ao padrão isogêni- co parental susceptível original. O emprego deste novo modelo será de grande impacto na análise das diferenças genéticas e fisiopa- tológicas presentes nos animais resistentes e susceptíveis. A iden- tificação de alvos preferenciais, para o desenvolvimento protoco- los visando combater a doença, auxiliará aos cientistas e às socie- dades que os congregam, no en- tendimento de doenças causadas por protozoários, resultando em benefícios para a população. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE V, BARRAL-NETTO M, ANDRADE SG; (1985); Patterns of resistance of inbred mice to Trypanosoma cruzi are deter- mined by parasite strain. Braz. J. Med. Biol. Res. 18 (4); p. 499-506 BAILEY, D.W. 1971, Recombinant inbred strains. Transplantati- on. v. 11 n.3, p. 325 -327. BEALL, J.R., TORNING, F.E. & RUNKLE, R.S. 1971. A laminar flow system for animal mainte- nance. Lab. Anim. Scien. v. 21, p. 206 - 212. BRENER, Z.; (1980); Immunity to Trypanosoma cruzi; Adv. Pa- rasit. 18; p. 247 291 COSTA F., FRANCHIN G., PEREI- RA-CHIOCCOLA V.L., RIBEI- RÃO M., SCHENKMAN S. & RODRIGUES M.M. (1998). Im- munization with a plasmid DNA containing the gene of trans-sialidase reduces Trypa- nosoma cruzi infection in mice. Vaccine. 16(8); p. 768-774 CUNHA NETO, E. (1999). Doença de Chagas. Biotecnologia Ci- ência e Desenvolvimento (9) p. 20 22. DILLEHAY, D.L., LEHNER, N.D.M. & HUERKAMP, M.J. 1990. The effectiveness of a micro isola- tor cage system and sentinel mice for controlling and detec- ting MHV and Senday virus in- fections. Lab. Anim. Scien. v. 40, p.367 - 370. EKSI, S.; WASSON, D.L. & POWE- LL, M.R. (1996). Host genetics and resistance to acute Trypa- nosoma cruzi infection in mice: profiles and compartmentaliza- tion of IL-2; IL-4; IL-5; IL-10 and IFN-gamma-producing cells. J. Parasitol. 82(1); p. 59 65. GODARD, A.L. & GUENET, J.L. (1999). Genética de camundon- gos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento (9) p. 96 100. GOLDENBERG, S. & KRIEGER, M.A. (1997). Doença de Chagas Biotecnologia Ciência & De- senvolvimento (3) p. 26 27. MACEDO, A. M. & PENA, S.D.J. (1998). Genetic variability of Trypanosoma cruzi: Implicati- ons for the pathogenesis of Cha- gas disease. Parasitology To- day. 14(3) p. 119 124. MENENDEZ, R.C. 1985. Animales de laboratorio en las investiga- ciones biomédicas. Cuba, La Habana Editorial. Ciencias Me- dicas. p 203. MINOPRIO, P.; ITOHARA, S.; HEUSSER, C.; TONEGAWA, S. & COUTINHO, A. (1989); Im- munobiology of Murine T. cru- zi infection: The predominance of parasite-nonspecific respon- ses and activation of TCR I T cells. Immunol. Rev. 112; p. 183 207 MOULIA, C.; Le BRUN, N. & RE- NAUD, F. (1996). Mouse-Para- site Interactions: from gene to population. Adv. Parasitol. 38, p. 119 167. PARASCANDOLA, J., B. 1994. The History of Animal Use in the Life Sciences IN: The world con- gress on alternatives and ani- mal use in the life sciences: education, research, testing. Alan M. Goldberg and LFM Von Zutphen (Eds.). Mary Ann Lie- bert, Inc. publishers. PATON, W. 1984. Man and mouse. Animals in medical research. Oxford UniversityPress. Oxford. ROTHSHIELD, M.A. 1990. Manual para técnicos de bioterismo. São Paulo, Epm, Finep. p. 220. SHIROISHI, T., & YONEKAWA, H. 1994. Genetic differentiati- on and geographical distribu- tion of various subspecies of mice IN:Genetics in wild mice - its applications to biomedi- cal research. Edited by - Ko- zuo Moriwaki. Japan Scienti- fic Societies Press. SILVER, L.M. 1995. Mouse Gene- tics concepts and applicati- ons. Oxford University Press, England. 1 - 362 SOARES, M. B. P.; PONTES-DE- CARVALHO, L & RIBEIRO- DOS-SANTOS, R. (2001). The pathogenesis of Chagas dise- ase: when autoimmune and parasite-specific immune res- ponses meet. An. Acad. Bras. Cienc. 73 (4); p. 547 559. TRISCHMANN, T. M. ; (1984); Single Locus in BXH-2 mice responsible for inability to con- trol early proliferation of Trypanosoma cruzi. Infec. Immun. 46; p. 658 662 WANDERLEY, D.M. & CORRÊA, F.M. (1995); Epidemiology of Chagas Heart Disease; Rev. Paul. Med. 113 (2); p. 742 749 W.H.O. (1991); Control of Cha- gas Disease. WHO. 187; p.1 WIZEL B., GARG N., TARLETON R.L. (1998); Vaccination with Trypomastigote Surface Anti- gen 1-Encoding Plasmid DNA Confers Protection against Le- thal Trypanosoma cruzi Infec- tion. Infection and Immuni- ty. 66 (11); p. 5073-5081 WRIGHTSMAN R.A., KRASSNER S.M., WATSON J.D., MAN- NING J.E. (1984); Role of the H-2s Haplotype in Survival of Mice after Infection with Trypanosoma cruzi. Infecti- on and Immunity. 44(2); p. 351-354 32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 O CONTEXTO CONTEXTO CONTEXTO CONTEXTO CONTEXTO BRASILEIROO BRASILEIROO BRASILEIROO BRASILEIROO BRASILEIRO PPPPPARA A BIOPROSPECÇÃOARA A BIOPROSPECÇÃOARA A BIOPROSPECÇÃOARA A BIOPROSPECÇÃOARA A BIOPROSPECÇÃO::::: Pesquisa Paulo José Péret de Sant Ana Doutor em Engenharia de Produção pela COPPE/UFRJ Analista emCiência e Tecnologia Coordenação de Biotecnologia e Recursos Genéticos do CNPq e-mail: pperet@cnpq.br Ana Lúcia Assad Doutora em Política Científica e TecnológicapelaUNICAMP Coordenadora Geral de Biotecnologia da Secretaria de Políticas e Programas doMCT e-mail:aassad@mct.gov.br 1) Introdução: O valor dos produtos naturais, es- pecialmente das plantas medicinais para a sociedadeepara aeconomiado Estado é incalculável. Cerca de 60% a 80% da populaçãomundial, especial- mente em países em desenvolvimen- to, aindaconfiamnopoder terapêutico de plantas medicinais no tratamento de suas doenças (Lapa, 2001). Somente nos EUA foramvendidos formalmente, em 1980, cerca de 8 bilhões de dólares emmedicamentos derivados de plantas; para o período de 1959 a 1980, os medicamentos derivados de vegetais representaram uma constância de 25% de todas as prescrições médicas nas farmácias americanas. A venda oficial desses medicamentosnomundoatinge cerca de 20 bilhões de dólares/ano, sem incluir a economia informal dautiliza- ção popular2 de plantas medicinais nos países do terceiro mundo e nos países desenvolvidos, o que elevaria este valor à ordem de centenas de bilhõesdedólares/ano (Garcia, 1998). Acomposição totaldabiodiversida- de brasileira não é conhecida e talvez nuncavenhaa ser, tal a suamagnitude e complexidade3 . Sabendo-se, entre- tanto, que para a maioria dos seres vivos o percentual de ocorrência em territórionacional,naplataformaconti- nental e nas águas jurisdicionais brasi- leiras, é elevado, é fácil inferir que o número de espécies, tanto terrestres quantomarinhas, aindanão identifica- das, no Brasil, pode alcançar a ordem de dezena de milhões. No tocante à biodiversidade das florestas tropicais, comoaAmazônia,o quepode-se esperar é que as potenci- ais descobertas denovosprodutosna- turais biologicamente ativos serãodas florestas tropicais. Somente o Brasil possui aproximadamente 60.000 es- pécies de plantas, o que correspon- de a cerca de 20% de toda a flora País Japão Alemanha EUA ReinoUnido França Percentual de Recursos Públicos em P&D 25% 33% >50% >50% >50% Quadro 1: Percentual de recursos públicos em P&D Fonte:Machado (2001) 1 Para uma análise mais pormenorizada, não apenas da competência científico-tecnológica para o desenvolvimento de drogas terapêuticas a partir da biodiversidade, mas também do aparato jurídico-institucional para a conservação e uso sustentável da biodiversidade, vide Sant Ana, P.J.P. (2002): É possível a Bioprospecção no Brasil? Tese de doutorado, COPPE/ UFRJ, Rio de Janeiro. 2Supõe-se que mais de 70% dos medicamentos derivados de plantas foram desenvolvidos com base no conhecimento folclórico. Dados etnobotânicos de plantas medicinais da Amazônia, por exemplo, revelam mais de 300 espécies de fitoterápicos catalogados (Garcia ,1998 e Lapa, 2001). 3 Há no Brasil diversas iniciativas destinadas a promover o avanço do conhecimento sobre a biodiversidade. Uma iniciativa recente é o Centro de Referência em Informação Ambiental (CRIA), entidade privada sem fins lucrativos. O CRIA está ligado a outras iniciativas, tais como Rede Inter-americana de Informação em Biodiversidade (Iabin); Rede Brasileira de Informação em Biodiversidade (BINbr); Programa Biota/Fapesp; Sistema de Informação Ambiental SinBiota/Fapesp; Bioline Internacional (Silva & Mello, 2001). Para maiores informações ver www.cria.org.br. A Competência Científico-Tecnológica Brasileira1 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 33 mundial conhecida, e não menos de 75% de todas as espécies existentes nas grandes florestas. A Floresta Ama- zônica brasileira, com mais de 30 mil espécies vegetais, compreende cerca de 26% das florestas tropicais rema- nescentes no planeta, isto sem citar toda amicrobiota aindadesconhecida (Brasil, 1998; Silva & Mello, 2001). Assim, a biodiversidade brasileira reveste-se de uma importância estra- tégica ímpar, principalmente para ati- vidade de bioprospecção, que vem a ser exploraçãodadiversidadebiológi- ca por aqueles recursos considerados de valor comercial e que, eventual- mente, pode fazer uso do conheci- mento de comunidades indígenas ou tradicionais. Contudo, estas atividades expressamas especificidades estrutu- rais dospaíses biologicamente ricos, a saber: o aparato jurídico-institucional para a conservação e uso sustentável da biodiversidade e a competência científico-tecnológica para o desen- volvimento de drogas terapêuticas a partirdabiodiversidadesendo,portan- to, associada à indústria farmacêutica. Noentanto, limitaremosopresente artigo ao contexto brasileiro para bio- prospecçãonoque tangeà competên- ciacientífico-tecnológicanacionalpara tal atividade4 , ao mesmo tempo em quebuscaremosdarumperfil panorâ- micoda indústria farmacêutica nosní- veis internacionalenacional,commaior relevância aomercadoeas competên- cias necessárias para a produção de fitoterápicos,principalmentenoBrasil. 2) Mercado Internacional de fitoterápicos: A indústria farmacêuticaglobal, se- gundo Machado (2001), representa 33%daproduçãodequímicos,oumais de US$280 bilhões. A distribuição por origem de medicamentos mostra que 65%dequímicospreparados em labo- ratórios, sendo 25%apartir de plantas e 10% a partir de animais e microrga- nismos5. Se for consideradoomercado paradrogasanti-cancerígenaseantibi- óticos, por exemplo, este percentual é ainda mais elevado, cerca de 70% delas foram desenvolvidas a partir de recursos naturais. Entre asmaiores in- dústrias farmacêuticas mundiais, 17 delas têmprogramasnaáreadeprodu- tos naturais e 14 comercializammedi- camentos desenvolvidos a partir de produtos naturais (Calixto, 2000). Esta indústria, segundo Machado (2001), é altamente dependente dos gastos do setor público com saúde (14%dosgastos totaisnosEUA), sendo que parte significativa dos recursos advindos do setor público é aplicado emPesquisaeDesenvolvimento,como mostradonoQuadro 1. Aindústria farmacêuticaestevesem- pre baseadaem inovação e diferenci- ação de produtos com elevadas des- pesasemP&D&I6 . Na década de 60 as despesas emP&D&I foramcalculadas em cerca de US$ 50 milhões saltando para uma cifra que está entre US$ US$250 milhões e US$400 milhões (Machado, 2001). Umoutrosetorquevemchamando atençãoemnívelmundial relaciona-se aosmedicamentos derivadosdeplan- tas, são osmedicamentos conhecidos como fitoterápicos7, umsegmento, em franca expansão, atingindocifras anu- ais na ordem de 30 a 40 bilhões de dólares anuais (Calixto, 2000), como também se pode ver na Quadro 2. Este crescente interesse está asso- ciado ao baixo custo de desenvolvi- mentodomedicamento,quandocom- paradocomadescobertadeummedi- camento sintético. Enquanto o custo de desenvolvimento pode chegar a US$500milhões e levar de 7 a 20 anos até que o produto final chegue ao mercado,nocasodeumprodutoorigi- nadodeplantamedicinal esse investi- mento é da ordem de cerca de US$ 35 milhões (Buainain & Silva, 2000). Outro fator a serobservado, segun- do Yunes, Pedrosa e Cechinel (2001), é o aprimoramento da tecnologia far- macêutica na área de fitoterápicos, o que permitiu um melhor controle de qualidade de fármacos baseado na moderna tecnologia de identificação, determinaçãoequantificaçãodecom- postos químicos, tornando possível à fabricação de fitofármacos8 seguros, eficazes e de efeito totalmente repro- dutível. Segundo os mesmos autores, os avanços na pesquisa de fitoterápicos nonível farmacológico, toxicológicoe molecular permitiram constatar que estes representam ummecanismo de ação totalouparcialmenteesclarecido, com avaliação toxicológica segura, e Quadro 2: Taxas de crescimento anula do mercado de fitoterápicos por região (%) Fonte: Buainain & Silva (2000) Região EUA UniãoEuropéia Resto da Europa Japão Sudeste da Ásia Índia ePaquistão Crescimento 1985 - 1991 10 10 12 18 15 12 Crescimento 1991 - 1992 12 5 8 15 12 15 Projeção 1993 - 1998 12 8 12 15 12 15 4Maiores detalhes em SANT ANA, P.J.P., 2002, É possível a Bioprospecção no Brasil? Tese de doutorado, COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro. 5 Segundo Calixto (2000) 13% de microorganismos e 3% de animais. 6 P&D&I: Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação Tecnológica. 7 Fitoterápicos ou Fitomedicamentos são medicamentos originários exclusivamente de material botânico integral ou seus extratos, usados como propósito de tratamento médico. Nesta indústria, inserem-se, ainda, os Fitofármacos que se caraterizam como substâncias medicamentosas isoladas de extratos de plantas. 8 Entendidos aqui como moléculas puras obtidas de plantas. estudos de farmacologia pré-clinica e farmacologia clínica realizados segun- do as normas que regemosprocessos de validaçãode fármacos puros. 3) Mercado Brasileiro deFitoterápicos: Tendoemvista o aumentodomer- cado internacional para essesmedica- mentosea suabiodiversidade,oBrasil possui enorme potencialidade e van- tagens comparativamente aomercado para medicamentos sintéticos, pois o setor farmacêutico brasileiro, por não dispor de recursos suficientes para in- vestir pesadamente em P&D&I, não teve condições de desenvolver um dos elos mais importantes da cadeia produtivademedicamentos, nocasoa produção de fármacos. Assim, as em- presas nacionais desenvolveram-se basicamente comocopiadoras, preju- dicandoeameaçandoacompetitivida- deda indústria farmacêutica brasileira (Coutinho e Ferraz, 1994; Ferreira, 1998; Machado, 2001). Todoomercadobrasileirodemedi- camentos e cosméticos movimentou US$18 bilhões em 1996, no qual 25% dos remédios são oriundos de produ- tos naturais, destes, o que correspon- deria aomercadode fitoterápicos éde difícil cálculo já que não existem esta- tísticas precisas a respeito deste mer- cado no Brasil, mas estima-se entre US$700mil aUS$1milhãoanuais, algo entre 7% a 10% domercado brasileiro de medicamentos (SCA/MMA, 1998; Bahruth, 1999; Calixto, 2000). No entanto, existem alguns garga- los que dificultam a atuação das em- presas farmacêuticasbrasileirasnaárea de fitoterápicos.Dentre aqueles apon- tados por Ferreira (1998), nos detere- mos em dois gargalos: um acerca da faltadeportedas firmasnacionaispara realizar os altos investimentos neces- sários em P&D&I, ao mesmo tempo em que o País ainda não consegue repassar o conhecimento produzido nasuniversidadesecentrosdepesqui- saparao setorprodutivoeoutro sobre odescompasso entre áreas depesqui- sa e produção9 . 3.1) P&D&I e relação Universidade-Indústria: Apesar da razoável base cientifica queopaís possui, a distância necessá- ria para realizar P&D&I de novas dro- gas terapêutica a partir de plantas medicinaiséaindamuitogrande.Apon- ta-se para tal distanciamento, não so- mente o longo tempoeos altos custos envolvidos, a exigência de equipes multidisciplinares e competentespara a tarefa específica, trabalho este com pouca tradição na universidade brasi- leira(Yunes,Pedrosa&Cechinel,2001). O caráter multi e interdisciplinar que permeia toda a pesquisa com plantasmedicinais temsido reconheci- do como ponto crucial para o desen- volvimento de estudo mais elabora- dos, profundos e, consequentemente, de maior credibilidade científica e menores probabilidades de erros (Di Stasi, 1996; Ferreira, 1998). Soma-se a este quadro, a situação da pesquisa de plantas medicinais no país enfrenta dificuldades principal- mente no tocante a recursos financei- ros disponíveis; ausência de instala- ções adequadas; infra-estruturadefici- ente; e falta de massa crítica nas áreas de toxicologia e clínica (Di Stasi, 1996; Ferreira, 1998; Montanari & Bolzani, 2001). Alémdisso,o investimentoempes- quisa e desenvolvimento de fármacos continua incipiente. Os recursos para pesquisa provêm basicamente das agências federais e estaduais de fo- mento,emboraalguns laboratóriospri- vados comecema apostar emparceri- as comasuniversidades, oquepoderá minimizar a defasagem do Brasil em relação a outros países, quanto aos investimentos privados em P&D&I. Uma das dificuldades, porém, para avaliar quantitativa equalitativamente esse investimento é a própria falta de dados sistematizados, específicospara o setor. EstatísticasdaCoordenaçãodePro- gramasdePesquisaemSaúdedoCNPq, por sua vez, mostram apenas um pa- noramageral do investimentoda insti- tuição por área de conhecimento. De 1998 a 2000, o investimento total do CNPqemFarmacologia, incluindobol- sas de estudo e fomento à pesquisa, subiu de R$ 4,6 milhões para R$ 5,6 milhões. Em farmácia, subiu deR$ 2,5 milhões para R$ 3,2 milhões10 . Quadro3: Relação Empresa-Universidade na área de produtos naturais Fonte: Ferreira (1998) e Sant Ana (2002). EMPRESA The Body Shop IRDA,CAEMI Ativos Farmacêutica LaboratórioCatarinense Biossintética Rhodia Aché Diversas Empresas Diversas Empresas Extracta Phytopharmaceuticals (EUA) UNIVERSIDADE UFPA,Depto.Química FEIA-Unicamp e NPN da FINOCRUZ - RJ Unicamp UFSC Depto. Química e Farmacologia e Unicamp Unifesp e USP CPQBA e IQ Unicamp e UFPB Unicamp CPQBA; Unifesp; e USP Incubadora de Empresas - UFPA PADETEC e UFCE IncubadoradeEmpresaBio-Rio ESALQLab.BiotecnologiadaESALQ 9 Os outros gargalos apontados por Ferreira (1998) estão relacionados à internacionalização da indústria farmacêutica brasileira; às dificuldades relacionadas ao suprimento, armazenamento, padronização e cumprimento dos prazos de entrega de matérias-primas; e à oferta de pessoal técnico de bom nível é restrita e a disponibilidade de recursos das empresas para treinamento é limitada. Não podemos deixar de citar também os gargalos relacionados às dificuldades do cumprimento das normas da ANVISA pelas empresas brasileiras. 10 Somente na denominada Demanda expontânea, demanda esta oriunda de pesquisadores e grupos de pesquisas de Universidades e Institutos de pesquisa, quase todos públicos. Grandeparte daproduçãodefárma- cos, no entanto, pode ter origem na pesquisaemQuímica,umadasáreasque mais receberam recursos do CNPq, no anode2000.Odifícil é saber quantodos R$ 22,4 milhões investidos emQuímica se destinaram ao desenvolvimento de fármacos.Outra área que tambémpode gerar produtos farmacológicos é a Bio- química, que recebeu R$ 11,1 milhões do CNPq em 2000, sendo que boa parte do incrementode investimentodoCNPq sedeveaoProgramadeApoioaNúcleos deExcelência (PRONEX)11 , que em Far- macologiaeBioquímica representaqua- se 50% dos recursos de fomento à pes- quisa (ComCiência, 2001). Segundo a Associação Brasileira da Indústria de Fitoterápicos12 - ABIFITO - nãosesabequantoé investidoemP&D&I de medicamentos fitoterápicos. Yunes, Pedrosa e Cechinel (2001) observam que os investimentos em pesquisa por parte da indústria de fitoterápicos foram nulos. No entanto, segundo osmesmos autores, parece haver ummaior interes- se da indústria no desenvolvimento de fitoterápicosou fitofármacos, talvezesti- muladapelanova lei de regulamentação demedicamentos13 ou pela nova Lei de Patentes noBrasil. De fato, as empresasnãoestãoalhei- as aopotencial destemercado.Aempre- sa de produtos comésticos Natura, com faturamentoanualdeR$1,5bilhão, criou uma divisão para investir em medica- mentos fitoterápicos. Comesteobjetivo, comprou e modernizou o laboratório carioca Flora Medicinal em 199914 . A EurofarmaeaBiossintética, percebendo o crescimento deste mercado de medi- camentos, planejam associar-se a uma outra para a criação de uma quarta em- presavoltadaexclusivamenteparaP&D&I de novas drogas, entre elas, fitomedica- mentos15 . Noentanto, emborahajaesforçosna direçãode se fazerP&D&Ide fitoterápi- cos e fitofármacos nas universidades e instituições de pesquisa, tal raramente está associado a empresas o que torna tais empenhos inviáveis paradescober- ta e P&D&Ide fitoterápicos e fitofárma- cos.Provadistosãoospoucosgruposde pesquisa ededesenvolvimentodepro- dutos naturais ligado a empresas como mostradonoQuadro 3. Esta situaçãonos remeteaumaques- tão de fundo no que tange a relação entre a universidade e o setor produti- vo, ou seja, emquepese o crescimento daprodução científica brasileira, o País aindanãoconsegue repassar satisfatori- amenteeste conhecimentogeradopara osetorprodutorde fitofármacosoportu- nizando a criação de novas empresas, registrosdepatentes, criaçãodeempre- gos e desenvolvimento de tecnologias. Não se trata apenasdas resistências, legítimas, oferecidaspelospesquisado- res que temem a privatização da pes- quisa emesmoda capacidade instalada no setor público.O fato équeomodelo funcionará apenas se, alémde recursos financeiros contínuos e regrasmais fle- xíveis, comoanunciaoGoverno16 , hou- ver também um sistema empresarial voltado à busca de inovação e compe- titividade por meio de pesquisa e de- senvolvimento de novos produtos e alvos terapêuticos. Contudo, hádois obstáculos signifi- cativos para que essa vontade semate- rialize.Deum lado, ainda é insuficiente na economia brasileira o peso de uma cultura empreendedora centrada em pesquisa e, de outro está uma política econômica que optou, na última déca- da, poruma intensadesnacionalização. Aopção gerouumciclo de investimen- tos que não privilegiou a instalação de centros de pesquisa no Brasil. Asmulti- nacionais fazempesquisa nos países de origem. Lá funciona o modelo que o Brasil, oportuna,mas tardiamente, quer imitar. Ademais, há que se levar em conta que tais relações não podem ser pensa- das enquanto alternativa do papel do Estadono incentivoenamanutençãoda pesquisaacadêmica.Evidênciadissoéo fato de que mesmo num país como os EUA, onde tais relações estão plena- mente estabelecidas, os consorciamen- tosUniversidade-Empresa respondem, emmédia, por cifras entre 6%e10%dos custosdaspesquisasacadêmicas (Velho, 1997). 3.2) Descompasso entre grupos de pesquisa: Este gargalo foi detectadoporAucé- lio (1999) em estudo visando caracteri- zar as pesquisas quanto ao estágio de desenvolvimento, potencial para a apli- cabilidade epor subáreas funcionais de interesse estratégico para criação de programasde apoio aproduçãode fito- medicamentos. Este estudo foi desen- volvido a partir de 62 de projetos enca- minhados à Coordenação de Ciências Biológicas - COCB - doCNPq, pormeio dedemandaexpontânea, e julgados em maio de 1998, na área de farmacologia. Emboraos resultados sejamparciais, osdados sãoconsistentesedemonstram que tentativas no sentido de se criar programas abrangentes de apoio àpro- dução de fármacos, esbarraria na inex- pressividade,nopaís, dosgruposatuan- tes nas áreas de Farmacologia Clínica e deFarmacocinética, áreasestas conside- radas imprescindíveisnacomposiçãode programas que tenham por objetivo a 11 Apesar desse incremento, algumas instituições acadêmicas queixaram-se da descontinuidade de investimentos, entre elas: o Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Farmacologia da Universidade Federal do Paraná, Departamento de Química da Universidade Federal do Pará, Escola de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo, Núcleo de Pesquisa de Plantas Medicinais da Universidade Federal do Rio de Janeiro e Farmanguinhos da Fundação Oswaldo Cruz (Sant Ana 2002). 12 Comunicação pessoal da presidente da ABIFITO, Dra. Magrid Teski. 13 A nova lei que os autores se referem é a Resolução da Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA - RDC no. 17, de 24 fevereiro de 2000. 14 Informação pessoal da Dra. Elizabete Vicentini, gerente de Tecnologia de Conceitos Avançados da Natura e Dra. Patrícia Machado, médica da Flora Medicinal. 15 Informação pessoal Dr. Carlos Navarro, gerente de Desenvolvimento de Negócios da Eurofarma. 16 O anúncio do anteprojeto da Lei de Inovações, para debate público por 50 dias, é mais um passo do Ministério da Ciência e Tecnologia em favor de um sistema nacional de pesquisa e desenvolvimento. Ademais, a criação do Fundo de Saúde no âmbito dos Fundos Setoriais do MCT poderá ser outra fonte e mecanismo de incentivo a P&D&I. 36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 produção de novos fármacos. Contrastando comodesempenhodas áreas acima mencionadas, as pesquisas nas áreas de Farmacologia Geral, Farma- codinâmica epesquisa básica em toxinas, importantes também para a P&D&I de novos fármacos, apresentamperfil similar ao de países desenvolvidos. O descom- passo entre as áreas observa ainda o autor, acaba por inviabilizar os esforços voltadospara inovação tecnológica, trans- ferência de tecnologias e, também, reali- zaçãodeparcerias comosetor produtivo. Oestudo identificou, ainda, que cerca de 36% das pesquisas, correspondendo a 22 projetos que não foram aprovados, apresentavam potencial para aplicabili- dade a longo prazo. No entanto, tais pesquisas dependeriamde investimentos e incentivos específicos que contribuís- sempara eliminar os gargalos,menciona- dos no parágrafo anterior, e promover a interaçãouniversidade-indústria. Há de se considerar ainda, não tanto comoumgargalo,mas uma característica da cultura acadêmica, que vem a ser a relação entre produtividade científica e publicações. A preocupação dos pesqui- sadores em aumentar o volume de suas publicações, fator considerado importan- te pelo pares na análise do mérito da pesquisa acadêmica, acaba por relegar às prateleiras os produtos de suas pesquisas após os ensaios pré-clinicos, ou seja, ainda inacabados; quando não são re- passados a grupos internacionais ligados à indústria farmacêutica. O paradigma da nossa pesquisa ainda é a publicação de papers, que é uma transferência gratuita de conhecimentos para países aptos a utilizá-los e competir ainda mais com a nossa economia. A falta de uma orientação para o mercadoaliada ao descompasso aponta- do no estudo, avalia Aucélio (1999), tem como conseqüência a inviabilização da continuidade das pesquisas, mesmo ten- do sido promissores os resultados obti- dos no nível pré-clinico. Essa situação, segundo o mesmo autor, é injustificável uma vez que o país já conta com compe- tência instalada neste setor e, além disso, possuí uma inestimável biodiversidade, quedeve sermelhor aproveitada em suas potencialidades econômicas. Investir emP&D&I comeste objetivo, segundo Ferreira (1998) não requereria investimentos vultuosos desde que, além da vontade política para tal, se busque a cooperação entre grupos multidisciplina- res por intermédio de iniciativas que vi- sem o arranjo dos atores necessários para este fim. A seguir analisaremos algumas iniciativas neste sentido. 4)AçõesGovernamentais: O País tem buscado, ao longo das últimas três décadas, agregar sua compe- tência científico-tecnológica para produ- ção de drogas terapêuticas a partir de plantas medicinais oriundas de nossa bi- odiversidade. O primeiro empenho neste sentido, e anterior a abordagemsobreuso sustentável da biodiversidade, foi a Cen- tral de Medicamentos - CEME, por inter- médio do Programa de Pesquisa de Plan- tas Naturais PPPM (Sant Ana, 2002). Noentanto, segundoSant Ana (2002), a CEME não logrou colocar no mercado nacional um medicamento fitoterápico totalmente brasileiro, nãopor ausência de capacidade em harmonizar a competên- cia científico-tecnológica dos diferentes atores, principalmente oriundos do meio acadêmico, mas pela descontinuidade de apoio governamental, a partir de 1990. Contudo, não se pode deixar de reconhe- cer a importância da contribuição da CEME na formação e consolidação de recursos humanos e grupos de pesquisa nas áreas de botânica, agronomia, farma- cologia pré-clinica, toxicologia animal e farmacologia clínica. A conjugação de alguns fatores tais como o crescente interesse por medica- mentos oriundos de plantas medicinais, mais especificamente, os fitomedicamen- tos, às exigências da Convenção sobre Diversidade Biológica no tocante à con- servação e ao uso sustentável dos recur- sos naturais, aliados às potencialidades da pujança da diversidade biológica e cultu- ral brasileiras e a capacidade científica e tecnológica do País têm levado o governo federal a criar programas17 tais como o ProgramaNacional daDiversidadeBioló- gica (PRONABIO), no âmbito doMinisté- rio do Meio Ambiente, com o objetivo de promover a parceria entre o poder públi- co e a sociedade civil na conservação da diversidadebiológica, utilização sustentá- vel dos seus componentes e repartição justa e eqüitativa dos benefícios dessa utilização. Há aindaoProgramadeBiotecnologia e Recursos Genéticos do Ministério de Ciência e Tecnologia que visa estabelecer ações voltadas ao uso sustentável da bio- diversidade, preferencialmente por meio de consorciamentos entre as instituições acadêmicas e o setor produtivo. Estas ações estão sendo implementadas pela Coordenação de Biotecnologia e Recur- sos Genéticos do MCT juntamente com a Coordenação de Biotecnologia e Recur- sos Genéticos do CNPq. Alguns programas de bioprospecção têm sido propostos tanto pelo governo federal quanto estadual voltados, princi- palmente,masnãoexclusivamente, à pro- duçãodemedicamentosoriundosdeplan- tas medicinais e do conhecimento tradici- onal a elas associado. Entretanto, estes programas são ainda recentes e sequer tiveram suas atividades avaliadas como o Programa Brasileiro de Ecologia Molecu- lar paraoUsoSustentável daBiodiversida- de da Amazônia (Probem da Amazônia)18 do MMA e o Programa Mineiro de Bio- prospecção Farmacêutica. Ambos são programas que buscam potencializar a competência científico e tecnológico por intermédio de redes que congregarão instituições de pesquisa, la- boratórios públicos e privados com vistas a consórcios com empresas nacionais ou estrangeiras do setor farmacêutico, cos- mético e agro-industrial mas que, por motivos de ordem muitas vezes política, têm postergado e mesmo prejudicado a implantação de tais programas. Embora estes dois Programas conside- rem o envolvimento e retorno de benefí- cios às comunidades indígenas e tradicio- nais que venham a ter seus conhecimen- tos ematerial biológico acessados, perma- nece incerto como tal se dará dentro de uma cadeia produtiva de bioprospecção para novas drogas terapêuticas. Mais recentemente, o Ministério da Saúde esboçou uma proposta de política denominada Política Nacional de Plantas Medicinais eMedicamentosFitoterápicos, para o ano de 2002, que visa garantir o acesso e uso racional das plantas medici- nais e dos medicamentos fitoterápicos, com segurança, eficácia e qualidade, con- tribuindo assim para o desenvolvimento do setor produtivo farmacêutico privado. Dentre as diretrizes da proposta doMinis- 17 Maiores detalhes sobre programas governamentais voltados à biodiversidade vide ASSAD, A. L. D., 2000, Biodiversidade: Institucionalização e Programas Governamentais no Brasil. Tese de Doutorado, Unicamp, Campinas/SP 18 O PROBEM em seus primeiros anos de funcionamento financiou onze projetos de P&D em diversas instituições de ensino e pesquisa. Fará parte do Probem o Centro de Biotecnologia da Amazônia, parceria entre o MMA, SUFRAMA, MCT e outras instituições que atuam na região amazônica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 37 tério da Saúde para tal política, evidenci- am-se a preocupação com a capacitação e a qualificação de recursos humanos, bem como resgatar, valorizar, embasar cientificamente e validar o conhecimento, a produção e o uso popular de plantas medicinais para o uso como medicamen- tos fitoterápicos (SPS/MS, 2001). No entanto, por se tratar ainda de uma proposta a ser discutida, não fica claro como se harmonizará os interesses dos diferentes atores envolvidos. Contudo, se a presente proposta logrará atrair o enga- jamento da comunidade científica e em- presarial é algo ainda em aberto, uma vez que tal proposta de política se dá no contexto de um ano eleitoral e, portanto, com horizonte um tanto duvidoso no tocante à manutenção desta política pelo o novo governo. Finalmente, não se pode deixar de citar a implantação do Conselho de Ges- tãodoPatrimônioGenético (CGEN), insti- tuídopormeiodaMedidaProvisória 2186- 16 de 23 de agosto de 2001, que têm por objetivo criar mecanismos para agilizar a implementação da referida MP que trata de questões relacionadas ao acesso, re- messa e repartição dos benefícios deriva- dos do uso dos recursos genéticos. Mes- mo com as críticas ao caráter e competên- cias do CGEN, suas atividades foram inici- adas e sepretende estabelecer os procedi- mentos para acesso e remessa depatrimô- nio genético, incluindo as ações de bio- prospecção. 5)Conclusão: Omaior potencial econômico da bio- diversidade está associada à descoberta denovas drogas derivadas diretamenteou sintetizadas a partir de recursos biológi- cos, principalmente plantas medicinais associadas ao conhecimento tradicional. Assim, a competência de um país para desenvolver atividades de bioprospecção está intimamente relacionada com a pró- pria capacidade que este país tem para o desenvolvimentodedrogas terapêuticas a partir de plantas medicinais. Embora haja esforços de se fazer P&D&I de fitomedicamentos no Brasil, tal raramente está associado a empresas o que torna os desempenhos de P&D&I de difícil consecução. Esta situação está as- sociada à dificuldade de, por um lado, a universidade passar os resultados de suas pesquisas para o setor produtivo e este, por sua vez, de buscar a competitividade pormeio de pesquisa e desenvolvimento. Neste sentido, as tentativas brasileiras de aproveitamento da biodiversidade na- cional para produção de fitomedicamen- tos, evidenciam, ao mesmo tempo, a competência científico-tecnológicado país e seus gargalospara atuar emativida- des de bioprospecção. Umaestratégiapossível seria a criação de uma demanda para fitomedicamen- tos, semelhante à adotada pelo Governo para a produção demedicamentos gené- ricos, associada a uma política pró-ativa doGovernoFederal. Estapolíticapoderia incentivar a formação de uma rede com objetivo de ampliar a competência, em âmbito nacional, das atividades de pes- quisa e desenvolvimento, com o supri- mento de apoio financeiro para infra- estrutura laboratorial, formaçãode recur- sos humanos especializados e desenvol- vimento de trabalhosmultiinstitucionais, congregando centros de pesquisa, labo- ratórios oficiais e privados e comunida- des indígenas e tradicionais. Finalmente, existência de regras cla- ras quanto ao acesso e remessa do patri- mônio genético, da partição de benefíci- os derivados da bioprospecção, a im- plantação de ações contínuas de apoio financeiro eo incentivo aprojetos coope- rativos entre universidade-empresa, po- derá permitir um salto de qualidade no parque industrial brasileiro de fitomedi- camentos e a oferta de produtos compe- titivos e inovativos neste mercado de grande potencial econômico. 6)ReferênciasBibliográficas: ASSAD, A. L. D., 2000, Biodiversidade: Institucionalização e ProgramasGo- vernamentaisnoBrasil. TesedeDou- torado, Unicamp, Campinas/SP. AUCÉLIO, J.G., 1999:AnálisedasPropos- tasApresentadasaoCA0598,naÁrea de Farmacologia: uma contribuição visando identificar indicadores, pa- râmetros e gargalos de significado es- tratégiconaconcepçãodeprogramas deapoioaodesenvolvimentocientífico e tecnológico. Circulação Restrita, CNPq,Brasília. BAHRUTH,E.,1999,CadeiaProdutivados Fitoterápicos, Trabalho para Discus- são, Comunicação pessoal. BRASIL, 1998, Primeiro relatório nacio- nalparaaConvençãosobreaDiversi- dadeBiológica:Brasil,MMA,Brasília. BUAINAIN, A.M E SILVA, P.L.B (Coord.), 2000, O setor saúde e complexo da saúde no Brasil. Relatório de Pesqui- sa, vol. I, Unicamp, NEPP, Campinas, SP. CALIXTO, J.B., 2000, Biopirataria: A di- versidade biológica namira da indús- tria farmacêutica. Ciência Hoje, Vol. 28, no. 167, pp. 37-43. COUTINHO, L. & FERRAZ, J.C. (Co- ord.),1993,EstudosobreaCompetitivi- dadeBrasileira.Unicamp,Campinas, S.P. Di STASI, L.C. (org.), 1996, PlantasMedi- cinais:arte eciência.Umguiadeestu- do interdisciplinar. 1 ed., capítulo 3, São Paulo, Ed. UNESP. FERREIRA, S., 1998,MedicamentosaPar- tir de Plantas Medicinais no Brasil. 1 ed., Riode Janeiro,AcademiaBrasilei- ra de Ciências. GARCIA S. E. et al., 1998,Biodiversidade: Perspectivas eoportunidades tecnoló- gicas Fitoterápicos. Disponível no endereço eletrônico http:// www.bdt.org.br. LAPA, A. J. et al., 2001, Validation of Medicinal Plants in Latin America: ReasonsandGoals.Comunicaçãopes- soal. MACHADO, J. A., 2001,TendênciasFutu- rasdaBiotecnologia:perspectivaspara o setor industrial. Comunicação pes- soal. MONTANARI, C. A. & BOLZANI, V. S., 2001, Planejamento Racional de Fár- macos Baseado em Produtos Natu- rais. Química Nova, Vol.24, No. 1, pp. 105-111. COMCIÊNCIA, 2001, Fármacos: Depen- dência & Inovação. Investimento em pesquisade fármacosnoBrasil ainda é pequeno, outubro. Disponível na Internet no endereço http://www. comciencia.br/reportagens/farmacos/ farma11.htm SANT ANA, P. J. P., 2002, È Possível a BioprospecçãonoBrasil?,TesedeDou- torado, COOPE/UFRJ, Rio de Janeiro. SCA/MMA,1998,PROBEM/Amazônia:Es- tudo deMercado, Circulação Restrita, MMA, Brasília. SPS/MS, 2001,PropostadePolíticaNacio- nal de Plantas Medicinais e Medica- mentosFitoterápicos, SecretariadePo- líticas de Saúde, Ministério da Saúde, Brasília. SILVA, C. G & MELLO, L. C. P. (Coord.), 2001,Ciência, tecnologia e inovação: desafiopara sociedadebrasileiraLi- vro Verde. MCT/MCT, Brasília. VELHO, S., 1996, Relações Universidade- Empresa:desvelandomitos. 1ed.,Cam- pinas, Editora Autores Associados. YUNES,R.A.; PEDROSA,R.C.;CECHINEL FILHO,V., 2001, Fármacos eFitoterá- picos: a necessidade do desenvolvi- mento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil, Química Nova, Vol. 24, No. 1, 147-152. 38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 PESQUISA Aplicações biotecnológicas das ectomicorrizas na produção florestalAplicações biotecnológicas das ectomicorrizas na produção florestalAplicações biotecnológicas das ectomicorrizas na produção florestalAplicações biotecnológicas das ectomicorrizas na produção florestalAplicações biotecnológicas das ectomicorrizas na produção florestal Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores Ectomicorrizas: A Face Oculta das Florestas Maurício Dutra Costa Eng. Agrônomo; DS emMicrobiologia Agrícola, UniversidadeFederaldeViçosa (UFV); Professor Adjunto de Microbiologia do Solo mdcosta@ufv.br Olinto Liparini Pereira Eng. Agrônomo,MS emMicrobiologia Agrícola, UFV liparini@bol.com.br Maria Catarina Megumi Kasuya Eng.Agrônomo,DS emAgricultura,Hokkaido University, Japão; Professor Adjunto de Microbiologia do Solo mkasuya@ufv.br Arnaldo Chaer Borges Eng. Agrônomo, PhD emMicrobiologia do Solo, North Carolina State University at Raleigh, EUA; Professor Titular de Microbiologia do Solo chaer@ufv.br INTRODUÇÃO stima-se que, no Brasil, as áre- as reflorestadas com pinho e eucaliptocorrespondamamais de 4,8 milhões de hectares (Sociedade Brasileira de Silvi- cultura, 2002), área em que ocorrem muitos processos e interações ecológicas que passam despercebidos aos olhos desatentos. Silenciosamen- te, as árvores dos plantios desenvolvem uma série de relações ecológicas com diversas populações de macro- e microrganismos. À primeira vista, os sinais desses processos e intera- ções são praticamente im- perceptíveis e, mesmo quandosemanifestam,não são capazes de nos reme- ter ao seu verdadeiro pa- pel.Quando,por exemplo, observamosoaparecimen- to de vários tipos de cogu- melos nos plantios de pi- nho e eucalipto, mal nos damos conta de que essas estruturas seencontramco- nectadas auma redeexten- sa de filamentos fúngicos, os quais estão ligados às raízes das árvores. Esta as- sociação entre fungos do solo e as raízes de algumas espécies arbóreas é denomi- nada ectomicorriza (do grego, ektos = externo;mykes= fungo; rhiza= raiz). Em geral, durante a formação das ectomi- corrizas, as raízes sofrem profundas al- teraçõesmorfológicas e fisiológicas, pas- sando a funcionar de forma integrada e harmoniosa com o fungo, com ganhos na adaptabilidade e na sobrevivência dos simbiontes. Registros fósseis indicam que as associações ectomicorrízicas surgi- ram há pelo menos 50 milhões de anos atrás (Lepage et al., 1997). Por meio da comparação do RNA 18S de alguns fun- gos ectomicorrízicos, estudiosos admi- tem o aparecimento desses organismos há cerca de 130 milhões de anos, duran- te o período cretáceo (Berbee & Taylor, 1993),masos registros fósseis de ectomi- corrizas desta época jamais foram en- contrados.Os fungosmais próximos aos basidiomicetos ectomicorrízicos são sa- profíticos, sugerindo que, na origem, a Figura 1. Corte transversal de ectomicorriza formada por Pisolithus tinctorius no sistema radicular de Pinus pumila, evidenciando o manto fúngico (MF) envolvendo as células da epiderme radicular e a rede de Hartig (RH) formada nos espaços intercelulares da epiderme e do córtex Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 39 associação decorreu da interação entre plantas e este tipo de fungo (Malloch, 1987; Brundrett, 2002). Diversos benefícios decorrem da as- sociação da planta hospedeira com fun- gos ectomicorrízicos. Os filamentos fún- gicos, denominados hifas, retiram das árvores compostos orgânicos necessári- os à sobrevivência do fungo e à produ- ção de novos cogumelos ou basidiocar- pos (Smith&Read, 1997). Emcontrapar- tida, as plantas tornam-semais bem nutridas e apresentammaior sobrevivên- cia e longevidade no campo (Harley et al., 1983). Além desses efeitos diretos sobre os membros da simbiose, os fun- gos ectomicorrízicos desempenham im- portante papel nos ciclos de alguns elementos químicos nos ecossistemas florestais, particularmente no ciclo do nitrogênio e do fósforo (Chambers & Cairney, 1999). Esses fungos são capazes de promover a mineralização de formas orgânicas dos nutrientes e de solubilizar minerais por meio da produção de áci- dos orgânicos, tornando esses elemen- tos mais disponíveis para as plantas (Högberg et al., 1999; Landerweert et al., 2001). A ocorrência de ectomicorrizas altera de forma decisiva o ambiente da rizosfera, levando a novos equilíbrios populacionais, muitas vezes desfavorá- veis aos patógenos do sistema radicular (Garbaye, 1991). As ectomicorrizas ocorrem em cerca de 3% das fanerógamas (Meyer, 1973) e, em regiões temperadas, em 90% das espécies florestais. Já no Brasil, muitas plantas arbóreas de importância econô- mica, usadas na produção de madeira, carvão e celulose, como o Pinus, o Eucalyptus e a Acassia mangium, são capazes de associar-se simbioticamente com fungos, resultando na formação de ectomicorrizas. Tal fato sugere enorme potencial de aplicação de fungos ecto- micorrízicos visando melhorias na pro- dução das florestas com o mínimo de dano ao ambiente. Sob esse escopo, as pesquisas científicas focalizam os as- pectos genéticos, fisiológicos e ecológi- cos da simbiose ectomicorrízica, bem comoodesenvolvimentode tecnologias de inoculação de fungos em viveiros e a manutenção ou aumento da diversidade de fungos ectomicorrízicos nos sítios de plantio. Os avanços na área dão-se a passos largos, com fronteiras já consoli- dadas na área de biologia molecular, genética clássica e genômica. Este artigo visa dar aos leitores uma breve introdução a esse fascinante lado oculto das florestas, trazendo alguns dos principais conceitos da área e alguns resultados de pesquisa sobre ectomicor- rizas. MORFOLOGIADE ECTOMICORRIZAS Asectomicorrizascaracterizam-sepor apresentarem uma camada de hifas, o manto, que recobre as células da epider- me radicular; a rede de Hartig, formada pelo crescimento das hifas nos espaços intercelulares da epidermeedo córtex; e uma redede filamentosque interligamas micorrizas ao solo e aos basidiocarpos [Figuras 1, 2 e 3] (Smith & Read, 1997). Em geral, o manto apresenta apenas uma camada de hifas, podendo, às ve- zes, formar falso tecido parenquimatoso com duas ou mais camadas. Sua organi- zação influencia a absorção de água e nutrientes e a susceptibilidade da planta aos patógenos do solo, funcionando como barreira mecânica contra a pene- tração de patógenos (Peterson & Bon- fante, 1994; Smith&Read, 1997). As hifas do manto são, também, capazes de sintetizar compostos de reserva como o glicogênio,polifosfatos eproteínas (Cha- lot et al., 1991; Peterson & Bonfante, 1994). A espessura domanto varia de espé- cie a espécie e de isolado a isolado, sendo indicativa do grau de compatibi- lidade entre o fungoe aplanta hospedei- ra. Omanto pode apresentar de 20 a 100 µm de espessura, com valores mais freqüentes entre 30 e 40 µm (Ingleby et al., 1993, Agerer, 1994). Nesta faixa, a massa demicélio presente nesta estrutu- ra pode constituir de 25 a 40%damatéria seca da ectomicorriza (Ingleby et al., Figura 2. (A) Raiz não colonizada mostrando a abundância de pêlos radiculares. (B-P) Diferentes tipos morfológicos de ectomicorrizas coletadas em diversas espécies de hospedeiros florestais. (pr) = pêlos radiculares; (r) = rizomorfo; (he) = hifas emanadas 40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 1990, Agerer, 1992; Smith & Read, 1997). As variações na estrutura domanto, as orna- mentações da superfície, a coloração e a presença de rizomorfos são usadas, jun- tamente com testes quími- cos e imunológicos, para a caracterização das ectomi- corrizas e identificação do fungo associado (Ingleby et al., 1990,Agerer, 1992 e Smi- th&Read, 1997). Entretanto, poucos são os fungos que podemser identificadoscom base somente nessas carac- terísticas,necessitando-sedo corpo de frutificação para esse fim (PetersoneBonfan- te, 1994). A partir do manto, as hifas estendem-se externa- mente em todas as direções, conectando-se com o solo, combasidiocarpos hipógios e epígeos e comoutras plan- tas (Figura2).Há,portanto, a formação de extensa rede de conexões, possibilitando a troca de nutriente orgâni- cos e inorgânicos entre dife- rentes organismos.Aexpan- são das hifas aumenta so- bremaneiraovolumedesolo explorado pela planta hos- pedeira associada ao fungo ectomicorrízico, resultando emmaior absorção de nutri- entes e água. A rede de Hartig é constituída de ramificações das hifas entre as células da epiderme e do córtex da raiz, aumentando a interfa- cede contato entre os simbiontes (Figura 1). Esta estrutura constitui o sítio onde acontecem as trocas de metabólitos en- tre a planta hospedeira e o fungo. Na associação ectomicorrízica entre Ama- nita muscaria e Picea abies, as hifas da rede de Hartig formam estruturas com morfologia semelhante a um leque, as quais contêm citoplasma denso com grandenúmerodemitocôndrias e como retículoendoplasmático rugoso freqüen- temente distribuído na mesma direção de extensão da hifa, sugerindo que a transferência ativa de solutos entre o hospedeiro e o fungo dá-se nesta estru- tura (Kottke & Oberwinkler, 1987). Em geral, a rede de Hartig encontra-se limi- tada aos espaços intercelulares da epi- derme das angiospermas, enquanto, nas gimnospermas, a rede de Hartig pode estender-se por várias camadas do cór- tex sem, no entanto, ultrapassar o limite imposto pela endoderme radicular. As hifas e os rizomorfos que surgem a partir das ectomicorrizas cons- tituem as estruturas ligadas à absorção de água e de nutrientes a partir do solo [Figura 2] (Duddridge et al., 1980; Thom- sonet al., 1994; Augé, 2001).Os rizomor- fos podem absorver água e transportá-la a distâncias significativas. O movimento de água através dos rizomorfos ocorre às mesmas taxas de transporte de água do xilema, indicando que a translocação de água dentro dessas estruturas fúngicas ocorrem em favor de um gradiente de potencial hídrico estabelecidopelaplan- ta. As ectomicorrizas podem assumir formas diversas (nodular, piramidal, bi- furcada, coralóide, entre outras), com cores determinadas pela cor do micélio do fungo simbionte (preto, vermelho, amarelo, casta- nho, branco, etc) [Figura 2]. A formação de ectomicorri- zas inibe a formação de pêlos radiculares, os quais são substituídos pelas hifas do fungo (Figura 2). Esta inibição envolve a secreção de compostos indólicos pelo fungo, tais como o ácido indolacético e a hipa- forina, os quais regulam a morfogênese radicular (Di- tengou et al., 2000; Diten- gou & Lapeyrie, 2000). A formação de ectomi- corrizas no campo depen- de de vários fatores do am- biente, tais comoadisponi- bilidadedenutrientes, opH do solo ou do substrato, a temperatura, a disponibili- dade de água e a aeração, a intensidade luminosa, a fi- siologia da planta hospe- deira, as interações commi- crorganismos do solo, a to- xicidade de certos pestici- das, e, também, o tipo e modo de aplicação do inó- culo ectomicorrízico (Kro- pp & Langlois, 1990; Ka- suya, 1988 e 1995; Costa et al.,1997;Smith&Read,1997; Rodrigues et al., 1999;Alves et al., 2001; Augé, 2001). Nas condições de vivei- ro, é desejável que sejam produzidas mudas saudá- veis e vigorosas, sendo o uso liberal de fertilizantes e água a prática adotada para atingir esse obje- tivo. No entanto, níveis de nutrientes crescentes e acima dos valores ótimos para a formação de ectomicorrizas podem resultar na produção demudas semmicorrizas na época do transplan- tio parao campo. As mudas chegam a apresentar bom tamanho e adequada coloração das folhas, mas são de baixo valor para o reflorestamento devido à falta de ectomicorrizas ou a uma rela- ção parte aérea: raiz inadequada (Mi- kola, 1989). FUNGOSEPLANTASECTOMICOR- RÍZICASNOBRASIL As ectomicorrizas são formadas principalmente pelos fungos das sub- divisões Basidiomycota e Ascomycota (Figura 3). Embora menos comuns, Figura 3. Basidicarpos de fungos ectomicorrízicos, produzidos durante a associação do fungo com raízes de árvores hospedeiras compatíveis. (A) Boletus; (B) Russula; (C) Tricholoma; (D) Suillus; (E) Scleroderma; (F) Rhizopogon; (G) Geastrum; (H) Pisolithus Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 41 outros fungos anamórficos ou perten- centes à subdivisão Zygomycota po- dem também formar ectomicorrizas. Nos plantios de eucalipto do Brasil, relata-se a ocorrência de corpos de frutificação de Pisolithus, Clavaria, Sclerodermabovista, S.uruguayensis e Telephoraterrestris (Schwan,1984,Gui- marães, 1993, Coelho et al., 1997). Em plantios de Pinus, as espécies de fun- gos ectomicorrízicos mais freqüente- mente encontradas são Inocybe lanu- ginella, Scleroderma fuscum, Suillus granulatus,Rhizopogonnigrescens,R. reaiieR. roseolus (Krügner&Tomaze- llo Filho, 1981;Kasuya, 1988). Recente- mente, a ocorrência de basidiocarpos de Sclerodermaverrucosum foi obser- vada em pomares de noz pecã, Carya illinoinensis, no Estado de Minas Ge- rais (Ribeiro, 2001). No estado de São Paulo, há relato da ocorrência de esporocarpos de Tulostoma spp., próximo ao sistema radicular de diferentes espécies nati- vas do cerrado brasileiro. Em Kiel- meyera coriaceae e Xylopia aromati- ca, emassociação comTulostomabec- carianum, observa-se a presença de manto fúngico e rede de Hartig em raízes dessas espécies, confirmando- se a ocorrência de ectomicorrizas (Ba- seia & Milanez, 2002). Ectomicorrizas são, também, observadas em outras espécies do cerrado, como a Bauhi- nia holophila (Fabaceae) e a Campo- manesia coeruelea (Myrtaceae) (Tho- mazini, 1974). Embora o número de espécies de plantas que formam ectomicorrizas seja relativamente baixo (3% das fane- rógamas;Meyer, 1973), várias espécies de fungos são formadoras de ectomi- corrizas (cerca de 6.000 espécies; Mo- lina et al., 1992). Em florestas na Amé- rica do Norte já foram identificadas mais de 2.100 espécies fúngicas (Marx et al., 1982) e, na Austrália, mais de 2.000 (Castellano & Bougher, 1994). Com os avanços na área de biologia molecular, algumas técnicas vêm sen- doempregadaspara a identificaçãodo fungo associado a micorrizas indivi- duais (Kikushi et al., 2000) ou mesmo para se determinar a composição e a dinâmica da população de espécies fúngicas ectomicorrízicas em plantios ou florestas naturais (Glenet al., 2001a; 2001b; Glen et al., 2002). No Brasil, os levantamentos de espécies vegetais e fúngicas, nativas e ectomicorrízicas, são incipientes, sugerindo a urgência em se identificar os recursos genéticos disponíveis e o papel da simbiose ecto- micorrízica nos ecossistemas do cerra- do, nas florestas nativas e nos plantios com espécies exóticas (Figura 4). BENEFÍCIOSDAASSOCIAÇÃOEC- TOMICORRÍZICA A essencialidade da associação ecto- micorrízica para o crescimento e o de- senvolvimento de algumas espécies flo- restais em condições naturais é demons- trada pelo clássico exemplo dos plantios de pinho em Porto Rico. A introdução dessa planta só foi possível com a intro- dução concomitante de fungos ectomi- corrízicos compatíveis (Vozzo & Ha- ckskaylo, 1971). As ectomicorrizas são associações mutualistas nas quais am- bos os parceiros derivam benefícios da vida em simbiose. A associação com as plantas hospedeiras permite ao micobi- onte extrair destas os carboidratos ne- cessários ao crescimento das hifas e à formação dos basidiocarpos ou cogu- melos, bemcomocompletar seu ciclo de vida (Smith&Read, 1997).Os benefícios da associação ectomicorrízica para as plantas estão bem documentados, justi- ficando o enorme interesse biotecnoló- gico neste tipo de associação. Em geral, a associação com fungos ectomicorrízi- cos propicia aumentos no crescimento, na absorção de nutrientes e de água pela planta hospedeira [Figura 5] (Marschner &Dell, 1994; Augé, 2001),maior tolerân- cia a patógenos radiculares (Marx, 1972; Cordier et al., 1998), maior tolerância a metais pesados (Brunner& Frey, 2000) e maior tolerância a extremos de tempera- tura (Marx et al., 1970; Marx & Bryan, 1971). Vários mecanismos já foram pro- postos para explicar esses benefícios para a planta hospedeira. A absorção de nutrientes pela planta gera uma zona de reduzida con- centração de nutrientes ao redor das raízes, especialmente para aqueles ele- mentos químicos de baixa mobilidade no solo. As hifas fúngicas, associadas às raízes da planta hospedeira, são capazes de ultrapassar essa região de baixa con- centração de nutrientes, indo explorar regiões além do alcance das raízes. Os fungos ectomicorrízicos têm também a habilidade de tornar disponíveis certas formas de nutrientes presentes no solo que estão naturalmente indisponíveis para os vegetais. As hifas fúngicas são capazes de secretar ácidos orgânicos, tais como o ácido cítrico e o oxálico, capazes de solubilizar o fósforo precipi- tado com Al, Fe e Ca, tornando-o dispo- nível para a planta (Lapeyrie et al., 1991; Heinrich et al., 1988; Landerweert et al., 2001). Amaior reservade fósforodo solo corresponde ao fósforo orgânico, ligado a compostos de carbono, o qual pode ser disponibilizado para as plantas pela ação de enzimas fosfatases produzidas pelo fungo (Costa, 1997). Além desses mecanismos, a produção de proteinases extracelulares e amaior longevidadedas raízes associadas aos fungos ectomicor- rízicos contribuem significativamente para a melhor nutrição vegetal (Smith & Read, 1997; Dahm & Strzelczyk, 1995; Chambers & Cairney, 1999). As plantas associadas aos fun- gos ectomicorrízicos são mais capazes de absorver água do solo, tornando-se mais resistentes à seca (Augé, 2001). A maior absorção de água dá-se pelo au- mento do volume de solo explorado pelas hifas fúngicas, a maior área de absorção das hifas comparadas à das raízes, o transporte de água a longas distâncias pelos rizomorfos, ao maior acesso das hifas a microporos do solo preenchidos comágua, entre outrosme- canismos (Duddridge et al., 1980; Thom- son et al., 1994; Smith & Read, 1997; Figura 4. Coleta de basidiocarpos de fungos ectomicorrízicos em floresta de eucalipto para posterior identificação e isolamento em cultura pura 42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Augé, 2001). Freqüentemente, tem-se observado que as plantas associadas aos fungos ectomicorrízicos tornam-se mais tole- rantes aos patógenos do sistema radicu- lar (Perrin, 1985). Vários mecanismos já foram propostos para explicar esse fato, dentre os quais pode-se citar a presença do manto, barreira mecânica à penetra- ção de patógenos, a produção de antibi- óticos e ácidos pelo fungo ectomicorrí- zico, a competição por sítios de infecção e por nutrientes, a indução de respostas de defesa na raiz, a melhoria do estado nutricional das plantas e modificação das condições da rizosfera que desen- corajam o estabelecimento de patóge- nos (Perrin, 1987; Rasanayagam& Jeffri- es, 1992; Smith & Read, 1997). A maior tolerância a metais pesados advémda secreção de compos- tos quelantes pelo fungo, reduzindo a disponibilidadedometal para asplantas, da ligação do metal ao micélio extrama- tricial, da adsorção do metal ao manto, da compartimentalização de metais em vacúolos fúngicos, da síntese demetalo- tioneínase fitoquelatinas (Nogueira,1996; Howe et al., 1997; Godbold et al., 1998; Marschner et al., 1998; Brunner & Frey, 2000). As ectomicorrizas também fornecem proteção às plantascontra extremos de temperatura por meio de mecanismos ainda não conhecidos, mas que podem advir da síntese de proteínas heat-shock e dos efeitos indiretos da melhor nutri- ção e da modificação das relações hídri- cas nas plantas micorrizadas (Marx et al. 1970; Marx & Brian 1971; Augé, 2001). As ectomicorrizas constituem um componente importante para a ciclagem de nutrientes e contribuem para o equi- líbrio dos fluxos desses elementos em ecossistemas florestais (Fitter, 1991; Smi- th & Read, 1997; Buscot et al., 2000). Em conjunto, esses atributos favorecem o estabelecimentoeodesenvolvimentode plantas exóticas, como o Pinus e o Eucalyptus, especialmente emsítios com condições ambientais adversas. Nos lo- cais de plantio, a utilização de mudas inoculadas com isolados fúngicos efici- entes pode contribuir para aumentar a produtividade florestal e reduzir a neces- sidade do uso de fertilizantes. ESPECIFICIDADE FUNGO-HOSPEDEIRO As associações ectomicorrízicas co- mumenteapresentamespecificidade fun- go-hospedeiro, manifestada principal- mente entre gêneros e, em alguns casos, até mesmo entre espécies (Molina et al., 1992;Oliveira et al., 1994).Ocrescimento de Eucalyptus dunii, E. citriodora, E. saligna, E. urophylla, E. grandis, E. ca- maldulensis e E. cloesiana varia quando mudas dessas espécies são inoculados com diferentes isolados de fungos ecto- micorrízico dos gênerosPisolithus, Scle- roderma e Paxillus (Comerlato,1991). Testes com 31 isolados de Pisolithus sp., originários de diferentes regiões geográ- ficas e hospedeiros, mostraram grande variação na colonização das raízes de E. grandis e de E. urophylla (Pereira et al., 1997). Todos os isolados provenientes de eucalipto formaram micorrizas com ambas as espécies de Eucalyptus, o mesmo ocorrendo com 10 dos 11 isola- dos provenientes de Pinus sp. e dois provenientes de hospedeiros desconhe- cidos. Embora os isolados provenientes dePinus tenham formadomicorrizas em eucalipto, a percentagem de coloniza- ção foi extremamente baixa. As caracte- rísticas mais contrastantes entre as mi- corrizas formadas pelos isolados prove- nientes de Eucalyptus sp. e de Pinus sp., quando inoculados em eucalipto, foram a coloração e a forma dasmicorrizas. Em um trabalho subseqüente, utilizando esses mesmos isolados de Pisolithus ob- servou-se que os fungos originalmente isolados de Pinus formavam micorrizas tanto em Pinus oocarpa como em P. taeda. Porém, nenhum dos isolados de eucalipto formou micorriza com essas espéciesvegetais (Pereira&Kasuya,1999; Pereira et al, 2000). Estudos utilizando as técnicas de RAPD-PCR (Junghans et al., 1998), PCR-RFLP de rDNA (Gomes et al., 1999), ITS (internal transcribed spacer) e DNA mitocondrial (Gomes et al., 2000) têm sugerido que esses isolados perten- cem a diferentes espécies fúngicas que diferem grandemente na compatibilida- de com Pinus e Eucalyptus. Também, alguns isolados de Pisoli- thus são compatíveis com plantas clo- nais obtidas de árvores maduras, mas sãopraticamente incompatíveiscomplan- tas clonais obtidas a partir de mudas jovens, sugerindo que o estádio de de- senvolvimento ematuridade das plantas influenciam a compatibilidade entre o fungo e a planta hospedeira (Tonkin et al., 1989). Os relatos de especificidade emnível de gênero, baseiam-se principalmente na ocorrência de determinados esporo- carpos em associação a hospedeiros específicos, demonstrando a importân- cia da planta para a finalização do ciclo de vida do fungo na natureza (Molina & Trappe, 1982). Em condições artificiais de laboratório, os fungos ectomicorrízi- cos podem se associar a vários hospe- deiros. Entretanto, as ectomicorrizas for- madas comumente desenvolvem carac- terísticasmorfológicas anômalasouapre- sentam-se menos desenvolvidas quan- do comparadas a ectomicorrizas obtidas a partir de isolados tipicamente associa- dos ao hospedeiro no campo (Molina & Trappe, 1982).Hipotetiza-se que a gama dehospedeiros de fungos ectomicorrízi- Figura 5. Crescimento de Eucalyptus grandis inoculado com diferentes isolados de Pisolithus sp. (M5, 35, PT 90A). C = controle, sem inoculação Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 43 cos é bem mais limitada na natureza do que em inocula- ções in vitro (Harley&Smith, 1983). Na Austrália, apesar da enormediversidade de fungos ectomicorrízicos associados a Eucalyptus, plântulas exóticas depinhosóprosperaramquan- do fungos específicos de pi- nho foram introduzidos nos viveiros australianos (Mikola, 1970). Assim como os recentes estudos sobre os mecanismos envolvidos em interações en- tre fungos fitopatogênicos e plantas hospedeiras, as ques- tões relativas à especificidade e compatibilidade entre fun- gos ectomicorrízicos e seus hospedeiros, vêm sendo estu- dadas commais profundidade pelo uso de técnicas moder- nas de bioquímica, microsco- pia eletrônica e genéticamole- cular, a fim demelhor elucidar os mecanismos envolvidos no reconhe- cimento fungo-planta. PRODUÇÃODE INOCULANTESDE FUNGOSECTOMICORRÍZICOS A inoculação de fungos ectomicorrí- zicos visando à produção de mudas mais vigorosas e resistentes às condições de estresse de campo é uma das princi- pais aplicações biotecnológicas potenci- ais das ectomicorrizas. Várias formula- ções de inoculantes já foram desenvol- vidas, cada uma delas apresentando algumas vantagens e desvantagens (Mo- lina & Trappe, 1982; Brundrett et al., 1996; Costa et al., 1997; Rodrigues et al., 1999; Alves et al., 2001). Em geral os inoculantes apresentamformulaçõesque permitem a sua aplicação diretamente no substrato de plantio das mudas, nos próprios tubetes ou similares, ou nas raízes nuas. Ousode soloou serapilheira conten- do propágulos fúngicos é o tipo mais simples de inóculo.Noentanto, este tipo de material é usado sem qualquer trata- mento, podendo servir como fonte de patógenos, pragas e plantas invasoras para os viveiros ou áreas cultivadas. Plantas micorrizadas naturalmente podem servir de fonte de inóculo para plantas não colonizadas nos viveiros, bastando, para isso, que o micélio asso- ciado às plantas colonizadas infectem as raízes das plantas não colonizadas. No entanto, a introdução dessas plantas nos viveiros pode ocasionar a disseminação de doenças e pragas, comprometendo o controle fitossanitário. Os esporos ectomicorrízicos, produ- zidos embasidiocarpos, podem também ser usados na forma de pó, suspensão ou peletizados. As principais limitações deste tipo de inóculo são a sazonalidade da produção de basidiocarpos, a quan- tidade limitada de basidiocarpos dispo- níveis para a fabricação do inoculante, a viabilidade dos esporos e o tempo rela- tivamente longo entre a inoculação e a formação de ectomicorrizas. Também, ao se fazer a inoculação com esporos, não há possibilidade de seleção dos melhores indivíduos fúngicos que irão formar ectomicorrizas com a planta hos- pedeira. No entanto, a facilidade de aplicação desse tipo de inoculante e o seu reduzido custo têmestimuladoouso de esporos nos viveiros e o desenvolvi- mento de pesquisas que visem contor- nar as principais limitações desse tipode material. O micélio vegetativo pode também ser utilizado em diversas formulações. Em geral, o fungo é cultivado em subs- trato líquido, triturado e aplicado como suspensãomicelial.Os fragmentosoriun- dos da trituração podem, também, ser encapsulados em esferas de alginato de cálcio para a aplicação direta ao sistema radicular durante o transplantio ou para adição ao substrato de crescimento das mudas (Figura 6). Alternativamente, o micélio fúngico pode ser cultivado em substratos sólidos constituídosda mistura de componentes como a turfa e a vermiculita [Figura 6] (Costa et al., 1997; Alves et al., 2001). Os inoculantes assim pro- duzidos são aplicados mistura- dos ao substrato de plantio das mudas adiferentespercentagens,promovendo ganhos no cresci- mento das mudas. A vermiculita presente nessas formulações ofe- rece proteçãomecânica aomicé- lio fúngico que cresce nos inters- tícios das lâminas desta argila, reduzindograndemente as injúri- as mecânicas impostas às hifas. A produção de inócu- lo em escala industrial requer consideráveis investimentos tan- to da parte de agências do gover- no como das empresas privadas do setor florestal. Embora a tec- nologia para a produção de ino- culantes de diversos tipos já exis- ta, a produção em grande escala é limitada devido à reduzida de- manda do mercado brasileiro e a inexis- tência de trabalhos no país que compro- vem contundentemente ganhos signifi- cativos na produtividade de plantios comerciais iniciados com mudas micor- rizadas. Além disso, a tecnologia de produção de mudas florestais em vivei- ros comerciais desenvolveu-se, emgran- de parte, sustentada pelo paradigma da intensa fertilização química, desencora- jando a adoção de técnicas biotecnoló- gicas alternativas, como a micorrização de mudas nos viveiros. PERSPECTIVASBIOTECNOLÓGICAS PARAFUNGOS ECTOMICORRÍZICOS Fungos ectomicorrízicos têm sido usados para inoculação de mudas em viveiros florestais na Austrália, China, Estados Unidos, França, Brasil, entre outros países. Além, dos benefícios clás- sicos associados aomaior crescimento e sobrevivência de plantas micorrizadas no campo, o advento de técnicas mole- culares abrem novas possibilidades de desenvolvimentode fungos ectomicorrí- zicos geneticamente modificados com várias aplicações potencias. Os fungos ectomicorrízicos podem ser transforma- dos de forma a expressarem toxinas inseticidas, tais como as proteínas tóxi- cas deBacillus thuringiensis ou inibido- res de proteinases, ambos de uso poten- cial na proteção das raízes contra pragas de coleópteros e lepidópteros noestágio Figura 6. Inoculantes de fungos ectomicorrízicos: (A) Micélio em turfa:vermiculita; (B) Micélio em beads de alginato de cálcio. Teste de viabilidade de inoculantes em placas de Petri: (C) Inoculante turfa:vermiculita; (D) Inoculante beads de alginato de cálcio 44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 larval (Hiremath&Podila, 2000). Fungos ectomicorrízicos podem, também, ser modificados no sentido de expressarem determinadascaracterísticasquevenham a modificar micro-ambientes desfavorá- veis ao redor das raízes devido à presen- ça de poluentes ou metais pesados. Por exemplo, fungos geneticamentemodifi- cados capazes de expressar fatores que- lantes de metais pesados na rizosfera da plantahospedeirapodemcontribuirpara diminuição da absorção desses elemen- tos. Alémdisso, fungos ectomicorrízicos geneticamente modificados podem atu- ar como agentes de controle biológico de doenças fúngicas e bacterianas por meio da expressão de genes específicos envolvidos na redução ou inibição das populações de patógenos. A obtenção de fungos ectomi- corrízicos melhorados geneticamente requer o desenvolvimento de técnicas de mutagênese e de transformação que permitamgerar indivíduos comas carac- terísticas desejáveis (Figura 7). As técni- cas de mutagênese com agentes quími- cos ou radiação ultravioleta requerem o desenvolvimentodeprotocolos otimiza- dos para a produção de protoplastos. Já a irradiação de esporos, visando à pro- dução de mutantes, mostra-se inviável até o presente devido às baixas taxas de germinação in vitro obtidas para muitos fungos ectomicorrízicos. Algumas áreas de pesquisa, como o estudo dos genes relacionados à simbi- ose,mostram-sebastante desenvolvidas, abrindo novas perspectivas para o en- tendimento da associação e a possibili- dade de manipulação genética de fun- gosectomicorrízicos (Voiblet et al., 2001). As técnicas de differential display e de microarrays são particularmente pro- missoras para determinar-se quais genes têm papel preponderante no estabeleci- mento da simbiose e quando estes são expressos durante a diferenciação das ec- tomicorrizas (Figura 7). A face oculta das florestas de eucalipto e pinho no Brasil, no que se refere a ectomicorrizas, está sendodesenhada com os cuidados e rigores da boa ciência para ampliar as possibilidades de aplicação dessa simbiose em benefício da socieda- de. REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS AGERER,R.Characterizationof ectomycor- rhiza. In: NORRIS, J. R., READ, D. J. ANDVARMA,A.K. (eds.)Techniques for mycorrhizal research. San Die- go: Academic Press, 1992. p.25-74. ALVES, J. R.; SOUZA, O.; PODLECH, P. A.; GIACHINI, A. J.; OLIVEIRA, V. L. O. Efeito de inoculante ectomicorrízico produzido por fermentação semi-sóli- da sobre o crescimento de Eucalyptus dunniiMaiden.Pesp.agropec.bras., v.36, p.307-313, 2001. AUGÉ, R. M. Water relations, drought and vesicular-arbuscular mycorrhizal sym- biosis.Mycorrhiza, v.11, p.3-42, 2001. BASEIA, I. G. & MILANEZ, A. I. Tulostoma Persoon (Gasteromycetes) from the cerrado region, state of São Paulo, Brazil. Acta bot. bras., v.16, p.9-14, 2002. BERBEE,M. L. & TAYLOR, J.W.Dating the evolutionary radiations of the true fun- gi.Can.J.Bot., v.71,p.1114-1127, 1993. BRUNDRETTM.; BOUGHER,N.;DELL, B.; GROVE, T.;MALAJCZUK,N.Working with mycorrhizas in forestry and agriculture - ACIARMonograph32. Canberra: Pirie Printers, 1996. 374p. BRUNDRETT, M. C. Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants. New Phytol., v.154, p. 275-304, 2002. BRUNNER, I. & FREY, B. Detection and localization of aluminum and heavy metals inectomycorrhizalNorwayspru- ce seedlings. Environ. Poll., v.108, p.121-128, 2000. BUSCOT, F.;MUNCH, J. C.; CHARCOSSET, J. Y.; GARDES,M.; NEHLS, U.; HAMPP, R. Recent advances in exploring physi- ology and biodiversity of ectomycor- rhizas highlight the functioning of the- se symbioses in ecosystems. FEMSMi- crobiol. Rev., v.24, p. 601-614, 2000. CASTELANO, M. A. & BOUGHER, N. L. Consideration of the taxonomy and biodiversity of Australian ectomycor- rhizal fungi. In: ROBSON, A. D.; AB- BOTT, L. K.; MALAJCZUK, N. (eds.) Managementofmycorrhyzasinagri- culture, horticulture and forestry. Netherlands: Kluwer Academic Publi- FIGURA 7. Estratégia geral para o estudo de genes relacionados à simbiose na associação entre Pisolithus sp. e a planta hospedeira Eucalyptus sp. (Adaptado de Costa et al., 2002) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 45 sher, 1994. p.37-46. CHALOT,M.; STEWART,G.R.;BRUN,A,; MARTIN, F.; BOTTON, B. Ammo- nium assimilation by spruce-Hebelo- ma sp. ectomycorrhizas. New Phytol., v.119, p.541-550, 1991. CHAMBERS, S. M. & CAIRNEY, J. W. G. Pisolithus. In: CAIRNEY, J. W. G. & CHAMBERS, S.M. (eds.)Ectomycor- rhizal fungi:keygenerainprofile. Berlin: Springer-Verlag, 1999. p. 1-31. COELHO, F. C.; BORGES, A. C.; NEVES, J.C. L.;BARROS,N.F.;MUCHOVEJ,R. M. C. Caracterização e incidência de fungos micorrízicos em povoamen- tos de Eucalyptusgrandis eEucalyp- tuscamaldulensis, nosmunicípiosde Botucatu, São JosédosCampos e São MiguelArcanjo, SãoPaulo.Rev.Árv., v.21, p.563-573, 1997. COMERLATO, A. G. Especificidade e eficiência de fungos ectomicorrízi- cos para Eucalyptus. Viçosa: UFV, 1991. 57 p. Dissert. (Mestrado em Microbiologia Agrícola) CORDIER, C.; POZO,M. J.; BAREA, J.M.; GIANINAZZI, S.;GIANINAZZI-PEAR- SON,V. Cell defense responses asso- ciated with localized and systemic resistance to Phytophthora parasiti- ca induced in tomato by an arbuscu- lar mycorrhizal fungus. Mol. Plant- MicrobeInteract.,v.11,p.1017-1028, 1998. COSTA, F. A. Atividade de fosfatases ácidas em fungos ectomicorrízicos. Viçosa:UFV,1997. 46p.Dissert. (Mes- trado em Microbiologia Agrícola) COSTA,M.D., BORGES, A. C., KASUYA, M.C.M.,QUEIROZ,M.V. Physiology and genetics of ectomycorrhiza for- mation in the Pisolithus-Eucalyptus symbiosis. In: ALVAREZ V., V. H., SCHAEFER, C. E. G. R., BARROS, N. F., MELLO, J. W. V., COSTA, L.M. Tópicosemciênciadosolo/publi- cação da Sociedade Brasileira de Ciência do Solo. vol. 2. Viçosa: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2002. p.143-193. COSTA, M. D.; FERNANDES, R. C. R.; KASUYA, M. C. M; BORGES, A. C. Produçãode inoculantedePisolithus tinctorius em mistura de turfa e ver- miculita enriquecida com meios de cultura com diferentes relações C:N. XXVI Congresso Brasileiro de Ciên- cia do Solo, Rio de Janeiro, Julho, 1997. DAHM, H. & STRZELCZYK, E. Impact of vitamins on cellulolytic, pectolytic and proteolytic activity of mycorrhi- zal fungi. Symbiosis, v.18, p.233- 250, 1995. DITENGOU, F. A.; BÉGUIRISTAIN, T., LAPEYRIE, F. Root hair elongation is inhibitedbyhypaphorine, the indole alkaloid from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius, and res- toredby indole-3-acetic acid.Planta, v.211, p.722-728, 2000. DITENGOU, F. A. & LAPEYRIE, F.Hypa- phorine from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius counte- racts activities of indole-3-acetic acid andethylenebut not synthetic auxins in eucalypt seedlings. Mol. Plant- Microbe Interact., v.13, p.151-158, 2000. DUDDRIDGE, J.A.;MALIBARI,A.;READ, D. J. Structure and functionofmycor- rhizal rhizomorphswith special refe- rence to their role in water transport. Nature, v. 287, p.834-836, 1980. FITTER, A. H. Costs and benefits of mycorrhizas: implications for functi- oning under natural conditions. Ex- perientia, v.47, p. 350-355, 1991. GARBAYE, J. Biological interactions in themycorrhizosphere.Experientia, v.47, p.370-375, 1991. GLEN,M.;TOMMERUP, I.C.;BOUGHER, N. L.; OBRIEN, P. A. Are Sebacinace- ae common and widespread ec- tomycorrhizal associates of Eucalyp- tus species in Australian forests? Mycorrhiza, v.12, p.243-247, 2002. GLEN,M.;TOMMERUP, I.C.;BOUGHER, N. L.;OBRIEN, P. A. Interspecific and intraspecific variation of ectomycor- rhizal fungi associatedwith Eucalyp- tus ecosystemsas revealedby riboso- mal DNA PCR-RFLP. Mycol. Res., v.105, p.843-858, 2001a. GLEN,M.;TOMMERUP, I.C.;BOUGHER, N. L.; OBRIEN, P. A. Specificity, sen- sitivity and discrimination of primers for PCR-RFLP of larger basidiomyce- tes and their applicability to identifi- cation of ectomycorrhizal fungi in Eucalyptus forests and plantations. Mycol.Res., v.105,p.138-149, 2001b. GODBOLD,D.L.; JENTSCHKE,G.;WIN- TER,S.&MARSCHNER,P.Ectomycor- rhizasandameliorationofmetal stress in forest trees.Chemosphere, v. 36, p.757-762, 1998. GOMES, E. A.; ABREU, L. M.; BORGES, A. C.; ARAÚJO, E. F. ITS sequences and mitochondrial DNA polymor- fisminPisolithus spp. isolates.Mycol. Res., v.104, p.911-918, 2000. GOMES, E. A.; BARROS, E. G.; KASUYA, M. C. M.; ARAÚJO, E. F. Molecular characterization of Pisolithus spp. isolates by rDNA PCR-RFLP.Mycor- rhiza, v.8, p.1897-202, 1999. GUIMARÃES, L. G. Caracterização de fungos micorrízicos em povoamen- tos de Eucalyptus spp. em Aracruz e São Mateus, Espírito Santo e Dioní- sio,MinasGerais. Viçosa: UFV, 1993. 46p.Dissert. (MestradoemMicrobio- logia Agrícola) HARLEY, J. L. H. & SMITH, S . E.Mycor- rhizalsymbiosis.Newyork,Acade- mic Press Inc., 1983. 483p. HEINRICH, P. A., MULLIGAN, D. R., PATRICK, J. W. The effect of ec- tomycorrhizas on the phosphorus and dry weight acquisition of Eu- calyptus seedlings.PlantSoil, v.109, p.147-149, 1988. HIREMATH, S. T. & PODILA, G. K. Developmentof genetically enginee- red mycorrhizal fungi for biological control. In: PODILA,G. K.&DOUDS JR.,D.D. (eds)Currentadvances in mycorrhizaeresearch. St.Paul:APS Press, 2000. p. 179-187. HÖGBERG, P.; PLAMBOECK, A. H.; TAYLOR,A. F. S.; FRANSSON,PM.A. Natural 13C abundance reveals tro- phic status of fungi andhost-origin of carbon inmycorrhizal fungi inmixed forests. PNAS, v.96, p. 8534-8539, 1999. HOWE,R.; EVANS,R. L.&KETTERIDGE, S.W. Copper-binding proteins in ec- tomycorrhizal fungi. New Phytol., v.135, p.123-131, 1997. INGLEBY, K.; MASON, P. A.; LAST, F. T.; FLEMING, L. V. Identification of mycorrhizae. London, Institute of Terrestrial EcologyResearchPublica- tion, 1990. 111p. JUNGHANS, D. T.; GOMES, E. A.; GUI- MARAES, W. V.; BARROS, E. G.; ARAÚJO,E. F.Geneticdiversityof the ectomycorrhizal fungusPisolithustinc- torius based on RAPD-PCR analysis. Mycorrhiza, v.7, p.243-248, 1998. KASUYA,M. C. M. Ecological and physi- ological studies on ectomycorrhizae of Picea glehnii (Fr. Scm.) Masters. Sapporo:HokkaidoUniversity, 1995. 134p. Dissert. (Doutorado em Agri- cultura) KASUYA, M. C. M. Seleção de fungos ectomicorrízicos para utilização em programasdemicorrização controla- da em Pinus: estudos ecológicos e fisiológicos em síntese in vitro. Vi- çosa: UFV, 1988. 61p. Dissert. (Mes- trado em Microbiologia Agrícola) KIKUCHI, K.; MATSUSHITA, N.; GUE- RIN-LAGUETTE, A.; OHTA, A.; SU- ZUKI, K. Detection of Tricholoma matsutake by specific ITS primers. 46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Mycol.Res., v.104,p.1427-1430, 2000. KOTTKE, I. & OBERWINKLER, F. The cellular structure of the Hartig net: coenocytic and transfer cell-like orga- nization. Nord. J. Bot., v. 7, p. 85-95, 1987. KROPP,B.&LANGLOIS,C.G.Ectomycor- rhizae in reforestation. Can. J. For. Res., v.20, p.438-451, 1990. KRUGNER, T. L. & TOMAZELLO FILHO, M. Ocorrência de micorrizas de Pinus e identificação dos fungos associa- dos. Piracicaba-SP, Instituto de Pes- quisas e Estudos Florestais, 1981. 7p. (circular técnica). LAPEYRIE, F., RANGER, J., VAIRELLES,D. Phosphate-solubilizing activity of ec- tomycorrhizal fungi in vitro. Can. J. Bot., v.69, p.342-346, 1991. LANDERWEERT, R.; HOFFLAND, E.; FIN- LAY, R. D.; KUYPER, T. W.; van Bree- men, N. Linking plants to rocks: ec- tomycorrhizal fungimobilizenutrients from minerals. Trends in Ecology andEvolution, v.16, p.248-254, 2001. LEPAGE, B. A, CURRAH, R. S., STOCKEY, R. A., ROTHWELL, G. W. Fossil ec- tomycorrhizae from the Middle Eoce- ne.Am. J. Bot., v.84, p.410-412, 1997. MALLOCH,D. The evolution ofmycorrhi- zae.Can. J. Plant Pathol., v.9, p.398- 402, 1987. MARCHNER, H. & DELL, B. Nutrient up- take in mycorrhizal symbiosis. Plant Soil, v.159, p.89-102, 1994. MARSCHNER,P.; JENTSCHKE,G.&GOD- BOLD,D. L. Cation exchange capacity and lead sorption in ectomycorrhizal fungi.PlantSoil, v. 205, p.93-98, 1998. MARX, D. H.; RUEHLE, J. L.; KENNEY, D. S.; CORDELL, C. E.; RIFFLE, J. W.; MOLINA, R.; PAWUK,W. H.; NAVRA- TIL, S.; TINUS,R.W.;GOODWIN,O.C. Commercial vegetative inoculum of Pisolithus tinctorius and inoculation techniques for development of ec- tomycorrhizaeoncontainer-growntree seedlings.For.Sci., v.28,373-400,1982. MARX, D.H. & BRYAN, W.C. Influence of ectomycorrhizae on survival and gro- wth of aseptic seedlings of loblolly pine at high temperature. For. Sci., v.17, p.37-41, 1971. MARX, D.H. Ectomycorrhizae as biologi- cal deterrents topathogenic root infec- tion. Ann. Rev. Phytopathol., v.10, p.426-434, 1972. MARX,D.H.;BRYAN,W.C.&DAVEY,C.B. Influence of temperature on aseptic synthesis of ectomycorrhizae by The- lephora terrestrisandPisolithus tincto- rius on loblolly pine. For. Sci., v.16, p.424-431, 1970. MEYER, F. H. Distribution of ectomycor- rhizae in native and man-made fo- rests. In: MARKS, C.G. & KOZLO- WSKI, T.T. (eds).Ectomycorrhizae Their ecology and physiology. New York: Academic Press, 1973. p.79-105. MIKOLA, P. Mycorrhizal inoculation in afforestation. Internat. Rev. For. Res., v.3, p.123-196, 1970. MIKOLA,P. The roleof ectomycorrhizae in forest nurseries. Agr. Ecosyst. Environ., v.28, p.343-450, 1989. MOLINA, R. & TRAPPE, J. M. Applied aspects of ectomycorrhizae. In: SUB- BA RAO, N. S. (ed.) Advances in agricultural microbiology. New Delhi:Oxford&IBHPublishingCom- pany, 1982. p.305-324. MOLINA, R. & TRAPPE, J.M. Patterns of ectomycorrhizal host specificity and potential among Pacific Northwest conifers and fungi.For. Sci., v.28, p.423-458, 1982. MOLINA,R.;MASSICOTE,H.;TRAPPE, J. M. Specificity phenomena inmycor- rhizal symbiosis: community-ecolo- gical consequences and pratical im- plications. In:ALLEN,M.F.ed.Mycor- rhizalFunctioninganintegrative plant-fungal process. New York: Chapman andHall, 1992. p.357-423. NOGUEIRA, A.V. As micorrizas e o ex- cesso de metais. In: SIQUEIRA, J.O. (ed.) Avanços em fundamentos e aplicação de micorrizas. Lavras: UniversidadeFederal de Lavras/DCS EDCF, 1996. p.135-174. OLIVEIRA, V. L.; SCHMIDT, V. D.B.; GOMES,N. C.;MAIA,D. C. Spécifici- té de champignons ectomycorhizi- ens vis-à-vis dEucalyptus viminalis Labill et E. dunniiMaiden. Agrono- mie, v.14, p.57-62, 1994. PEREIRA, O. L. & KASUYA, M. C. M. Especificidade de isolados de Pisoli- thus spp. inoculados em mudas de Pinuselliottii eP.oocarpa emcondi- ções de casa de vegetação. V Con- gresso e Exposição internacional so- bre florestas FOREST99. 15 de junho de 1999 Curitiba PR PEREIRA, O. L.; BORGES, A. C.; KA- SUYA, M. C. M. Caracterização mor- fológica de ectomicorizas formadas em Pinus elliotii e P. oocarpa por isolados de Pisolithus spp. FERTI- BIO, 2000. 22 a 26 de outubro de 2000. Santa Maria RS. PEREIRA,O. L.; COSTA,M.D; KASUYA, M.C.M. Formaçãodeectomicorrizas emEucalyptusgrandiseE.urophylla por isolados dePisolithus tinctorius. Congresso Brasileiro de Ciência do Solo, Rio de Janeiro, Julho, 1997. PERRIN, R. Laptitude des mycorrhizes à proteger les plantes contre les maladi- es: panacée ou chimère? Ann. Sci. For., v.42, p.453-470, 1985. PETERSON,R. L.&BONFANTE,P.Compa- rative structure of vesicular-arbuscular mycorrhizas and ectomycorrhizas. Plant Soil, v.159, p.79-88, 1994. RASANAYAGAM, S. & JEFFRIES, P. Pro- duction of acid is responsible for anti- biosis by some ectomycorrhizal fungi. Mycol. Res., v.96, p.971-976, 1992. RIBEIRO, J. J. O. Isolamento e caracteriza- ção de ectomicorrizas em nogueira pecã. Viçosa: UFV, 2001. 31p. Dissert. (Mestrado emMicrobiologia Agrícola) RODRIGUES, L. S.; KASUYA, M. C. M.; BORGES, A. C. Viability of fragmented mycelia of ecotmycorrhizal fungi en- trappedincalciumalginategels.Mycor- rhiza, v.8, p.263-266, 1999. SCHWAN,K. R. F. Caracterização, incidên- cia e ecologia demicorrizas emviveiro e florestasdeEucalyptus spp. na região de Viçosa, Minas Gerais. Viçosa: UFV, 1984. 55p. Dissert. (Mestrado em Mi- crobiologia Agrícola) SMITH, S. E. & READ, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. London: Academic Press, 1997. 605p. SOCIEDADE BRASILEIRA DE SILVICUL- TURA. Estatísticas: área plantada com pinus e eucalipto no Brasil (Ha)-2000. Disponível em:http://www.sbs.org.br/ area_plantada.htm. Acesso em: 08 dez 2002 THOMAZINI, L. I. Mycorrhiza in plant of cerrado. Plant Soil, v.41, p.707-711, 1974. THOMSON, B. D.; GROVE, T. S.; MALA- JCZUK, N.; HARDY, G. E. St. J. The effectiveness of ectomycorrhizal fungi to increasing the growth of Eucalyptus globulus Labill. in relation to root colo- nization and hyphal development in soil. New Phytol., v.126, p.517-524, 1994. TONKIN,C.M.;MALAJCZUK,N.;McCOMB, J. A. Ectomycorrhizal formation by micropropagated clonesof Eucalyptus marginata inoculated with isolates of Pisolithus tinctorius. New Phytol., v.111, p.209-214, 1989. VOIBLET, C.; DUPLESSIS, S.; ENCELOT, N.;MARTIN, F. Identificationof symbi- osis-regulatedgenes inEucalyptusglo- bulus-Pisolithus tinctoriusectomycor- rhiza by differential hybridization of arrayed cDNA. Plant J., v.25, p.181- 191, 2001. VOZZO, J. A. & HACKSKAYLO, E. Inocu- lation of Pinus caribaea with ec- tomycorrhizal fungi in Puerto Rico. For. Sci., v.17, p.239-45, 1971. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 47 PESQUISA O PO PO PO PO Papel do Papel do Papel do Papel do Papel do Papiloma Vírus Humano na Carcinogêneseapiloma Vírus Humano na Carcinogêneseapiloma Vírus Humano na Carcinogêneseapiloma Vírus Humano na Carcinogêneseapiloma Vírus Humano na Carcinogênese Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores HPV e Câncer Resumo O papiloma vírus humano (HPV) foiprimeiramenteassociadoa tumores benignos e comoavançodas técnicas dedetecçãomolecularogenomaviral passou a ser identificado em associa- çãocomcélulasneoplásicasmalignas. Os HPVs podem ser classificados de acordo com o tropismo em cutaneo- trópicos emucosotrópicos, e de acor- do com a categoria de risco para o desenvolvimento de neoplasias em dois grupos HPVs de baixo risco e de alto risco oncogênico. Os HPVs são capazes de transformar e imortalizar uma célula e portanto podem agir comoumfatorde iniciaçãodoproces- somaligno.Osgenesviraisenvolvidos na transformaçãoe imortalizaçãocelu- lar são os genes E6 e E7, pois são capazes de se ligar a proteínas impor- tantes na regulação do ciclo celular, como as proteínas supressora de tu- morpRbep53.Essaassociação resulta na inativaçãooudegradaçãodasprote- ínas celulares e conseqüentementena desregulação do ciclo celular. Desta forma a célula infectada passa a se dividir acentuadamente, ocorrendo assima iniciaçãoepromoção tumoral. Palavras-chave: papiloma vírus humano,carcinogênese,genessupres- sores de tumor. Introdução EstudosdemonstraramqueoHPV éoagentecausalde tumoresbenignos como papilomas, verrugas comuns e condilomas (Garcia-Carrancá&Garri- glio, 1993).Comoavançodas técnicas de detecção molecular, o genoma de HPV tem sido identificado emcélulas neoplásicas malignas. Assim, o HPV passou a ser associado a cânceres, principalmente comocarcinomacer- vical.Asevidênciasdeassociaçãodes- tes vírus com neoplasias, somadas a estudos epidemiológicos publicados ultimamente,permitiuestabeleceruma relaçãoetiológicaentrealguns tiposde Antonio Márcio Teodoro Cordeiro Silva Pesquisador NúcleodePesquisasReplicon Departamento de Biologia UniversidadeCatólicadeGoiás. am.tc@uol.com.br Marcus Vinícius Teixeira Amaral Pesquisador NúcleodePesquisasReplicon Departamento de Biologia UniversidadeCatólicadeGoiás marvinius@ig.com.br Aparecido Divino da Cruz, Ph.D. Coordenador NúcleodePesquisasReplicon Departamento de Biologia UniversidadeCatólicadeGoiás Laboratório de Citogenética Humana e GenéticaMolecular/SecretariaEstadualde Saúde-GO RegistrodeCâncerdeBasePopulacional, Associação de Combate ao Câncer deGoiás, Hospital Araújo Jorge- GO-Goiás acruz@ucg.br HPVseocarcinomacervical (Bibbo& Filho, 1998). PapilomaVírusHumano Características OsHPVs sãovírusda famíliaPapo- vaviridae,queformampartículasvirais icosaédricas semenvelope, comcerca de55nmdediâmetro.Apresentamum DNAcircularde fitadupla,medindode 7,5x103 a 8,0x103 pb (Matzow et al., 1998). Atualmente são conhecidos mais de 100 tipos deHPVs. Espera-se que com os estudos de tipagem de HPVsassociadosaoscânceresdecabe- ça e pescoço esse número aumente aindamais (Lin et al.,1998). Ciclo de vida O HPV infecta células epiteliais tantomucosas quanto cutâneas do te- cido epitelial pavimentoso estratifica- doeproduzvírionsdurante adiferen- ciação dessas células. O ciclo de vida doHPVestá relacionadoadiferencia- ção celular, sendodenominadode ci- clo viral dependentedadiferenciação (Figura 1). A infecção inicial por HPV provavelmenteocorre emcélulas epi- teliais tronco ou basais ou em células que estão transitoriamente sedividin- do, localizadas nas camadasmais bai- xasdoepitélio estratificado.Amedida que as célulasmais profundas do epi- télio vão se dividindo elas migram da camada basal e se tornam gradativa- mentediferenciadas. Depois de entrar na célula, os ge- nomas dosHPVs são estabilizados na forma de elementos extracromossô- micos nos núcleos e o número de cópias é aumentado paraaproximadamen- te 50 a 100 cópias por célula.Aosedividirem essas células infecta- dasdistribuemeqüita- tivamenteoDNAviral entre as células filhas. Umadas células filhas migradacamadabasal e iniciaoprogramadediferenciação.Aoutra célulafilhacontinuain- diferenciadanacama- dabasal sofrendodivi- sões para oferecer cé- lulas para diferencia- ção e células para a manutençãodacama- da basal. Porém, a cé- lula agora correspon- deaumreservatóriodeDNAviral. Apesar da infecção do HPV acontecer nas camadas basais, a produçãodovírusé restritoacélu- lasdacamadasuprabasais,pois as células da camada basal não são lisadaspelaproduçãodosvírions, mascontinuamaproliferação.Essa diferenciaçãodependentepromo- ve a infecção e manutenção per- sistente do HPV nas camadas ba- sais por períodos de até vários anos (Stubenrauch & Laimins, 1999). Classificação OsHPVspodemser classifica- dosdeacordocomo tropismoem dois grupos: (1) cutaneotrópicos, que infectam a epiderme; e (2) mucosotrópicos,queinfectammu- cosasemgeral (Tabela I).OsHPVs são também divididos em duas categorias de risco para o desen- volvimento de neoplasias: baixo risco e alto risco oncogênico (Ta- bela I) [Bibbo & Filho, 1998]. Os vírus do primeiro grupo são en- contrados mais comumente em lesões benignas comopapilomas everrugas simples,principalmen- te emcondilomas. Jáosdo segun- dogruposãoassociadosadiferen- tes graus de lesões escamosas in- tra-epiteliais do colodoútero, va- gina, vulva,pênis (Stevens, 2002), dos carcinomas cervicais (Rivoire et al., 2001) e de carcinomas de cabeça e pescoço (Badaracco et al., 2000; Smith et al., 2000; Row- ley, 1998; Paz etal., 1997;Thomp- son, 1997). Classificação Categoria Genótipo de HPV Natureza da Lesão Lesão Cutaneotrópicos 1 e 2 Benigna Verrugas Tropismo 5 e 8 Maligna Ca de pele Mucosotrópicos 6, 11 e 42 Benigna Condilomas 16, 18, 31 e 45 Maligna Ca cervical Risco Baixo risco 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70 e 73 Benigna Condilomas Oncogênico Alto risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, Maligna Ca cervical 51, 55, 56, 58, 59, 66 e 68 Tabela I Classificação dos HPVs quanto ao tropismo e categoria de risco para o desenvolvimento de neoplasias, incluindo exemplos de lesões virais em cada classe 50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Determinaçãode novos tipos virais Para a identificaçãodenovos tipos de HPV faz-se a genotipagem viral a partir da determinação da seqüência denucleotídeosquecompreendemos genes L1,E6 eE7, queperfazemcerca de30%dogenomaviral, e estabelece- se as divergências da seqüência iden- tificadacomosHPVs jáconhecidos. Se a divergência for menor que 2%, o vírus em estudo é considerado como um variante do mesmo tipo. Se a divergência na seqüência deDNAes- tiver entre 2 a10%, foi identificadoum subtipoviral.Poroutro lado, seadiver- gência observada for superior a 10%, trata-se de um novo tipo de HPV. Genes virais ComoindicadonaFigura2,ogeno- ma do HPV apresenta cerca de 9 a 10 genes, sendo 7 a 8 na região precoce E (do inglês, early) e 2 na região tardia L (do inglês, late). Na Tabela II são descritas as funções dos genes incluídos nas regiões E e L do HPV (Garcia-Carrancá&Gariglio, 1993). Regulação dos genes virais Areplicaçãodogenoma do HPV tem origem numa região de 500 a 1000 pb localizada entre L1 e E6. A região é denominada LCR, ou seja, Longa Região de Controle (do inglês, Long Control Region) ou URR Região Regulatória a Mon- tante (do inglês, Upstream RegulatoryRegion) [Figura 2].Esse regiãoé reguladapeloproduto do gene E2, a proteína E2, e por proteínascelulares.AproteínaE2apre- senta três domínios funcionais deno- minadosA, B eC e se une aoDNAem forma de dímero. Os domínios A e C são globulares e ligados entre si pelo domínio B, uma dobradiça flexível. EnquantoodomínioAestá envolvido comaativação transcricional, odomí- nio C é responsável pelo processo de dimerização e pela união da proteína do DNA (Figura 3). Comoaentradadogenomaviralno DNA do hospedeiro se dá através da linearizaçãodoDNAcirculardovíruse posterior inserção desse DNA no ge- nomadohospedeiro,essemecanismo faz com que o genoma viral perca o gene E2, conseqüentemente, haverá uma superexpressão dos genes viral, comoaumento considerável daspro- teínas E6 eE7, responsáveis pelo estí- mulodaproliferaçãoe transformação celulares. Transformação celular O HPV é capaz de transformar e imortalizarumacélula, iniciandoassim umprocessomaligno.Os produtos dos genes E6 e E7 são importantes paraa transformaçãoe imortalização celular. O produto do gene E6, a proteína E6, tem uma grande afini- dadepeloDNAeéencontrada tanto nonúcleocomonamembranaplas- mática. Já o produto do gene E7, a proteína E7, é uma fosfoproteína encontradano citoplasmae, prova- velmente,nonúcleo(Garcia-Carran- cá & Gariglio, 1993). Os produtos dos genes supressores de tumores presentes na células comoasprote- ínas pRb ep53 são alvo da ação dos produtos dos genes dos HPVs. Em geral a atividade de pRb é inibida pelaproteínaviralE7,poroutro lado, a p53 é degradada subseqüente- mente à ligação com a proteína E6. A perda das funções de ambas as proteínas responsáveis pela supres- são tumoralcontribuiparaaprogres- são de tumores (Vousden, 1993). Genes Supressores de Tumor x Genes Virais GeneRB1 O gene RB1 é um supressor de tumor localizado no cromossomo 13q14, que tem como produto a proteína celular pRb, de aproxima- damente 105 kDa. A proteína pRb tem a função de inibir a progressão do ciclo celular, pois é capaz de seqüestraro fatorde transcriçãoE2F e impedi-lo depromover a transcri- ção de genes necessários para a replicaçãodoDNAna fase S.Assim, a proteína pRb exerce uma regula- Tabela II Funções dos genes das regiões E e L do HPV Genes Precoce Tardio E1 E2 E4 E5, E6 e E7 L1 L2 Função Replicação doDNA viral Controleda transcrição Maturação do vírus e alteração damatriz intracelular Estímulodaproliferaçãoe transformação celulares Codifica proteínaprincipal do capsídeo Codificaproteína secundária do capsídeo Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 51 çãonegativa do ciclo ce- lular atravésdasua fosfo- rilaçãoespecíficaciclo-de- pendente, ou seja, pRb defosforilada é capaz de inibir a progressãodoci- clocelularpor ligaçãoes- pecífica a E2F. Uma vez fosforiladaa ligaçãoentre pRb eE2Fnão acontece, resultandonoestímuloda transcriçãodosgenesres- ponsáveispelareplicação doscromossomosduran- te a faseSdociclo celular (Figura4A).Aassociação da proteína pRb com a proteína viral E7 causará umaperturbaçãonocon- trole normal do ciclo ce- lular, resultando em um estímulo excessivo para aproliferaçãodascélulas infectadas(Sandal,2002). AproteínaE7deHPVs de alto risco está associada a inativa- ção das proteínas da família pRb, incluindo a p107, a p130 e a própria proteína pRb. A E7 é reconhecida- menteeficientena formaçãodecom- plexos comciclinasA eE.Noentan- to, estudos recentes sugerem essa mesma eficiência quando E7 forma complexosestáveis comasproteínas p21 e p27. Com a inativação da proteína pRb o fator de transcrição E2F não pode ser reprimido, em conseqüência, a célula perdeo con- troledociclocelular (Figura4B) [Stu- benrauch&Laimins,1999;Sauders Jr, 1997]. Genep53 O gene p53 é considerado um gene supressor de tumor que se localizanocromossomo17p13,cujo produto é aproteínap53. Esse gene apresenta 11éxons, entreosquaiso primeiro deles não é codificante. A proteína p53 é constituída de 393 aminoácidosna suaextensão, apre- sentando quatro regiões com fun- ções distintas, chamadas domínios da proteína (Figura 5). Uma vez ativada a proteína p53 é capaz de reprimir o crescimento e sinaliza paraamortecelular, rotamais conhecida como apoptose. Na extremidade amino-ter- minal (ouN-terminal)dap53 existe um domínio de tran- sativação,muito importante para aativaçãoespecíficade determinadosgenes.Napar- te central existemquatrodo- mínios de ligação ao DNA, através dos quais a proteína p53 é capaz de se ligar ao DNA em sítios específicos. Naextremidadecarboxi-ter-minal (ou C-terminal) exis- temdois domínios, são eles: (1) o domínio de tetrameri- zaçãoqueéresponsávelpela formação de tetrâmeros de p53,queéa formamais ativa da p53 em transativação e (2) o domínio regulatório que pode regular negativa- mente o domínio central de ligaçãoaoDNA, se ligandoa ele e, assim, inibindoa ligaçãoespecí- ficadep53aosdiferentespromotores. A proteína p53 tem a habilidade em perceber diferentes tipos de es- tresses que as células podem sofrer, como por exemplo, a exposição a radiaçãoultravioleta (UV), comconse- qüentes danos no DNA. Quando a proteínap53 é ativada apóso estresse celular, é capaz demobilizar uma de- fesanaqualaprópriap53ageativando outrosgenescapazesdecodificarpro- teínas necessárias para esse processo dedefesa.Aproteínap53 inativa, uma vezativadaapenaspor fosforilaçãode resíduos específicos na extremidade 52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 N-terminal, nãoécapazdese ligar ao DNAdemaneiraespecífica.A ligação não-específica ao DNA é causada pela ligaçãodaextremidadeC-termi- nal da proteína com o domínio cen- tral, causando um bloqueio desse domínio.Obloqueiopode ser rever- tidopor fosforilaçãoouacetilaçãoda extremidadeC-terminal.Nessa situa- ção, ap53passa a se ligardemaneira específicaaoDNA,podendoagircomo um fator de transcrição (Figura 6). Aativaçãodep53por fosforilação ou acetilação ainda é controversa. Mas a ativação emodificaçãodep53 faz com que essa proteína aja como um fator de transcrição através da ligação em seqüências específicas, promovendoa transativaçãodowns- tream de genes alvos. Para desem- penhar tal funçãoasproteínasp53se associamentre si formando tetrâme- ros (complexosprotéicos resultantes da associação de quatro monôme- ros). Apósoeventode tretrameriza- ção a proteína passa a ser capaz de conterocrescimentocelularou indu- zir a morte da célula por apoptose. Pelo papel que a proteína p53 desempenha e por se tratar de uma molécula compotencial para causar importantes alteraçõesparaacélula, a concentração de p53, bem como suasatividades são reguladaseman- tidas sobumrígidocontrole.Muitos genes e seus produtos estão envol- vidos nesse controle. Um dos pro- cessosparamanter osníveis dep53 baixos é a degradaçãodessa prote- ína. Nesse contexto o proto-onco- gene MDM2 é importante, pois se trata de um gene ativado por p53. Esse gene codifica para umaprote- ína de mesmo nome, chamada MDM2, que é capaz de se ligar a extremidadeN-terminaldaproteína p53, bloqueando assim a atividade transcricional de p53. A ligação da proteínaMDM2comaproteínap53 é também responsável pela expor- tação de p53 do núcleo para o citoplasma da célula, local onde a p53 será degradadapor umavia de ubiquitinação.Aexportaçãodocom- plexoprotéicoMDM2/p53para fora donúcleo émediadapor proteínas específicasdenominadasexportinas, que são capazes de se ligar a prote- ínaMDM2e auxiliar na exportação do complexo para fora do núcleo. Essa regulaçãonegativadaproteína p53 exercida pela proteína MDM2 podeserneutralizada.Recentemen- te foi demonstradoqueumaprote- ína supressora de tumor chamada p14ARF ondeARFsignificamoldura de leitura alternativa, do inglês Al- ternative ReadingFrame é capaz de se ligar a proteína MDM2 e for- marumcomplexocomMDM2/p53 que é retido no núcleo. A proteína p14ARF pode também degradar MDM2causandoa liberaçãodep53 docomplexononúcleo.Ahabilida- de de MDM2 de se ligar a p53 tambéméprejudicadaapós fosfori- laçãodosítiodeligação,causadapor danosnoDNA.Aproteínap53pos- suisinaisdelocalizaçãonuclear,cha- mados NLS (do inglês,Nuclear Lo- calisationSignals), os quais, amai- oriadeles, se localizanaextremida- deC-terminal, entreos resíduos315 e 325, permitindo a sua entrada no núcleo. Recentemente foi demons- trado a existência de um sinal de exportação nuclear, denominado NES (do inglês,NuclearExport Sig- nal),naextremidadeC-terminal,no domínio de tetramerizaçãodapro- teína p53. Quando a p53 está em forma de tetrâmero o NES fica ina- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 53 cessível asexportinas,mas seap53se encontra no estágio de dímero ou monômero, as exportinas podem se ligar a NES e a p53 pode ser lançada para o citoplasma independente de MDM2 (Nylander et al., 2000). Então a proteína p53 é responsá- velpormonitorardanosocorridosnas moléculas de DNA. Desta forma o ciclocelularé impedidodeprosseguir até queodanonoDNAseja restaura- do (Figura7A) [Lewin, 2000].Aprote- ínaE6deHPVsdealto riscoseassocia a proteína p53, que é responsável pela regulação da passagem da fase G1paraSeda faseG2paraM,nociclo celular. A proteína E6 recruta a pro- teínacelularE6AP,quefuncionacomo uma ubiquitina-ligase para o com- plexo contendo p53. Este recruta- mento resulta na ubiquitinação de p53 seguidode sua rápida degrada- ção (Stubenrauch&Laimins, 1999). Sem a proteína p53 a célula perde a capacidade de perceber e reparar possíveis danos no DNA, assim a divisão celular passa a ocorrer sem reparo.Consequentemente, aumen- ta-sea freqüênciadasmutações,dos rearranjoscromossômicos,dasaneu- ploidias (Figura 7B). O acúmulo de eventosmutacionaiséacausa subja- cente ao desenvolvimento de um fenótiponeoplásicoe,assim,prova- velmente, resultam no câncer (Vo- gel & Motulsky, 2000; Griffiths et al.,1998; Vousden, 1993). Polimorfismodap53 Existeumpolimorfismocomum queocorrena seqüência de amino- ácidos da proteína p53 que resulta napresença deduas variantes para o resíduo 72, podendo ser uma prolinaouumaargenina (Figura 8). O efeito do polimorfismo de p53 para a degradação mediada pela proteínaviral E6 temsido investiga- do e a forma argenina de p53 tem- se apresentado significativamente mais susceptível que a formaproli- na. Avaliação alélica de pacientes com tumores cervicais associados a HPVreveloumaiorhomozigosepara p53-Argenina72 quando compara- da com a população normal, indi- candoque indivíduoshomozigotos para a forma argenina são 7 vezes mais susceptíveis para a tumorigê- nese associadaaHPVqueheterozi- gotos. Assim, o alelo que codifica argenina representa um fator de riscosignificanteparaodesenvolvi- mentodecânceres cervicais associ- ados a HPV (Storey et al., 1998). Resultados de estudos da sus- ceptibilidade alélica de p53 para degradação in vivo indicam que o polimorfismo prolina/argenina na posição 72 de p53 tipo-selvagem, afeta a susceptibilidade das proteí- naspara adegradação invivo indu- zida por E6 de HPVs de alto risco oncogênico,comp53Argsendomais susceptível que p53Pro. Storey e colaboradores(1998)demonstraram queaproteína viral E6dosHPVs 16 54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 e 18 émais eficiente na degradação de p53Arg que de p53Pro in vivo, por outro lado aproteína viral E6 de HPV11émenos ativaparap53Arg e inativaparap53Pro. Conclusão São fortes as evidências daparti- cipação de HPV na proliferação de tumoresbenignoscomoverrugassim- ples, condilomas epapilomatose la- ríngea recorrentena infância.Nessas situações, especificamenteoHPV11 temsido implicado como responsá- vel por causar alterações importan- tes anível de ciclo celular, subjacen- tes aperdadocontroledadivisãoda célula e ao desenvolvimento do tu- morbenigno. HPVs de alto risco oncogênico atualmentesãoconsideradososagen- tes etiológicos do câncer cervical. Mais de 90% dos carcinomas cervi- cais apresentam genomas HPVs as- sociados (Stubenrauch & Laimonis, 1999). Além do câncer cervical, o HPV temsido identificadonos carci- nomasanogenitais, incluindovulva, vagina, pênis, prepúcio, glande e ânus, e nos carcinomas de cabeça e pescoço, emsitos anatômicos como boca,orofaringe,hipofaringee larin- ge. Evidências epidemiológicas têm mostradoumaassociaçãoentreHPV e carcinomas de cabeça e pescoço, que variam de zero a 100%. OHPV é capaz de alterar o ciclo celular através da participação das proteínasviraisE6eE7nainativação oueliminaçãodosprodutosdegenes supressoresde tumor.Oprocessode interação entre as proteínas virais e as proteínas celulares ligadas direta ouindiretamenteaocontroledociclo celularencontra-sebemdefinido, fa- zendoda infecçãoporHPVumfator de iniciaçãoepromoçãode tumores quedeve ser avaliadopara estabele- ceros riscos relativos eosprognósti- cos individuais. ReferênciasBibliográficas 1.BadaraccoG,VenutiA,MorelloR, Muller A and Marcante ML.Hu- manpapillomavirusinheadand neck carcinomas: prevalence, physical and relationship with clinical/pathologicalparameters. Anticancer Research, 20:2000, pp. 1301-1306. 2.BibboM,FilhoAMS.Lesõesrelaci- onadas à infecção por HPV no tratoanogenital. Revinter, 1998, Rio de Janeiro-RJ, pp. 51-58. 3. Garcia-Carrancá A, Gariglio PV. Aspectos moleculares de los pa- pilomavirushumanosy su rela- ciónconelcáncercérvico-uteri- no. Rev InvClin, 1993,Vol 45,No 1, pp. 85-92. 4.GriffithsAJF,Miller JH,SuzukiDT, LewontinRC,GelbartWM. Intro- duçãoàgenética, In:Genéticae diferenciaçãocelular.Guanaba- ra Koogan, 6 ed, 1998, Rio de Janeiro-RJ, pp. 682-708. 5. LewinB.GenesVII, In:Oncogenes e câncer. Artmed Editora, 2000, São Paulo-SP, pp. 837-873. 6. LinKY,WestraWH,KashimaHK, Mounts P.Coinfectionofhpv-11 andhpv-16 inacaseof larynge- al squamous papillomas with severe dysplasia. The Laryngos- cope, 107:1997, pp. 942-947. 7.MatzowT,BoysenM,KalantariM, JohanssonBandHagmarB.Low detection rate of HPV in oral andlaryngealcarcinomas.Acta Oncologica, 1998, Vol. 37, N.º 01, pp. 73-76. 8. Nylander K, Dabeisteen E, Hall PA. The p53 molecule and its prognostic role in squamouscell carcinomas of the head and neck. Journal Oral Patol Med, 2000, 29. pp. 413-25. 9. Paz IB,CookN,Odom-MaryonT, Xie Y, Wilczynski SP. Human papillomavirus (HPV) in head andneckcancer.AmericanCan- cer Society, 1997, Vol. 79, No 3, pp. 595-604. 10.RivoireWA,CappE,CorletaHVE eda Silva ISB.Basesbiomolecu- lares da oncogênese cervical. RevistaBrasileira deCancerolo- gia, 2001, 47(2), pp. 179-84. 11. Rowley H. Molecular Biology Series: The molecular genetics of head and neck cancer. The JournalofLaryngologyandOto- logy, July 1998, Vol. 112, pp. 607-612. 12. Sandal T.Molecular aspects of themammalian cell cycle and cancer. The Oncologist, 2002, 7, pp.73-81. 13. Sauders Jr JR.Thegeneticbasic of head and neck carcinoma. The American Journal of Sur- gery,November1997,Vol. 174, pp. 459-461. 14. Smith EM, Summersgill KF, Al- len J, Hoffman HT, McCulloch T, Turek LP, Haugen TH. Hu- man papillomavirus and risk of laryngeal cancer. Ann Otol Rhinol Laryngol, 109:2000, pp.1069-1076. 15. Stevens LM. Papillomavirus. JAMAThe Journalof theAme- ricanMedicalAssociation,2002, Vol. 287, No. 18, p. 2452. 16. Storey A, Thomas M, Kalita A, HarwoodC,GardiolD,Manto- vaniF,Breuer J,LeighIM,Matla- shewski G&Banks L. Role of a p53polymorphism in thedeve- lopment of human papilloma- virus-associatedcancer. Natu- re, 1998, Vol 393, pp. 229-234. 17. StubenrauchF andLaimins LA. Human papillomavirus life cycle: activeand latentphases. Cancer Biology, 1999, Vol. 9, pp. 379-386. 18. Thompson LD.Diagnostically challenging lesioninheadand neckpathology.EurArchOtorhi- nolaryngol, 254(8):1997, pp. 357-366. 19. Vogel F,Motulsky AG.Genéti- cahumana:problemaseabor- dagens, In:Mutação:mutação somática, câncer e envelheci- mento. Guanabara Koogan, 3 ed, 2000, Riode Janeiro-RJ, pp. 355-376. 20. VousdenK. Interactionsofhu- man papillomavirus transfor- ming proteins with the pro- ducts of tumor suppressor ge- nes. The Faseb Journal, 1993, Vol 7, pp. 872-879. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 55 56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 PESQUISA Aspectos técnicos e interpretação genéticaAspectos técnicos e interpretação genéticaAspectos técnicos e interpretação genéticaAspectos técnicos e interpretação genéticaAspectos técnicos e interpretação genética Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores Marcadores MolecularesMarcadores MolecularesMarcadores MolecularesMarcadores MolecularesMarcadores Moleculares Dominantes (RDominantes (RDominantes (RDominantes (RDominantes (Rapd e Aflp)apd e Aflp)apd e Aflp)apd e Aflp)apd e Aflp) Ricardo Lopes Pós-graduando emGenética eMelhoramento de Plantas,ESALQ Maria Teresa Gomes Lopes Pós-graduandaemGenética eMelhoramentode Plantas,ESALQ Dr. Antonio Vargas de Oliveira Figueira USP/CENA Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo USP/ESALQ Dra. Maria Helena Pelegrinelli Fungaro UEL Dra. Monalisa Sampaio Carneiro UFG Dra. Maria Lucia Carneiro Vieira USP/ESALQ mlcvieir@esalq.usp.br arcadores moleculares re- velam polimorfismos de DNA entre indivíduos ge- neticamente relacionados. Um loco molecular que apresenta segregação mendeliana é considerado um marcador genético. Por isso, os marcadores de DNA se prestam para estudos de genética de populações, mapeamento e análises de similaridade e distância genética. Também, as marcas de DNA podem ser usadas para DNA fingerprinting isto é, visando à identificação de aces- sos de plantas ou de isolados de um microrganismo, ou para completar es- tudos de sistemática. Há várias técnicas disponíveis, cada uma utilizando uma estratégia particu- lar paradetectar polimorfismosdeDNA. Em estudos com vírus, Grodzicker et al. (1974) usaram pela primeira vez os polimorfismosde comprimentode frag- mentos gerados por enzimas de restri- ção. Anos mais tarde, esta técnica, denominada RFLP (Restriction Frag- ment Length Polimorphism), foi am- plamente aplicada a genomas de di- versos organismos. Ressalte-se que quando se trabalha com genomas eu- carióticos há necessidade do uso de sondas uma vez que o número de fragmentos é muito elevado. Portanto, apenas os locos identificados por uma molécula complementar ao DNA ge- nômico i.é., por uma sonda, são reve- lados a cada hibridização. Um loco de RFLP é definido pela combinaçãoenzi- ma de restrição/sonda, e o marca- dor é codominante uma vez que os cromossomos homólogos podem re- velar fragmentos de um mesmo tama- nho (genótipo homozigótico) ou não (genótipo heterozigótico) devido a va- riações nos sítios de restrição. A disponibilidade de mais de uma centena de enzimas de restrição (ban- co de dados: http://rebase.neb.com/ rebase/rebase.html) permite que um número elevado de locos de RFLP possa ser detectado, alcançando uma ampla cobertura do genoma. Entretan- to, a disponibilidade de sondas é limi- tada, pois o seu desenvolvimento é laborioso, exigindo pessoal habilitado para a manipulação do DNA recombi- nante. Mesmo quando as sondas estão disponíveis, como no caso das culturas agrícolas de maior expressão, a técnica não permite a análise de grande núme- ro de amostras em curto prazo, não se prestando à automação. Além disso, no caso de se usarmarcação radioativa das sondas, são necessárias instalação ade- quada e licença para uso de radioisóto- pos, bem como treinamento para o manuseio da radioatividade. As análi- ses com RFLPs têm um custo relativa- mente elevado e isto também tem limitado a sua aplicação. Com o desenvolvimento da técnica Figura 1.Gel de RAPD mostrando os perfis dos genitores (IAPAR 123 e 06) e de uma amostra de 6 indivíduos da população filial de maracujá amarelo. As setas indicam locospolimórficos.M=marcador de pesomolecular Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 57 de reação em cadeia da polimerase - PCR (Mullis & Faloona, 1987) surgiram novos marcadores moleculares. Den- tre estes, destacam-se os marcadores RAPD (Random Amplified Polymor- phic DNA - Williams et al., 1990) e os AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Vos et al., 1995), que são métodos sensíveis, rápidos, relati- vamente simples e que revelam vários locos dispersos pelo genoma sem exi- gir conhecimento prévio dainforma- ção genética de seqüências-alvo, como no caso dos marcadores microssatéli- tes, que também são derivados da PCR. Essas técnicas não requerem sis- tema especial para a revelação do polimorfismo, tal como a hibridização por sondas. Umacaracterística dasmarcasRAPD e AFLP, diferente dos marcadores iso- enzimáticos, RFLPs e microssatélites (quando revelados por PCR), é sua dominância. Alelos de um mesmo loco são revelados pela presença ou ausência de uma banda que, por sua vez, resulta da amplificação de um fragmento de determinado tamanho no gel (Figura 1). No entanto, não é possível saber se o loco amplificado está em homozigose ou heterozigose. Sendo assim, marcadores dominantes, ao contrário dos codominantes, não permitem a distinção entre genótipos homozigóticos e heterozigóticos os quais constituem apenas uma classe, isto é, a que apresenta o alelo amplifi- cado. Os indivíduos nos quais o alelo não é amplificado constituem a outra classe, considerada homozigótica para ausência da banda, qualquer que seja o motivo pelo qual o fragmento não foi amplificado. Em plantas, uma pequena propor- ção (<5%) de locos RAPD e AFLP pode apresentar codominância (ambos ale- los do loco são amplificados) que é observada quando ocorrem pequenas inserções ou deleções entre os sítios de anelamento dos primers de RAPD ou entre os sítios de restrição, no caso de marcadores AFLP. A identificação de locos codominantes requer análises de populações segregantes de cruza- mentos controlados, e testes de ade- rência às proporções esperadas de acordo com a configuração do cruza- mento. RAPD O polimorfismo dos marcadores RAPD é revelado pela amplificação de locos cromossômicos usando-se inicia- dores (primers) compostos de seqüên- cias curtas de oligonucleotídeos. Na reação de amplificação, estes primers quando submetidos a condições apro- priadas de temperatura (37 a 42° C) se hibridizam com seqüências genômicas que lhes são complementares. Para que ocorra amplificação, há necessida- de que existam no genoma dois sítios complementares ao primer, localiza- dos em direções opostas e distantes entre si, no máximo, 3.000 pb. Como a seqüência de cada iniciador é deter- minada de modo aleatório, este pode encontrar várias regiões complemen- tares à sua seqüência e, por isso, reve- lar vários locos. Os fragmentos ampli- ficados, por sua vez, são separados em umgel de poliacrilaminada ou agarose, e visualizados após coloração com ni- trato de prata ou brometo de etídeo (EtBr) sob luz UV. O polimorfismo detectado por mar- cadores RAPD é gerado por mutações ou por rearranjos (inserções ou dele- ções) entre os dois sítios, ou no próprio sítio de hibridização dos dois primers. Diferenças em apenas um par de ba- ses (mutações de ponto) podem ser suficientes para inibir a amplificação. Em diferentes espécies, dados ex- perimentais evidenciam que locos RAPD estão dispersos no genoma. As seqüências internas dos segmentos am- plificados abrangem desde cópia única até altamente repetitivas (Williams et al., 1993). A baixa reprodutibilidade dos mar- cadores RAPD é uma questão bastante discutida. Na verdade, a técnica requer certa experiência com procedimentos moleculares, cuidado com o preparo das reações, e rigor na leitura e análise dos fragmentos visualizados no gel. A quantidade e qualidade do DNA, a concentração de íons magnésio e da enzima Taq polimerase são alguns dos aspectos que devem ser considerados nos ensaios de RAPD. Deve-se dar preferência a protocolos de extração de DNA que sejam simples e rápidos, como os que usam tampão CTAB ou SDS. Porém, é importante que o DNA não esteja contaminado pela presença de proteínas, polissacarídeos e com- postos fenólicos, pois estas substâncias podem diminuir ou até inibir a ativida- de da Taq polimerase. A quantificação do DNA genômico pode ser feita por comparação da intensidade de fluorescência de amos- tras de concentração conhecida de DNA (ex., do fago λ) visualizada em gel de agarose corado com EtBr. Outra alternativa é a espectrofotometria ou fluorimetria. Embora a leitura nestes aparelhos seja mais rápida e prática, moléculas degradadas de DNA tam- bém são quantificadas por espectrofo- tometria. Portanto, a quantificação ba- seada em gel é mais recomendável. Atualmente, há fluorímetros (GENE- QUANT, Pharmacia) que realizam lei- turas de ótima qualidade, não incorpo- rando nucleotídeos livres e moléculas de fita simples à leitura. Em geral, DNA em excesso na reação de PCR resulta na falha comple- ta da reação, ou em perfis eletroforéti- cos com arraste. Por outro lado, a baixa concentração leva a padrões de ampli- ficação com baixa ou nenhuma repro- dutibilidade. Em organismos eucarióti- cos, as concentrações usuais variam de 5 a 30 ng de DNA por reação. Contudo, 1 ng de DNA tem sido utilizado para insetos de pequeno porte com bons resultados no que diz respeito à repro- dutibilidade. A quantidade de íons magnésio influencia diretamente na reprodutibi- lidade dos experimentos de RAPD, pois interfere na ação da Taq polime- rase, e conseqüentemente, na intensi- dade das bandas visualizadas no gel. Geralmente, a concentração final de MgCl 2 varia entre 1,5 a 4,0 mM. A quantidade ótima de Taq polimerase é de 1 a 2 unidades por reação de volume final de 10 até 30 µl. Concen- trações acima de 2U podem resultar em amplificação não-específica. Os primers usados nos experimen- tos de RAPD são compostos de 10 bases de seqüências arbitrárias com no mínimo de 50% de conteúdo GC. Po- dem ser sintetizados no próprio labora- tório ou, mais comumente, adquiridos comercialmente (QIAGEN Operon http://www.operon.com; University of British Columbia http:// www.biotech.ubc.ca/services/naps/). O número esperado de produtos amplificados usando um iniciador arbi- trário (10 pb) é função do comprimen- to do genoma e do número máximo de bases passível de ser amplificado pela DNA polimerase em uso. Supondo que haja distribuição ao acaso de bases no genoma e que a seqüência do iniciador tenhasidoarbitrariamentecon- cebida, o número esperado de produ- 58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 tos amplificados será: b = 2fN/16 n sendo, f = comprimento máximo do fragmento amplificado em pb, N = tamanho do genoma em pb e n = número de nucleotídeos. Dependen- do do tipo de enzima i.é da Taq DNA polimerase, f pode variar. Para maximizar o número de locos polimórficos amplificados por primer, recomenda-se testar, inicialmente, um grande número de iniciadores e uma pequena amostra do conjunto total de indivíduos. Os oligonucleotídeos mais informativos são então selecionados visando proceder às análises do mate- rial genético (indivíduos, populações, acessos, isolados), reduzindo-se o tem- po e custo destas análises (Figura 1). AFLP A técnica é baseada na amplifica- ção, via PCR, de um subconjunto de fragmentos gerados a partir da diges- tão do DNA genômico com combina- ções de enzimas de restrição tipo II, que clivam o DNA em sítios específi- cos, de corte raro (reconhecem sítios de 6-8 bases, ex. ApaI, EcoRI, HindIII e PstI) e de corte freqüente (reconhe- cem sítios de 4 bases, ex. MseI e TaqI). É fundamental que a digestão do DNA seja completa, pois a digestão parcial pode revelar falsos polimorfismos. Para obtenção da digestão total é necessá- rio usar DNA de alta pureza. Portanto, é preciso prestar atenção no método de extração e quantificação usado. A técnica baseia-se na propriedade de certas enzimas de restrição de dei- xar, após a clivagem do DNA, extremi- dades coesivas de seqüência conheci- da. Assim, é possível construir seqüên- cias de nucleotídeos de fita dupla que se ligam às extremidades dos fragmen- tos de restrição, denominadas adapta- dores. Uma vez que a seqüência dos adaptadores e a do sítio de restrição são conhecidas,pode-se construir ini- ciadores específicos a essas seqüênci- as para pré-amplificação dos frag- mentos de restrição. Os primers são constituídos por uma seqüência com- plementar ao adaptador seguida de outra específica do sítio de restrição da enzima, e uma extensão de nucleotí- deos seletivos no terminal 3' (Figura 2). Na Tabela 1 são apresentados os sítios de restrição de algumas enzimas bem como a seqüência de adaptado- res e iniciadores específicos para essas enzimas. Na fase de digestão, as duas enzi- mas (corte raro/corte freqüente) po- dem ser usadas simultaneamente (di- gestão dupla) ou em duas etapas, caso não exista tampão de reação comum às duas enzimas. Como resultado da clivagem do DNA genômico com a combinação de enzimas de corte raro/ freqüente, 3 classes de fragmentos são geradas: fragmentos de corte freqüen- te/freqüente, fragmentos de corte raro/ freqüente e fragmentos de corte raro/ raro. A partir da digestão do DNA Figura 2. Procedimentos para análise demarcadores AFLP.A. Digestão do DNA genômico usando as enzimas EcoRI (corte raro) eMseI (corte freqüente). B. Ligação dos adaptadores às extremi- dades coesivas dos fragmentos gerados pela digestão.C. Pré-am- plificação usandoG comonucleotídeo seletivo no iniciadorEcoRI e T noMseI.D. Amplificação seletiva usando 3 nucleotídeos sele- tivos em ambos os iniciadores Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 59 genômico com as enzimas Eco- RI e MseI é esperado que a maioria dos fragmentos sejam de corte MseI/MseI (freqüente/ freqüente). Fragmentos de cor- te EcoRI/MseI (raro/freqüente) ocorrem aproximadamente em freqüência igual a duas vezes o número de sítios de restrição da enzima EcoRI e fragmentos de corte EcoRI/EcoRI (raro/raro) ocorrem em baixa proporção (veja Ferreira & Grattapaglia, 1996). Por outro lado, os frag- mentos de corte EcoRI/MseI são preferencialmente amplifi- cados, e isto se deve à menor eficiência da hibridização dos iniciadores MseI comparada àquela com iniciadores EcoRI, e também ao fato de que os frag- mentosMseI/MseI possuírem se- qüência terminal invertida por serem amplificados por um úni- co iniciador, favorecendo a for- mação de uma estrutura em loop que compete com o anelamen- to dos iniciadores (Vos et al., 1995). Tanto o resultado da diges- tão como da pré-amplificação podem ser verificados subme- tendo-se parte do DNA digerido e do pré-amplificado à eletroforese em gel de agarose 1% (p/v). Isto evita que problemas de digestão ou de pré- amplificação sejam detectados apenas no final dos procedimentos. A combinação das enzimas EcoRI/ MseI é a mais usada (inclusive, é a única combinação oferecida em kits comerciais). No entanto, nem sempre esta combinação resulta nos me- lhores perfis eletroforéticos, bem como no maior número de locos polimórficos. Quando ainda não existem informações sobre o uso de marcadores AFLP na espécie em estudo, o ideal é que seja realizadoum teste preliminar com diferentes combinações de enzi- mas e nucleotídeos seletivos usa- dos nos terminais 3' dos iniciado- res. De acordo com Janssen et al. (1996), a combinação EcoRI/MseI é mais adequada para genomas pobres em G+C, HindIII/MseI para genomas com conteúdo de G+C em torno de 40 a 50% e ApaI/TaqI para genomas ricos em G+C. Resultados experimentais de- monstraram que para a obtenção de bons padrões de separação dos fragmentos presentes em es- pécies com genoma complexo, pelo menos 3 nucleotídeos sele- tivos devem ser usados em am- bos os iniciadores (EcoRI/MseI) e que a amplificação seletiva deve ser realizada em duas etapas. Na primeira etapa de amplificação, denominada pré-amplificação, 1 nucleotídeo seletivo é usado no terminal 3' dos iniciadores. Na segunda fase, denominada de amplificação seletiva, são usados 3 nucleotídeos seletivos nos terminais 3' dos iniciado- res (Figura 2). Dessa maneira, apenas Figura 3.Gel de AFLP em poliacrilamida corado com nitrato de prata mostrando o perfil de uma população de maracujá ama- relo gerado pelas enzimas PstI eMseI, usan- do em ambos iniciadores 1 nucleotídeo sele- tivo na pré-amplificação e 3 na amplificação seletiva Tabela 1. Sítios de restrição, seqüências de adaptadores e de iniciadores usados para 6 enzimas em análises de AFLP Enzima EcoRI MseI PstI HindIII ApaI TaqI Sítio de restrição 5’...G↓A A T T C...3’ 3...C T T A A↑G...5 5’...T↓T A A...3’ 3...AAT↑T...5 5’...C T G C A↓G...3’ 3...G↑A C G T C...5 5’...A↓A G C T T...3’ 3...T T C G A↑A...5 5’...G G G C C↓C...3’ 3...C↑C C G G G...5 5’...T↓C G A...3’ 3...AGC↑T...5 adaptador iniciador adaptador iniciador adaptador iniciador adaptador iniciador adaptador iniciador adaptador iniciador 5'-C T C G T A G A C T G C G T A C C-3' 3'-C A T C T G A C G C A T G G T T A A-5' 5'-G A C T G C G T A C C A A T T C E-3' 5'-G A C G A T G A G T C C T G A G-3' 3'-T A C T C A G G A C T C A T-5 5'-G A T G A G T C C T G A G T A A E-3' 5'-C T C G T A G A C T G C G T A C A T G C A-3' 3'-C A T C T G A C G C A T G T-5' 5'-G A C T G C G T A C A T G C A G E-3' 5'-C T C G T A G A C T G C G T A C C-3' 3'-C T G A C G C A T G G T C G A-5' 5'-G A C T G C G T A C C A G C T T E-3' 5'-T C G T A G A C T G C G T A C A G G C C-3' 3'-C A T C T G A C G C A T G T-5' 5'-G A C T G C G T A C A G G C C C E-3' 5'-G A C G A T G A G T C C T G A C-3' 3'-T A C T C A G G A C T G G C-5' 5'-C G A T G A G T C C T G A C C G A E-3' E: nucleotídeoarbitráriousadonapré-amplificação 60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 os fragmentos que possuam nucleotí- deos complementares aos nucleotíde- os seletivos (utilizados nos terminais 3' dos iniciadores) serão amplificados. As- sim, os alelos dos locos de AFLP (pre- sença ou ausência de um determinado fragmento ou banda) são oriundos da perda ou ganho de um sítio de restrição, ou da complementaridade ou não das bases seletivas usadas nos terminais 3' dos iniciadores aonde se inicia a PCR com a região que flanqueia o sítio de restrição. A amplificação seletiva visa diminuir o número de fragmentos gerados pela digestão, reduzindo artefatos da técni- ca, principalmente co-migração de frag- mentos submetidos à eletroforese. Em- bora o uso de 1 nucleotídeo seletivo (N) na pré-amplificação e de 3 na amplifica- ção seletiva tenha levado a bons resul- tados em um grande número de espé- cies, isto deve ser adequado a cada genoma. Teoricamente, genomas me- nores possuem menor número de frag- mentos, sendo possível uma menor intensidade na amplificação seletiva (Ex.: EcoRI+2N/MseI+3N). Em geno- mas maiores, pode ser usada maior intensidade na amplificação seletiva (Ex.: EcoRI+3N/MseI+4N). A maior par- te destes produtos resultantes da ampli- ficação seletiva apresenta um tamanho variando de 50 a 800 nucleotídeos. Cada base seletiva reduz em ¼ (25%) o númerodeprodutos amplificados.Como são 2 sítios de iniciação da PCR, somen- te 1 em cada 16 (6,25%) fragmentos serão amplificados. Para separação e identificação dos produtos de amplificação por AFLP, o método mais adequado é a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, o qual proporciona um alto nível de resolução, sendo eficiente para detec- ção de diferenças em um único nucle- otídeo (Figura 3). O número de frag- mentos visualizados em géis de polia- crilamida varia de algumas dezenas até mais de uma centena. Teoricamente, quanto maior o genoma, maior será o número de fragmentos. Esses géis são usados para leituras manuais ou auto- matizadas. A leitura manual é realizada após a revelação do padrão de bandas por coloração com nitrato de prata ou revelação em autoradiografias, neste caso usando iniciadores marcados com radioisótopos. A leitura automatizada requer marcação fluorescente, e é rea- lizada por analisadores de DNA (ALFA- AutomatedLaser Fluorescence Analy- sis), que são equipamentos de alto custo e que requerem softwares espe- ciais também de elevado preço. A revelação de géis em autoradio- grafias requer a marcação dos iniciado- res com radioisótopos: são usados o [γ33P]ATP e o [γ32P]ATP. A marcação é feita nos iniciadores dirigidos aos adap- tadores das enzimas de corte raro. O uso de radioisótopos requer acomoda- ções apropriadas nos laboratórios, li- cença do CNEN (Comissão Nacional de Energia Nuclear), treinamento em pro- teção radiológica, equipamentos de segurança específicos (escudo de pro- teção para manuseio, recipientes para armazenamento do material radioativo ou marcado, contador geyger) bem como equipamentos adicionais (casse- tes, secador de gel) sendo alguns de uso exclusivo (banho-maria, refrigera- dores e micropipetas). A revelação por métodos de colora- ção com nitrato de prata torna-se mais atrativa, bastando seguir as normas gerais de segurança de laboratório e indicações dos fornecedores. Além dis- so, não requer equipamentos sofistica- dos usados na leitura automatizada. Diversos procedimentos para colora- ção com nitrato de prata estão disponí- veis na literatura, destacando-se o método proposto por Creste et al. (2001) que é prático, eficiente e de baixo custo. A técnica AFLP detecta um maior número de locos, comparativamente às demais técnicas que revelam marca- dores moleculares, possibilita ampla cobertura do genoma e apresenta um baixo custo por informação (loco). A utilização de enzimas de restrição com- binada com condições adequadas à hibridização dos primers durante as reações de amplificação agrega a ro- bustez da técnica de RFLP com a praticidade da PCR. Marcadores AFLPs reúnem a capacidade exploratória dos polimorfismos dos RFLPs (presença ou ausência de sítios de restrição) com a vantagem da PCR. Devido a essas características, pouco a pouco, os mar- cadores RAPD vêm sendo substituídos pelos AFLPs. REFERÊNCIAS CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FI- GUEIRA, A.V.O. Detection of sin- gle sequence repeat polymorphi- ms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Repor- ter, 19, 229-306, 2001. FERREIRA, M.E.; GATTAPAGLIA, D. Intro- dução ao uso de marcadores mole- culares em análise genética. 2. ed. Brasília: Embrapa/Cenargen, 1996. 220p. GRODZICKER, T.; WILLIANS, J.; SHARP, P.; SAMBROOK, J. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of ade- novirus. Cold Spring Harbor Sympo- sium Quantitative Biology, 39, 439- 446, 1974. JANSSEN, P.; COOPMAN, R.; HUYS, G.; SWINGS, J.; BLEEKER, M.; VOS, P.; ZA- BEAU, M.; KERSTERS, K. Evaluation of the DNA fingerprint method AFLP as a new tool in bacterial taxonomy.Micro- biology, 142, 1881-1893, 1996. MULLIS, K.; FALLONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase cataly- sed chain reaction. Methods of Enzy- mology, 55, 335-350, 1987. VOS, P.; HOGERS, R.; BLEEKER, M.; REI- JANS, M.; VAN DE LEE, T.; HORNES, M.; FRIJTERS, A.; POT, J.; PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU, M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nu- cleic Acids Research, 23, 4407-4414, 1995. WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531- 6535, 1990. WILLIAMS, J.G.K.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. Genetic analysis using RAPD ma- rkers. Methods of Enzymology, 218, 704-740, 1993. TEXTOS RECOMENDADOS CAMARGO, L.E.A. Marcadores moleculares no melhoramento para resistência a doenças. In:NASS, LL; Valois, AFC;Melo, IS; Valadares-Inglis, MC. (eds.) Recur- sos Genéticos e Melhoramento. Plantas. Rondonópolis: Fundação MT. 2001. p.995-1010. FUNGARO, M.H.P.; VIEIRA, MLC. Marcado- res moleculares. In: SERAFINI, LA et al. (coord.) Biotecnologia na Agricultu- ra e Agroindústria. Guaíba: Livraria e Editora Agropecuária, 2001. p.153-200. SOUZA,A.P. Biologiamolecular aplicada ao melhoramento. In:NASS, LL;Valois, AFC; Melo, IS; Valadares-Inglis, MC. (eds.) Recursos Genéticos e Melhoramen- to. Plantas. Rondonópolis: Fundação MT. 2001. p.939-965. PINTO, L.R.; VIEIRA, M.L.C.; SOUZA, A.P; SOUZA JR., C.L. Isoenzimas e microssa- télites em plantas. BIOtecnologia Ci- ência & Desenvolvimento, 20, 16- 19. 2001. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 61 62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 PESQUISA Interação com plantas e potencial biotecnológicoInteração com plantas e potencial biotecnológicoInteração com plantas e potencial biotecnológicoInteração com plantas e potencial biotecnológicoInteração com plantas e potencial biotecnológico Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores MicrorganismosMicrorganismosMicrorganismosMicrorganismosMicrorganismos EndofíticosEndofíticosEndofíticosEndofíticosEndofíticos Pedro Accioly de Sá Peixoto Neto Eng° Agro° Mestrando em Biotecnologia (ICB-USP) João Lúcio Azevedo Eng°Agro°Ph.D. emGenética (Shefield-Grã- Bretanha) Professor Titular deGenética da Escola Superior de Agricultura Luiz deQueiroz - ESALQ /USP jazevedo@esalq.usp.br Coordenador do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) UniversidadedeMogidasCruzes, SãoPaulo jazevedo@umc.br Welington Luiz Araújo Biólogo Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas Pós-doutorando doDepto de Genética da Escola Superior de Agricultura Luiz deQueiroz - ESALQ /USP wlaraujo@esalq.usp.br O QUE SÃO MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS? Oestabelecimento das plantas em seus respectivos habitats envolve a sua capacidade em interagir comdife- rentes espécies de seres vivos. Entre estas associações, destacam-se asmu- tualísticas commicrorganismos como os fungos micorrízicos e as bactérias fixadoras de nitrogênio. Além destes, outrosmicrorganismos, chamados de endófitos têm recebido especial aten- çãodevido à sua importância em rela- ção a diferentes espécies vegetais. Neste contexto, o empregodemicror- ganismos em práticas agrícolas tem aumentado substancialmentenosúlti- mos anos, pois tanto na promoção de crescimentovegetal comonocontrole biológicodepragasedoençasdeplan- tas entre outras aplicações, eles se constituem em substitutos de produ- tos químicos, favorecendo desta ma- neira a preservação do ambiente. Em recente artigo nesta mesma publica- ção, Souza (2001b) apresenta uma revisãosobreautilizaçãodosmicrorga- nismos na agricultura e seus efeitos benéficos. Endófitos sãoaquelesmicrorganis- mosquehabitamointeriordasplantas, sendo encontrados em órgãos e teci- dos vegetais como as folhas, ramos e raízes. Esta comunidade endofítica é constituídaprincipalmentepor fungos e bactérias, e ao contrário dosmicror- ganismos patogênicos, não causam prejuízos aos seushospedeiros.Muito pelo contrário, os endófitos podem desempenhar relevante funçãopara a sanidade vegetal, já que atuam como agentes controladores demicrorga- nismos fitopatogênicos, além de poder funcionar tambémnocontro- le de insetos e até proteger a planta contraherbívoros.Estesmicrorganis- mos foram descritos pela primeira vez porBary (1866), porémdurante mais de umséculo eles foramquase que ignorados,principalmentedevi- do ao fato deque se conheciamuito pouco sobre suas reais funções no interior dos vegetais e também por não produzirem em seus hospedei- ros, estruturas externas visíveis. Tal- vezpor isso,microrganismosbenéfi- cosquecolonizamo interiordohos- pedeiro e que formam estruturas visíveis são intensamente estuda- dos. Este é o caso das bactérias fixadoras denitrogênio atmosférico que formam nódulos em raízes e os fungosmicorrízicos cujashifas entre outros efeitos benéficos, aumentam aabsorçãodosnutrientespelos seus hospedeiros.No finaldosanos70do século XX, vários estudos demons- traramqueosmicrorganismosendo- fíticos, que vivem humildemente dentro de plantas sem apresentar plumas, adereçosou paetês que os identifiquem externamente, possu- em algumas funções imprescindí- veis para adefesade seushospedei- ros. Confirmou-se então a hipótese deque estesmicrorganismos vivem numa interação mutualística, rece- bendonutrienteseproteçãodaplanta hospedeira e produzindo compos- tosquímicos comoenzimas, alcalói- des e antibióticos, entre outros, que em certas condições de estresse, causadaspor faltadeágua,presença Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 63 de substâncias tóxicas ou ataque de patógenos ou insetos pragas, prote- gem e auxiliam a planta. Estas consta- tações despertaram o interesse pelos microrganismosendofíticos, surgindo assim um campo de valor biotecnoló- gicoquevemresultandoemummaior conhecimentodestes seres e suas rela- ções não totalmente esclarecidas com aplanta hospedeira. Abiodiversidadevegetal empaíses de clima tropical e subtropical comoo Brasil é imensa. Estima-se que cada espécie vegetal possua microrganis- mosendofíticosaindanãoclassificados e com propriedades pouco conheci- das mas, potencialmente de interesse aplicado.Alémdisso, trabalhos recen- tes tem demonstrado que estes mi- crorganismos endofíticos podem ser utilizadoscomovetoresparaa introdu- çãode características de interessebio- tecnológiconaplanta (Downing etal., 2000; Tomasino et al., 1995). Neste aspecto, fungosebactérias endofíticas poderiamser alteradosgeneticamente e, expressando genes de interesse, serem utilizados para o controle de patógenos, promoçãode crescimento vegetal e síntese de vitaminas, amino- ácidos e vacinas no interior da planta hospedeira. Nesse particular é de extrema im- portância um esforço concentrado na busca de endófitos de valor biotecno- lógico, econômico e acadêmico. São esses aspectos que serão a seguir dis- cutidos incluindo-se também alguns dos resultadosquevemsendoobtidos commicrorganismosendofíticos isola- dos de plantas nativas e cultivadas no Brasil. PENETRAÇÃO DOS ENDÓFITOS NAS PLANTAS E SEU ISOLAMENTO Embora microrganismos endofíti- cos possam ser encontrados em se- mentes, e após a germinação, coloni- zando outras partes da planta, como geralmente ocorre em gramíneas, em muitos vegetais eles não são transmiti- dos por meio de sementes. Sua pene- tração nesses casos, dá-se principal- mente por aberturas naturais ou artifi- ciais, tais como: estômatos (Figura 01), regiãodeemissãode raízes secun- dárias, ferimentos causadospor instru- mentosagrícolas,microferimentosnas raízes ocasionados pelo atrito destas com as partículas do solo, etc. Após a penetração estas bactérias e fungos se disseminamdemaneira sistêmicapara diversaspartesdaplanta,habitandode forma ativa o apoplasto, vasos condu- tores e emalguns casos ocorre coloni- zação intracelular (Hallmann et al., 1997). Cabe aqui distinguir entre micror- ganismosendofíticos, epifíticos (colo- nizam a superfície dos vegetais) e patógenos.Essasdiferenças são,pode- se dizer, de ordem puramente didáti- ca, uma vez quemuitos dosmicrorga- nismosepifíticos,podemeventualmen- te penetrar no interior da planta, en- quantoqueosendófítos,parapenetra- rem no hospedeiro têm primeiro que se localizar na superfície desta, sendo durante esse estágio semelhantes a epífitos, comoobservadocomo fungo Beauveria bassiana em milho (Wag- ner&Lewis, 2000). Por outro lado, em certas condições e fases dos ciclos vitais, um patógeno pode viver em harmoniacomohospedeiro,bemcomo um endófito, após um desequilíbrio ambiental,podecausardanosaplanta. Emoutraspalavras, há, comoobserva- Tabela 01. Exemplos de interações entremicrorganismos endofíticos e plantas hospedeiras. Paramaiores detalhes consultar Azevedo (1998b) e Azevedo et al. (2000) 1. 2. 3. 4. 5. Tipo de Interação Controle biológicode insetos Fungo endofítico:Beauveriabassiana Plantahospedeira:milho Efeito: proteção contra a broca do colmo Proteçãocontra animaisherbívoros Fungo endofítico:Acremonium spp. Planta hospedeira: Lolium spp. E outras Efeito: produção de toxinas dando proteção ao ataque por ovinos e bovinos Efeitos fisiológicos Fungo endofítico: Piriformospora indica Plantashospedeiras:milho Efeito: promoção de crescimento Produçãode fármacospor fungos endofíticos Fungoendofítico:Taxomycesandreanae Composto:AnticâncerTaxol Fungo endofítico: Fusariumsubglutinans Composto: ImunossupressivoSubglutinol Controle dedoenças Bactéria endofítica:Burkholderiacepacia Plantahospedeira: tabaco Efeito: controle de Phytophthora nicotianae Referência Wagner & Lewis (2000) White & Cole (1985) Varma et al. (1999) Stierle et al. (1993) Lee et al. (1995) Coventry & Dubery (2001) 64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 donas diferentes interações biológi- cas, um gradiente e não distinções abruptas entre endófitos, epífitos e patógenos.Aliás, somosnóspesqui- sadores que rotulamos osmicrorga- nismosdentrodessascategorias,pois, estesmicrorganismos sóqueremob- ter nutrientes, crescer, reproduzir e sobreviver, não tendo amenor idéia e nem se interessando emcomonós osclassificamos. Uma vez que osmicrorganismos endofíticos convivemcommicrorga- nismos epifíticos e patogênicos, o isolamento dos mesmos deve ser feito a partir do interior de tecidos e órgãos sadios, evitando-se assim os microrganismos patogênicos. Deve ser feita tambémumadesinfecçãoda superfície do fragmento da planta eliminando-sedessa formaosmicror- ganismos epifíticos. Existe uma série de procedimentos que podem ser utilizadosparao isolamentodeendó- fitos, sendo omanual de isolamento de endófitos recentemente publica- do (Araújo et al., 2002a) indicado para o conhecimento de detalhes necessários para queoprocedimen- to seja feito comsucesso. Entretanto, deve-se ter em mente que sempre alguns raros epífitos e mesmo pató- genospodemser isolados juntamen- te com uma grande quantidade de microrganismosendofíticos (Figura 02).Dessa forma,aquantificaçãodas espécies ougênerosdemicrorganis- mos isolados é um procedimento auxiliar na distinção entre endófitos e eventuais não endófitos. É interessante salientar que, de- vido a desequilíbrios no metabolis- modaplanta, causadosporsituações de estresse, sejam elas de causa naturaloumesmoporpráticas cultu- raismal realizadas, comousoexces- sivo de fertilizantes e outros produ- tosquímicos,podeocorrerumdese- quilíbrio na microbiota endofítica causando uma verdadeira abertura de portas para fitopatógenos. Mes- moummicrorganismoendofíticoque nãoproduzdanos emumadetermi- nada espécie ou variedade de plan- ta, em condições de desequilíbrio, pode se apresentar como um pató- geno para omesmohospedeiro (Di Fiori & Del Gallo, 1995). Diversas espécies de fungos en- dofíticos são taxonomicamente rela- cionadas a fitopatógenos dos mes- mos hospedeiros. Como exemplo pode ser citado o caso de plantas cítricas comoCitrussinensis,naqual o fungoendofíticoGuignardiaman- giferae (syn. G. endophyllicola) é filogeneticamente relacionado à G. citricarpa, o agente causal da man- cha preta do citros (Baayen et al., 2002).Emoutro caso, amutação de um único gene transformou uma linhagem patogênica do fungoCol- letotrichum magna em uma linha- gem endofítica, mostrando que a diferença entre estes dois grupos pode ser muito tênue (Freeman & Rodriguez, 1993). ATIVIDADES DOS MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS Como se observa na tabela 01, osmicrorganismosendofíticosapre- sentamuma série de atividades que podem afetar a planta hospedeira, como por exemplo produzir com- postos comatividadesbiológicasdi- versas; por vezes estes compostos apresentam uma considerável toxi- cidade, como no caso de fungos endofíticosprodutoresdealcalóides responsáveispelaproteçãodasplan- tas, especialmente gramíneas forra- geiras contra animais herbívoros. Também, a síntese de substâncias tóxicas por determinadas plantas contra herbívoros, podeser estimu- lada pela presença de enzimas ou outros compostos dosmicrorganis- mos endofíticos, que atuando sobre certos genes daplanta promovema biossíntese destes metabólitos se- cundários tóxicos. Para aplanta este estímulo aumenta o seu desempe- nhonestehabitat, reduzindoaherbi- voria sobre ela. Emalguns casos, plantas conhe- cidas como tóxicas são, na verdade, hospedeirasdemicrorganismospro- dutores de alcalóides, sendo estes compostos responsáveis por intoxi- caçõesemanimais silvestres, provo- candoanorexia,depressão,uremiae Tabela 02. Exemplos demicrorganismos endofíticos e alguns de seus produtos Endófito Acremonium sp. A. lolii Conopleaelegantula Cryptosporiopsis cf. quercina C. cf. quercina Cytonaema sp. Fusariumsubglutinans Pestalotiopsis microspora Stegolerium kukenani Taxomyces andreanea Compostoquímico LeucinostatinaA Lolitrems, peramina e paxilina Isocumarinas Criptocandina Criptocina Ácido Citônico A e B Subglutinol A e B Taxol Taxol Taxol Atividade biológica Antitumoral e antifúngico Micotoxinas Controle de Choristoneura fumiferana Antifúngico Antifúngico Inibidor de protease em Citomegalovírus Imunossupressivo Antitumoral Antitumoral Antitumoral Referência Strobel &Hess (1999) Rowan (1993) Findlay et al. (1995) Strobel et al. (1999) Li et al. (2000) Guo et al., 2000 Lee et al., 1995 Strobel et al., 1996 Strobel et al., 2001 Stierle et al., 1993 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 65 lipomatoses abdominais, como já ob- servado em cervídeos (Wolfe et al., 1998). Embora estes fungos confiram vantagens para a planta hospedeira, do ponto de vista econômico, podem resultar emsériosprejuízosparapecu- aristas, pois podem ser responsáveis por casosde intoxicaçãoem ruminan- tes, afetando de forma negativa o de- sempenho ou até causando a mortedestes animais.Nabovino- cultura e ovinocultura tem sido constatado casos de prejuízos decorrentedestaassociaçãoentre microrganismos endofíticos pro- dutores de toxinas e gramíneas. Entretanto, os efeitos benéficos dasassociaçõesplantas-endófitos (Tabela 01) são muito maiores que os prejudiciais e é devido a issoqueestesmicrorganismosvem se tornandouma importante fer- ramentaparaaagriculturamoder- na e racional. Estesmicrorganismossão tam- bémcapazesdeproteger asplan- tas contra insetos-pragas e contra patógenos,aumentarocrescimen- to e enraizamento da planta hos- pedeiraeaumentar a sua resistên- cia a estressesbióticos e abióticos (Hallmann et al., 1997). Para tan- to, como já citado anteriormente, osendófitosproduzemdiferentes metabólitos que afetam a intera- ção da planta hospedeira com o meio ambiente. Estas moléculas que podem possuir atividade de hormônios,antibióticos,antitumo- rais entre outras funções biológicas, apresentamgrande interesse industrial e biotecnológico, sendo por essemo- tivo alvo de importantes pesquisas. MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS E A PRODUÇÃO DE FÁRMACOS Nos anos 90 do século passado (século XX) estudos realizados por Stierle et al. (1993) despertaram ainda maiso interessebiotecnológicoparao imensopotencial dosmicrorganismos endofíticos,pois ficouevidenciadoque um fungo endofítico o Taxomyces andreanea encontrado no interior da planta Taxus brevifolia, é capaz de produzir um complexo diterpenóide, o taxol (Stierle et al., 1993), que é um antitumoral de alto valor no mercado internacional. Trabalhos posteriores também mostraram que outro fungo endofítico, Pestalotiopsis microspora isolado da T. wallachiana também produz taxol (Strobel et al., 1996). O taxol é isolado das plantas que alber- gamessesendófitos edeondeeles são extraídos. Com a descoberta de que fungos endofíticos podem também produziro taxolvisualizou-seumnovo processo talvez mais eficiente e me- nosdispendiosoparaaproduçãodeste importante fármaco. Também a des- coberta pode minimizar o perigo de extinção de algumas espécies vege- tais, asquais sãocoletadasparaaextra- ção deprodutosmedicinais. Estes tra- balhos forneceram tambémuma indi- caçãodequepodeocorrer convergên- cianaproduçãodecertosmetabólitos, independente do grupo filogenético. Umaanáliseda similaridadedosgenes envolvidos na rota de biossíntese do taxol, pode também mostrar se ocor- reu transferência de genes da planta para o fungo ou vice-versa. A tabela02apresentaalgunsexem- plos de fármacos produzidos por mi- crorganismos endofíticos.Muitos des- tes compostos naturais de alto valor agregado e produzidos empequenís- simas quantidades pelas plantas po- dem ter seus genes principais da rota metabólica chave estudados nos mi- crorganismos endofíticos produtores do composto; é uma tarefamuitomais fácil tendo em vista a menor comple- xidade genômica, que abre ex- celentes perspectivas para a utilizaçãodaengenhariagenéti- ca visandopromover o aumen- to daproduçãodestes compos- tos ou manipulações visando a obtenção de antitumorais mais eficientes e de menor toxidez. Dopontode vista ecológico é extremamente importante a descoberta de fontes microbia- nas produtoras de fármacos de alto valor agregado,porémpro- duzidosemquantidades reduzi- dasporespécies vegetais. Estas, devidoaoextrativismopredató- rio estão ameaçadas de extin- ção. Os endófitos apresentam- se comoumaperspectivamuito importante para garantir a pre- servação destas espécies, man- tendoaproduçãodecompostos quegarantamavidadepessoas afetadaspor inúmerasdoenças. Além destes compostos de grande valor econômico, outro potencial biotecnológico que vem despertando muito inte- resse já há vários anos, é o que se relaciona com fungos e bac- térias endofíticas comoprodutores de novosantibióticoseantifúngicos(Man- dala et al.,1997; Strobel et al., 1999; Rodrigues etal., 2000; deAraujo etal., 2000;Marcon, 2002). Comautilização abusiva e indiscriminadados tradicio- nais antibióticos e fungicidas, o surgi- mento de microrganismos patogêni- cos multi-resistentes, tanto humanos como de animais e de plantas é uma triste realidade. Há assim um imenso mercadoparanovasdrogasdeativida- de antimicrobiana, e sua descoberta principalmente em países de grande biodiversidade, comooBrasil, faz com que as perspectivas para o estudo dos endofíticos sejam bastante promisso- ras, principalmente comapossibilida- de da descoberta de novos antimicro- bianos, que poderão além de comba- Figura 01. Levedura endofítica no interior de estômatos de folhas de plântulas de citros. Foto gentilmente cedida por C.S. Gai (Depto deGenética/ESALQ/USPeNAP/MEA) 66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 ter pestes, gerar dividendos para o país. MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS E O CONTROLE BIOLÓGICO Oaumentodapopulaçãomundial exige que a produção de alimentos cresçade formasignificativa. Para isso, a utilização de produtos químicos no controle de pragas e doenças de im- portância agrícola pode causar sérios problemasaomeioambiente, osquais poderiamserevitadoscomautilização docontrolebiológico.Estebiocontrole pode ser feito alterando as condições ambientais quepossibilitamoapareci- mentodapragaoudoença,ouutilizan- domicrorganismos compropriedades antagônicas aos patógenos ou parasi- tando as pragas. No Brasil o controle biológico começoua ser utilizadocom o fungo entomopatogênico Metarhi- Tabela 03. Bactérias endofíticas isoladas de tecidos vegetais sadios, com potencial para o controle biológico de doenças fúngicas ebacterianas* Endófitos Alcaligenespiechaudii Arthrobacter ilicis; Agrobacterium tumefaciens; Bacillus brevis; B. megaterium; Cellulomonas turbata; Curtobacterium citreum; Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas cichorii; P. corrugata; Xanthomonas campestris; X. Oryzae Bacillus spp. Bacillusalcalophilus; Curtobacterium luteum; Pseudomonas sp.; Serratia liquefaciens; S. plymuthica Bacillusamyloliquefaciens B. cereus B. pumilus B.subtilis Burkholderiacepacia C. flaccumfaciens Enterobacter cloacae Kluyveraascorbata Pantoeaagglomerans Pseudomonas sp. P. aureofaciens P. denitrificans P. fluorescens P. putida P. solanacearum Streptomyces sp. Patógeno Xanthomonas campestris Rhizoctonia solani Verticilliumdahliae Erwinia carotovora var. atroseptica Botrytis cinerea e E. carotovora var. atroseptica R. solani; Sclerotium rolfsii Botrytis cinerea; Colletotrichum orbiculare; Erwinia tracheiphila; Fusarium oxysporum; Pseudomonas syringae pv. lacrymans; R. solani; Sclerotinia rolfsii Colletotrichumorbiculare; Cryphonectria parasitica; E. tracheiphila; Phoma tracheiphila P. syringae pv. lacrymans; Pythium ultimum; R. solani; S. rolfsii F. oxysporum f. sp. cubense C. orbiculare; E. tracheiphila; E. carotovora var. atroseptica; P. syringae pv. lacrymans; R. solani F. moniliforme X. campestris pv. campestris E. carotovora var. atroseptica; E. amylovora; R. solani Verticilliumdahliae A. tumefaciens Ceratocystis fagacearum Agrobacterium tumefaciens; C. orbiculare; F. oxysporum; Phoma tracheiphila; P. syringae pv. lachrymas; Pythium ultimum; R. solani; S. rolfsii C. fagacearum; R. solani V.dahliae Phytophthora cinnamomi e Pestalotiopsis sydowiana Hospedeiro Repolho Trevo e batata Acer sp. Batata Batata e pêra Algodão e feijão Pepino, pêra, tomate, algodão, feijão Algodão, feijão, pepino, castanha,poncã Banana Batata, pepino, trevo Algodãoemilho Repolho Batata, pêra, trevo Tomate Uva e framboesa Carvalho Algodão, arroz, cravo, framboesa, pepino, poncã, rabanete, tomate, uva. Arroz e carvalho Batata Rododendron * de acordo com Araújo (2000) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 67 ziumanisopliaee comoBaculovírus, no controle das cigarrinhas da cana e das pastagens e no controle da Anti- carsia gematalis na soja, respectiva- mente (paramaiores detalhes consul- tar Athayde et al, 2001; Alves, 1998). Na cultura do cacau, o fungo Tricho- derma tem sidoutilizado em restos de ramosdoentesparaocontro- ledo fungoCrinipellisperni- ciosa, agente causal da vas- soura de bruxa, mostrando ser esta uma importante es- tratégia para a redução da utilizaçãodecompostosquí- micos. Osmicrorganismosendo- fíticoshabitamumnichoeco- lógico semelhante aquele ocupadopor fitopatógenos, podendo assim controlá-los pormeiode competiçãopor nutrientes,produçãodesubs- tâncias antagônicas, parasi- tandoopatógenooumesmo induzindo a planta a desen- volver resistência. Além dis- so,podemcolonizar aplanta e posteriormente parasitar um inseto praga que tentar se alimentar da planta hos- pedeira. Para aumentar os efeitos be- néficos destes microrganismos para a planta, permitindo a sua utilização na agricultura, deve-se inicialmente co- nhecer as espéciesmicrobianas envol- vidas e as estratégias utilizadas pelos microrganismos nesta interação, para posteriormente poder cultivar o (s) microrganismo (s) e reinoculá-lo (s) nas plantas de interesse. Estudos têm mostrado que pelo menos 15 gêneros de bactérias são capazesdecontrolardoenças fúngicas oubacterianas;destes,BacillusePseu- domonas tem mostrado um maior potencial para o controle efetivo de doenças (Tabela03). No casode fun- gos endofíticos, os gênerosNeotypho- dium (sin. Acremonium) e Fusarium tem sido utilizados para o controle biológico, vistoqueapresentam resul- tados promissores nesta área (Tabela 04).O fungopatogênicoRhyzoctonia solani de batata (Solanum tubero- sum), tem sido, em certas condições, controladopormicrorganismosendo- fíticos. NoBrasil, a cultura do repolho tem recebidoespecial atençãoe resul- tados importantes foram obtidos no controle de Xanthomonas campes- trispelasbactérias endofíticasAlcali- genes piechaudii e Kluyvera ascor- bata (Assis et al., 1998). Na ESALQ/ USPemPiracicaba, estudos têm sido conduzidosparaodesenvolvimento de estratégias de controle biológico de X. fastidiosa (Marcon, 2002) e Rhyzoctonia solani (Figura 02). Normalmente,omecanismomais importante de controle biológico de doenças é por meio da indução de resistência sistêmica (IRS).Neste tipo de controle, a penetração ativa do microrganismoendofíticoinduzaplan- ta hospedeira a sintetizar compostos que atuamsobreopatógenooualte- ramamorfologia vegetal. Estas altera- ções morfológicas e fisiológicas po- demincluir aumentodaparedecelular por deposição de lignina e glucanas e aumentodaespessuradacutícula,bem comoa síntesede fitoalexinas, dificul- tando a entrada do patógeno e o seu desenvolvimentonaplanta hospedei- ra. Neste aspecto, plantas de propagação in vitro ou via se- mentes podem apresentar van- tagens emrelaçãoaoutras espé- cies de propagação vegetativa, pois o endófito poderia ser apli- cado diretamente na cultura in vitroouna semente, permitindo a colonizaçãodaplantapelo en- dófito sem competição comou- trosmicrorganismose facilitando a aplicaçãopráticadesta estraté- gia. Linhagens avirulentas ouhi- povirulentas do patógeno tam- bém têm sido utilizadas para a IRS, pois elas podemcolonizar a planta semcausar doenças,mas sãoreconhecidaspelaplantaque ativa o seu sistema de defesa, impedindooestabelecimentodo patógeno. Pode haver também competição com o patógeno pelonichoecológico, diminuin- do a possibilidade da linhagem pato- gênica em colonizar a planta hospe- deira. Em tomate, a mancha causada por Fusarium oxysporum pode ser controladautilizando linhagens aviru- lentasdopatógeno,asquaiscolonizam endofiticamenteohospedeiroe impe- demaentradade linhagensvirulentas. Omicrorganismo endofítico pode parasitar células do patógeno, impe- Figura 02. Isolamento de fungos endofíticos a partir de (A) caule e (B) raízes de soja. Foto gentilmente cedida por RodrigoMendes, ESALQ/USP Figura 03. Fungo fitopatogênico Rhyzoctonia solani sendo inibidopor umabactéria endofítica de Eucalyptus grandis. A) Observar região de inibição do endófito sobre o patógeno; B) Crescimento do fitopatógeno sem o endófito (controle). Foto gentilmente cedida por Rudi E. L. Procópio (ESALQ/USP) 68 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 dindoo surgimentode sintomas.Nor- malmente, nesteparasitismoestãoen- volvidas enzimas líticas comoquitina- ses e proteases, que destroem o pató- geno. Entretanto, neste tipo de intera- ção deve ocorrer a necessidade do encontro entre opatógenoeomicror- ganismoendofítico.Emborapossaocor- rer atraçãoquímica entre estesmicror- ganismos, o contato entre eles às ve- zes ocorre ao acaso, dificultando o controle, visto que, o endófito e o patógeno podem colonizar regiões diferentes da planta. Neste caso, cabe aopesquisador selecionar os organis- mosendofíticosquecolonizemomes- mo nicho do patógeno, que sejam mais competitivos e que inibam o patógeno de forma mais eficiente. A utilização de endófitos para o controle de doenças fúngicas e bacte- rianas temsido consistentementedes- crita na literatura. Por outro lado, pou- cosestudossãodirecionadospara inte- rações entre bactérias e fungos endo- fíticos e vírus, pois, estes organismos ocupamnichosdiferentes (bactérias e fungos colonizam preferencialmente espaços intercelulares de raízes e par- tes baixas da planta, enquanto vírus são intracelulares de partes aéreas do hospedeiro). Entretanto, eles depen- demdometabolismodaplanta e, por- tanto, podemcompetir por nutrientes derivadosdohospedeiro. Acredita-sequeosmicrorganismos endofíticosevoluíramcomosseushos- pedeiros, apresentandoassimuma ín- tima interaçãomutualística.Dessa for- ma, do ponto de vista evolutivo, para os endófitos presentes em tecidos ve- getais, a herbivoria pode impedir a sobrevivência e disseminação das es- pécies sendo, portanto, interessante umareduçãodestaherbivoria.Estudos pioneiros nos anos 80 verificaramque a presença de fungos endofíticos po- deria reduzir o ataque de insetos àplanta hospedeira, sendo descrito, a partir deste período, inúmeras espéci- es com potencial para o controle bio- lógico de pragas (Tabela 05). Posteriormente, verificou-se que esta reduçãodaherbivoriaocorredevi- do a produção de compostos que re- duzem a atratividade da planta, au- mentama susceptibilidadedo inseto a doenças ou inibem o seu desenvolvi- mento. Estes estudos foram realizados principalmente emgramíneas dos gê- neros Loliume Festucaemassociação com o fungo Neotyphodium, o qual diminui a incidência de insetos de diferentes ordens como afídios, cole- ópteros, hemípteros e lepidópteros (paramaiores detalhes consultar Aze- vedo et al., 2000). Como já descrito anteriormente, inúmeros fungos endofíticos produ- zemalcalóidesquandoemassociação com o hospedeiro. Estes alcalóides podemapresentar atividade inseticida enematicida, protegendodesta forma seus hospedeiros. Em alguns casos o controle depragas por fungos endofí- ticos é indireto, pois ometabólito pro- duzidopelo fungo retardaodesenvol- vimento da larva, e este aumento do tempo de desenvolvimento leva o inseto à morte É importante salientar também que fatores ambientais po- dem estar envolvidos, pois, foi verifi- cadoque embaixos níveis denutrien- tespara aplanta, o endófitoNeotypho- dium coenophialum torna o hospe- deiro resistente à larvas de Spodoptera frugiperda.Entretanto,quandoonível denutriente é elevadonão foi verifica- da significativa reduçãodaherbivoria. A interaçãoentre estes organismos é tão complexa que em alguns casos, uminsetopode reconhecera regiãoda planta infectadapelo endófito, evitan- doamesma.Estesdadosmostramque autilizaçãopráticapode serpromisso- ra, mas exige complexos estudos, uti- lizando comunidades de endófitos e insetos em cada hospedeiro, visando uma reprodução confiável das condi- ções ambientais emque se esperaque ocontroleocorra. MECANISMOS DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO VEGETAL Microrganismos endofíticos têm apresentado a capacidade de estimu- lar o crescimento das plantas por me- canismos diretos (fixação de nitrogê- nioe/ouproduçãode fitohormônios)e pormecanismos indiretos (antagonis- mo contra patógenos ou resistência a drogas). Épossível quebactérias epifí- ticas ou endofíticas possampromover oaumentodeprodutividadedaplanta por sintetizar substânciasqueatuamna regulação do crescimento e/ou por fixar nitrogênio atmosférico. Entretan- to, o conhecimento do genótipo da planta e domicrorganismo envolvido na promoção é de extrema importân- cia. Neste aspecto, bactérias endofíti- cas dos gênerosAcetobacter,Acineto- bacter, Actinomyces, Agrobacterium, Azospirillum,Bacillus,Burkholderia, Figura 04. Resposta de Eucalyptus citriodora à inoculação de bactéria endofítica. C) controle sem inoculação e PG-S) com inoculação de bactéria endofítica. Foto gentilmente cedida por Rudi E. L. Procópio (ESALQ/USP) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 69 Curtobacterium,Pantoea,Pseudomo- nas eXanthomonas, entre outros têm sido freqüentemente utilizadas. Além das bactérias, os fungos endofíticos também podem promover o cresci- mento vegetal; entre as espécies mais estudadas estáPiriformospora indica, umbasidiomicetoque coloniza endo- fiticamente raízes de inúmeras espéci- es vegetais, aumentando o seu cresci- mento. Omecanismodepromoçãodecres- cimento vegetal por microrganismos endofíticos ainda necessita de mais estudos para ummelhor entendimen- to dos fatores envolvidos. Além da interação entre o genótipodaplanta e a comunidade endofítica promotora de crescimento, outros fatores intera- gemnesteprocesso, comoas comuni- dadesmicrobianasepifíticaseda rizos- fera. Foi observado que as bactérias endofíticassãomenosadaptadasacom- petiçãomicrobianadoqueas rizobac- térias e que a promoção ou a eficácia destas pode ser reduzida na presença de outras bactérias na raiz. Neste as- pecto, foi observado que a promoção de crescimento vegetal por endófitos pode ser influenciada pela rotação de cultura, interaçãocompatógenos, fixa- ção de nitrogênio e síntese de fitohor- mônios. Os hormônios vegetais são regu- ladores naturais de crescimento das plantas, influenciando os processos fisiológicosembaixasconcentrações. Os fitohormôniospodemser classifi- cados como auxinas (diferenciação celular, crescimento radicular, pro- movemcrescimentodos frutosecon- trolamaabscisão), citocininas (regu- laçãodocrescimento,diferenciaçãoe senescência vegetal), giberelinas (di- visão e alongamento celular, inter- rompemadormência e aumentamo desenvolvimento dos frutos), ácido abscísico (regulaçãoda transpiração, na quebra dadormência e nodesen- volvimento inicial das sementes) e etileno (amadurecimentodos frutos, abscisão de folhas, flores e frutos, e expressão do sexo feminino). No Brasil, estudos têm sido con- duzidos com linhagens de Azospiri- llum lipoferum, A. brasilense e Glu- conoacetobacter diazotrophicus ca- pazesdeproduzir ácido indol acético (AIA) e compostos relacionados. Es- tas bactérias tambémsão capazes de fixar N 2 , aumentado o seu potencial para a promoção de crescimento. Outras bactérias comoBurkholderia cepacia, Methylobacterium spp. e Pantoea agglomerans têm sido ava- liadas quanto à promoção de cresci- mentodeabacaxi, citroseeucaliptos, respectivamente. No laboratório de GenéticadeMicrorganismos (Depto. deGenética, ESALQ/USP) foi obser- vado que uma bactéria endofítica, aindanão identificada, podeaumen- tar ematé 40%ocrescimento invitro de plântulas de eucalipto (Figura 04). ENDÓFITOS E TECNOLOGIA DODNA RECOMBINANTE Um maior conhecimento da mi- crobiotaendofíticaassociadoa tecno- logia do DNA recombinante poderá ampliar as oportunidades de utiliza- çãodosendófitosnocontrolebiológi- co e na promoção de crescimento, bem como na síntese de compostos de interesse farmacêutico e industri- al. Neste contexto, futuramente os microrganismosendofíticospoderão ser utilizados como vetores para a Figura 05. Fungos endofíticos isolados de caules de Eucalyptus spp. A) Rhodotorula sp.; B) Cryptococcus laurentii; C) Xylaria sp.; D) Mycelia sterilia 1; E) Mycelia sterilia 2; F) Hormonema sp. Fotos gentilmente cedidas por Aline Romão e Ricardo Yara, ESALQ/USP 70 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 introdução de genes heterólogos na planta hospedeira, visto que podem ser, mais facilmente que as plantas, alterados geneticamente e reintrodu- zidosnohospedeiroconferindonovas característicasde interesse agropecuá- rio àplanta.Oprimeiroexemplodeste tipo de aplicação ocorreu em milho inoculado comuma linhagemdabac- téria endofíticaClavibacterxyli subsp. cynodontis, na qual foi introduzido o gene da endotoxina de Bacillus thu- ringiensis. Este gene expressa uma proteína cristal, que quando ingerida pela broca domilho (Ostrinianubila- lis), causa a morte do inseto. A inocu- laçãodabactériaendofíticaexpressan- do esta proteína tornou as plantas de milho resistentes a esta broca, mos- trando a eficiência desta estratégia no controle de pragas (Tomasino et al., 1995). Este gene foi introduzido tam- bém em Bradyrhizobium japonicum e após colonização desta bactéria em raízes deCajanuscajan, a planta hos- pedeira se tornou resistente à Rivelia angulata (Nambiar et al., 1990). Estratégia semelhante foi utilizada para o controle da broca da cana. Entretanto, foi verificadoqueocontro- le desta broca foimais eficiente quan- do dois genes heterólogos que codifi- cam a proteína cristal de B. thuringi- ensis e quitinase de Serratia marces- cens que degrada o exoesqueleto da lagarta, foramintroduzidosembactéri- as endofíticas e estas testadas na dieta da lagarta (Downing et al., 2000). A tecnologia doDNArecombinan- te também pode favorecer o entendi- mento da interação endófito-planta, pois permite a expressão de genes marcadoresnosmicrorganismosendo- fíticos de interesse, facilitandoa sua detecçãonohospedeiro epermitindo o monitoramento destes organismos naplanta enomeio ambiente (Murray et al., 1992; Yates et al., 1999). Este tipode trabalhopermite umestudoda dinâmicadacolonizaçãodomicrorga- nismoendofíticonaplanta, favorecen- do a utilização destes para o controle de pragas ou doenças. No Departamento de Genética da EscolaSuperiordeAgricultura Luizde Queiroz (ESALQ/USP) emPiracicaba foram desenvolvidos vetores de ex- pressão de genes heterólogos para as bactériasendofíticasdecitros,P.agglo- merans, E. cloacae e Methylobacte- rium spp. Neste trabalho o objetivo principal é expressar um gene de Endoglucanase (EglA)clonadoapartir de Bacillus pumilus e que deve estar envolvido na via de degradação de gomaxantana e goma fastidiana (Ara- újo etal., 2001a), as quais sãoproduzi- das pelas bactérias fitopatogênicas Xanthomonas campestris e Xylella fastidiosa, respectivamente e que podemestar relacionados apatogeni- cidade destas bactérias. Dessa forma, espera-se que a expressão destes ge- nes em uma bactéria endofítica de citros,possa reduziros sintomasdestas Tabela 04. Fungos endofíticos com potencial para o controle biológico de doenças causadas por fungos e nematóides Endófito Colletotrichum magna Fusarium spp. Neotyphodium spp. Patógeno C.magna Radopholus similis (nematóide) Drechslera sorokiniana; Fusarium graminearum; F. culmorum; Rhizoctonia cerealis e Gaeumannomyces gramini Hospedeiro Citrullus lanatus e Cucumis sativus banana Lolium sp.; Triticum spp. e Festucaarundinacea Referência Redman et al., 1999 Pocasangre et al., 2000 Tunali et al., 2000 Tabela 05. Fungos endofíticos com potencial para o controle de biológico de insetos- pragas Endófito Acremonium sp. A. alternatum A. coenophialum A. lolii A. strictum Balansiacyperi Beauveriabassiana Cladosporium shaerosperum Disculaquercina Epichloe sylvatica Neotyphodium spp. N. lolii Rhabdoclineparkeri Inseto praga Parapediasia teterrella Plutellaxylostella Parapediasia teterrella Microctonus hyperodae Trialeurodes vaporariorum Spodoptera frugiperda Ostrinianubilalis Adelges abietis Besbiscus mirabilis S. frugiperda Blissus leucopterus Listronotus bonariensis Contarinia sp. Referência Koga et al., 1997 Raps & Vidal, 1998 Koga et al., 1997 Barker & Addison (1996) Vidal, 1996 Clay et al., 1985 Wagner & Lewis, 2000 Lasota et al., 1983 Wilson&Carroll, 1997 Brem & Leuchtmann, 2001 Richmond & Shetlar, 2000 Goldson et al., 2000 Sherwoodpike et al., 1986 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 71 doenças, que têm causados sérios prejuízosparaa citriculturabrasileira. MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS NO BRASIL Talvezosprimeiros estudos sobre o isolamento de fungos endofíticos foram os de Robrigues (1994) e Ro- drigues e Samuels (1992) que isola- ramdeumapalmeira, o açaí (Euterpe oleracea) várias espécies de fungos, incluindo algumas até aquela época desconhecidas.Os autores salientam opotencialbiotecnológicodessesmi- crorganismos.Poroutro lado,bactéri- as endofíticas tem sido isoladas de diferentes gramíneas e de outros ve- getais, especialmente as bactérias fi- xadoras de nitrogênio como Gluca- noacetobacter diazotrophicus isola- dadecana-de-açucarequemais tarde foi isoladadebatata-doce(Cavalcante e Dobereiner, 1989). Uma recente revisão (Baldani etal, 2002) apresen- tadetalhes sobrebactériasendofíticas fixadorasdenitrogêniooudiazotrófi- cas isoladas no Brasil e seu vasto potencial deutilizaçãonaagricultura. A partir de 1990 foram iniciados, nos laboratóriosdoDepartamentode GenéticadaESALQ/USPemPiracica- ba,pesquisas comfungosendofíticos isolados de plantas tropicais como a leguminosa forrageira Stylosanthes, a bananeira (Pereira, 1993a), o milho (Souza, 1996) e depois a soja (Men- des et al., 2001) citros (Araújo et al. 2001b; Araújo et al. 2002; Glienke- Blanco etal., 2002), cacaueiroeeuca- lipto entre outros. Os estudos foram, emseguida, ampliadosparaabranger tambémamicrobiota endofítica bac- teriana. Alémdemostrar a diversida- demicrobiana existente nessas plan- tas (Figuras 02 e 05), aspectos de interessebiotecnológicoencontrados nesses microrganismos estão sendo explorados. Como mencionado no item anterior, atenção especial vem sendodada ao estudodas interações entre endófitos e patógenos deplan- tas cítricas em uma tentativa do con- trole biológicodepatógenos. Emeu- calipto e soja vários endófitos tem tambémsemostradoapropriadospara controle biológico e para promoção de crescimento; outros, tem capaci- dadesdebiodegradaçãodepesticidas e de produzir antibióticos. Trabalhos comendófitos tem sido também reali- zados emUniversidades, entre outras asdoAmazonas, deGoiás, Pernambu- co, Caxias do Sul e Mogi das Cruzes, complantasdaamazônia,docerradoe damata atlântica. As tabelas 06 e 07 apresentam alguns exemplos de estudos realiza- dosnonossopaís.Mais recentemente, um amplo estudo integrado sobre a microbiota endofítica de plantas de interesse econômico ou emperigo de extinção comoéocasoda samambaia Dicksoniasellowiana,está sendocon- duzidograçasaoapoiodaFundaçãode Amparo a Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP).Oprojeto, coordena- do pelo Dr. Itamar Soares de Melo (CNPMA-EMBRAPA, Jaguariúna, SP) tem como objetivos, em um esforço conjuntoabrangendováriosgruposde pesquisa, caracterizar e preservar en- dófitos além de pesquisar o potencial biotecnológico dos mesmos (http:// www.cnpma.embrapa.br/projetos/en- dofiticos/).Certamente,empoucotem- po, resultados de valor aplicado esta- rão disponíveis permitindo o uso da biodiversidade microbiana nos mais diversos segmentos dabiotecnologia. CONSIDERAÇÕES FINAIS Levando-se em conta que existem aproximadamente 300 mil espécies deplantas já catalogadas e quemuitas delas, já estudadas com relação à mi- crobiota endofítica, apresentam até 5 ou mais novas espécies de fungos , pode-se chegar ao número ainda su- bestimado de um milhão e meio de fungos existentes em nosso planeta. Destes, apenas 4,6% são conhecidos. Noritmoatualde identificaçãocalcula- se que para que todas as espécies de fungos sejam identificadas, há ainda cerca de 800 anos pela frente (Azeve- do, 1998a). Levando-se em conta que o processo co-evolutivo das espécies vegetais se deu lado a lado com esta microbiota endofítica equeasmudan- ças climáticas ao longo dos milênios levaram a um processo de seleção natural eficientegerandovariabilidade genéticaparaasplantas emicrorganis- mos, as perspectivas abertas para o estudodestamicrobiotaendofítica são imensas, principalmente no que se refere a estudosbiotecnológicos, tanto a nível molecular descobrindo genes importantes ligados ao controle bioló- gicodepragas edoenças, produçãode enzimas, biorremediação de compos- tos tóxicos, como também para a pro- dução de metabólitos secundários de atividades terapêuticas e de grande valor agregadonomercado internacio- nal. Principalmente deve ser levado em consideração, que são ainda em pequeno número as pesquisas com endófitosdeplantas tropicaisondedeve se concentraromaiorpotencial biotec- nológico da área. Muitas empresas e países já perceberam essa potenciali- dade.Cabe anósproteger eutilizar em nosso benefício a biodiversidade mi- crobiana não apenas endofítica, mas, toda amicrobiota existente em regiões tropicais e subtropicais. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPESP (Proc. no. 98/16262-2) pelo suporte financeiroconstanteduranteaelabora- ção deste trabalho e a bolsa de pós doutorado aWelington Luiz deAraújo (Proc. no. 00/010699-1). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALQUATI,S.A.B.Paracoccidioidesbra- siliensisnãoocorre na formaendo- fítica emgramíneasda regiãoendê- mica de Botucatu, SP. Brasil. Botu- catu,UNESP, 1999, 115p.,Disserta- çãoMestrado. ALVES, S.B. Controlemicrobiano de insetos. Piracicaba, FEALQ, 1998, 1163 p. ARAÚJO,W.L.; LIMA, A.O.S.; AZEVE- DOJ.L.;MARCON, J.; KUKLINSKY- SOBRAL, J.; LACAVA, P.T.Manual: IsolamentodeMicrorganismosEn- dofíticos. CALQ, Piracicaba, 86p., 2002a. ARAÚJO,W.L.;LIMA,A.O.S.;MACCHE- RONI JR., W; FUNGARO, M.H.P.; ANDREOTE,F.D.; SOUZA,L.A.; LA- CAVA,P.T.; AZEVEDOJ.L.Biologi- cal control of plant diseases by en- dophytic bacteria expressing a he- terologous protein from Bacillus sp. In: R. Sheves & J. Macke (Eds.), IUPACChemrawnXIVConference in Green Chemistry, Univ. Colora- do, Boulder (eletrônico), 2001a.ª 72 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Planta Anacardiumoccidentale (cajueiro) Citrus spp. (Laranja, tangerina e limão) Euterpe oleracea Glycinemax (soja) Gramíneas Himanthus sucuuba (sucubaou janaguba) Ilex paraguatiensis (Erva-Mate) Musa sp. (bananeira) Pachystrizus erosus (jacatupé) Paulicourea longiflora (erva de rato) Paulliniacupana (guaraná) Pueraria phaseoloides (puerária) Scleria pterota (trança) Spondias mombin (Anacardiacea) Stryctupos cugens (curare) Stylosanthes sp. (leguminosa forrageira) Theobromagrandiflorum (cupuaçú) Vignaunguiculata (caupí) Zea mays (milho) Fungos endofíticos Colletotrichum gloeosporioides; Fusarium solani; Guignardia sp.; Phomopsis sp.; P. anacardii; Pestalotia sp. Rhodotorulaglutinis,Candida famata (teleomorfoDebaryomyceshansenii), Cryptococcus laurentti, Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia citricarpa, Cladosporium sp. Colletotrichum gloeosporioides; F. sentectum; F. oxysporum; Pestalotia palmarum; Xylaria cubenses Ascochyta sp., Cladosporium sp.,Colletotrichum sp., Fusarium spp., Phyllosticta sp., Nodulosporium sp. e Xylaria sp. Acremonium sp.; Fusarium sp. e Ustilago sp. Colletotrichum sp.;Guignardia sp.;Glomerella sp.; Phomopsis sp.; Pestalotia sp. e Xylaria sp. Acremonium sp.; Aspergillus sp.; Colletotrichum sp.; Fusarium spp.; Paecilomyces sp.; Papulosporium sp.; Penicillium sp. e Nodulosporium sp. Alternaria sp.; Aspergillus sp.;Cordanamusa; Curvularia sp.;Dreschlera sp.;Epicoccum purpuracens;Fusarium sp.;Glomerella cingulada; Humicola sp.; Nigrospora oryzae; Periconia sp.; Phomopsis sp.; Phyloslicta sp.; Trichoderma sp.; Xylaria spp. Mucor e Rhizopus Aspergillus niger; Colletotrichum sp.;Guignardia sp.; Glomerella sp.; Phomopsis sp. e Xylaria sp. Guignardia sp.; Phomopsis sp.;Glomerella cingulada;Xylaria sp. Glomerella cingulada;Humicola sp.;Xylaria sp. Curvularia sp.; Glomerela cingulata e Pestalotia sp. Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia sp., e Phomopsis sp. Aspergillus niger; Colletotrichum sp.;Guignardia sp.;Trichoderma sp. Alternariasp.;Glomerellacingulada;Glomerella sp.; Nigrospora oryzae; Nodulisporium sp.; Periconia sp.; Phomopsis sp.; Phyloslicta sp.; Xylaria spp. Fusarium sp.;Glomerellacingulada;Guignardia sp.; Humicola sp.; Pestaliotia sp. Aspergillus sp.; Fusarium sp.; F. equiseti; F. solani; F. sentectum; F. oxysporum; F. anthophilum; F. moniliforme; Penicillium sp. Acremonium sp.; Aspergillus sp.; Beauveria sp.; B. bassiana; Chaetomium sp.; Colletotrichum sp.; Curvularia sp.;Dreschlera sp.; Fusarium sp.; F. moniliforme;Glomerella cingulada;Humicola sp.; Paecilomyces sp.; Penicillium spp.; Periconia sp.; Phomopsis sp.; Nigrospora oryzae; Rhizopus sp.; Scopulariopna sp.; Syncephalastrum sp.; Trichoderma sp.;Xylaria sp. Referência Medeiros (1988) e Oliveira (1999) Gai et al. (2000); Glienke (1996); Araújo et al. (2001b) Rodrigues (1999) e Rodrigues&Samuels, (1992) Mendes et al. (2001) e Pimentel (2001) Alquati (1999) Magalhães (2000) Penna (2000) Pereira et al.(1999) Stamford (1997) Souza (2001a) Guimarães (1998) Galvão (1998) Galvão (1998) Rodrigues&Samuels (1999) Souza (2001a) Pereira et al. (1993) e Pereira (1993). Galvão (1998) Rodrigues (1999) Pimentel (2001); Pamphile(1997); Pamphile e Azevedo (2002); e Silva (1997) Tabela 06. Alguns exemplos de fungos endofíticos isolados de plantas no Brasil Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 73 ARAÚJO, W.L.; MARCON, J.; MAC- CHERONI JR., W; VAN ELSAS, J.D.;VANVUURDE, J.W.L.&AZE- VEDO, J.L.DiversityofEndophy- ticBacterial Population and Inte- raction with Xylella fastidiosa in Citrus Plants. Applied and Envi- ronmental Microbiology, 68: 4906-4914, 2002b. ARAÚJO, W.L.; SARIDAKIS H.O.; BARROSO,P.A.V.;AGUILAR-VIL- DOSO,C.I.; AZEVEDOJ.L.Varia- bility and interactions between endophyticbacteriaandfungi iso- lated from leaf tissues of citrus rootstocks.Canadian Journalof Microbiology,47:229-236,2001b. ARAÚJO, W.L. A comunidade bac- teriana endofítica de citros e sua interação comXylella fastidiosa, agentecausaldaCloroseVariega- da dos Citros (CVC). Piracicaba: ESALQ/USP, 2000. 131p. Tesede Doutorado. ASSIS, S.M.P.; SILVEIRA,E.B.;MARI- ANO,R.I.R.;MENEZES,D.Bacté- riasendofíticas-Métodosde isola- mentoepotencial antagônicono controle da podridão negra em repolho. Summa Phytopatholo- gica, 24:216-220. 1998. ATHAYDE,A.C.L.; FERREIRA, U.L.; LIMA,E.A.L.A.Fungosentomopa- togênicos.Biotecnologia, 21: 12- 15, 2001. AZEVEDO, J.L.; MACCHERONI Jr., W.;PEREIRA, J.O.;ARAÚJO,W.L. Endophytic microorganisms: a review on insect control and re- cent advances on tropical plants. EJB: Electronic Journal of Biote- chnology [on line]. 3: 40-65, 2000. AZEVEDO, J.L. Biodiversidade mi- crobiana epotencial biotecnoló- gico. In: Ecologia Microbiana. Eds.MELO, I. S. eAZEVEDO, J.L. Jaguariúna, Embrapa- CNPMA,1998b,p.117-137. AZEVEDO, J.L. Microrganismos en- dofíticos. In:EcologiaMicrobi- ana.Eds.MELO, I.S.eAZEVEDO, J.L. Jaguariúna:Embrapa-CNPMA, 1998a, p.445-461. BAAYEN, R. P.; BONANTS, P. J. M.; VERKLEY, G.; CARROLL, G.C.; VANDERAA,H.A.;DEWEERDT, M.;VANBROUWERSHAVEN,I.R.; SCHUTTE, G.C.; MACCHERONI Jr., W.; GLIENKEDE BLANCO, C.; AZEVEDOJ.L.Nonpathogenic Iso- lates of the Citrus Black Spot Fun- gus,Guignardiacitricarpa, Identi- fied as aCosmopolitan Endophyte of Woody Plants, G. mangiferae (Phyllosticta capitalensis). Phyto- pathology, 92: 464-477, 2002. BALDANI, J. I.; REIS, V.M.; TEIXEIRA, K.R. S.; BALDANI,V.L.D. Potencial biotecnológicodebactérias diazo- tróficas associativas e endofíticas. In:Biotecnologia:Avançosnaagri- cultura e na agroindústria. (Atti- Serafini,L.;Barros,N.M.&Azevedo, J.L. orgs.) Caxias do Sul, EDUCS, 2002, p.197-232. BARKER,G.M.&ADDISON,P.J. Influ- enceofClavicipitaceousendophyte infection in ryegrass on develop- mentof theparasitoidMicroctonus hyperodaeLoan(Hymenoptera:Bra- conidae) in Listronotus bonarien- sis (Kuschel) (Coleoptera: Curculi- onidae).BiologicalControl, 3: 281- 287, 1996. BARY,A.de.MorphologiePhysiologie derPilze.Flechten,undMyxomyce- ten. Vol. II. Holmeister´s Hand- bookofPhysiologicalBotany,Leip- zig, 1866. BREM, D. & LEUCHTMANN, A. Epi- chloe grass endophytes increase herbivore resistance in the woo- dlandgrassBrachypodiumsylvati- cum. Oecologia, 126: 522-530, 2001. CAVALCANTE,V.A.&DOBEREINER, J. A new acid tolerant nitrogen fi- xingbacteriumassociatedwith su- gar cane. Plant and Soil, 108: 23- 31, 1989. CLAY, K.; HARDY, T.N.; HAMMOND JR., A.M. Fungal endophytes of Cyperus and their effect on the insect herbivore. American Jour- nalofBotany, 72:1284-1289, 1985. COVENTRY, H. S.; DUBERY, I. A. Lipopolysaccharides fromBurkhol- deria cepacia contribute to an enhanced defensive capacity and the inductionofpathogenesis-rela- ted proteins in Nicotianae taba- cum. Physiology and Molecular PlantPathology,58: 149-158, 2001. DE ARAÚJO, J. M.; da SILVA, A. C.; AZEVEDO, J. L. Isolation of endo- phytic actinomycetes from roots and leaves of mayze (Zeamays L.). Brazilian Archives of Biolo- gyandTechnology, 43: 447-451, 2000. DI FIORI, S. & DEL GALLO, M.Endophyticbacteria: their possi- ble role in the host plants. In: FENDRIK, I.; DEL GALLO, M.; VANDERLEYDEN, J.;DEZAMA- ROCZY, M. Ed. Azospirillum VI andrelatedmicroorganisms.Ber- lin: Springer-Velag, 1995,p. 169- 187. DOWNING,K.J.; LESLIE,G.;THOM- SON, J.A.Biocontrolof thesugar- cane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thuringiensis cry1Ac7 and Ser- ratia marcescens chiA gene in sugarcane-associated bacteria. AppliedandEnvironmentalMi- crobiology, 66: 2804-2810, 2000. FINDLAY, J.A.;BUTHELEZI, S.; LA- VOIE,R.;PENA-RODRIGUEZ,L.; MILLER, J.D. Bioactive isocou- marins and related metabolites from conifer endophytes. Jour- nal of Natural Products, 58: 1759-1766, 1995. FREEMAN, S.; RODRIGUEZ, R.J. Genetic conversion of a fungal plant pathogen to a nonpatho- genic, endophyticmutualist. Sci- ence, 260: 75-78, 1993. GAI, C.S.; MACCHERONI JR., W.; ARAUJO, W L; AZEVEDO, J.L. Microscopia eletrônicadevarre- durapara localizaçãode levedu- ras endofiticas em citros (Citrus sinensis) eanalisedevariabilida- de entre os isolados através de marcadoresdeRAPD. In: Simpó- sio Internacionalde IniciaçãoCi- entifica da Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, 2000. GALVÃO, R.M.S. Variabilidade ge- nética detectada por RAPD em Glomerella cingulata , um dos fungosendofíticosmais freqüen- tes, isoladosemTheobromagran- diflorum, Pueraria phaseoloi- des e Scleria pterota. Manaus, FUA/UFSCAR, 1998, 151p. Dis- sertaçãoMestrado. GENARI,R. Características de cres- cimento eproduçãodepectina- ses porKlebsiella oxytoca isola- das de frutos de café. Viçosa, 74 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Tabela 07. Exemplos de bactérias endofíticas isoladas de plantas no Brasil Planta Brassica oleracea var. capitata (repolho) Batata doce, café, Digitaria insularis e gramíneas Citrus spp. (Laranja doce, tangerina e limão) Coffeaarabica (café) Pachystrizus erosus (jacatupé) Pennisetum purpureum, Misanthus sinensis, M. sacchariflorus e Spartina pectinato, Solanumlycocarpum (lobeira) Vignaunguiculata (caupí) Zea mays (milho) Bactérias endofíticas Kluyvera ascorbata eAlcaligenes piechaudii Bactériasdiazotróficas (Burkholderiabrasilensis; Gluconoacetobacter diazotrophicus; Herbaspirillumrubrisubalbicans;H. seropedicae e Paenibacillus sp.) Alcaligenes sp.; Bacillus cereus; B. lentus; B. megaterium; B. pumilus; B. subtilis; Burkholderiacepacia; Curtobacterium flaccumfaciens;Enterobacter cloacae; Methylobacterium extorquens; Nocardia sp.; N. nova; Nocardiopsis spp.; Pantoea agglomerans e Streptomyces spp Klebisiella oxytoca; Paenibacillus amylolyticus; P. pabuli; P. lautu e P. macquarensis Bacillus sp.; Nocardiopsis sp.; Streptomyces sp. e Streptosporangium sp. Bactériasdiazotróficas (Azospirillum lipoferum; Herbaspirillum spp. e H. seropedicae) Streptomyces sp.; Rhodococcus sp., Microlunatus sp. e Luteococcus sp. Actinomadura; Nocardia; Nocardiopsis; Streptomyces e Streptosporangium. Bacillus spp.;Corynebacterium sp.; Erwinia sp.; Listeria sp.,Microbispora sp.; Micrococcus sp.; Pseudomonas sp.; Streptomyces sp. e Streptosporangium sp. Referência Assis et al. (1998) Baldani et al. (2002) Araújo et al. (2001b) e Marcon (2002) Genari (1999); Yamada (1999) e Sakiyama et al. (2001) Stamford (1997) Kirchhof et al. (1997) Maitan (1998) Matsuura (1998) Souza (1996) e De Araújo et al. (2000) UFV, 1999, 75p. Dissertação de Mestrado. GLIENKE-BLANCO,C.AGUILAR-VIL- DOSO, C.I.; VIEIRA, M.I.C.; BAR- ROSO,P.A.V.&AZEVEDO, J.L.Ge- netic variability in the endophytic fungusGuignardiacitricarpa iso- lated from citrus plants. Genetics and Molecular Biology, 25: 251- 255, 2002. GOLDSON, S.L.; PROFFITT, J.R.; FLE- TCHER, L.R.;BAIRD,D.B.Multitro- phic interaction between the rye- grass Lolium perenne, its endo- phyte Neotyphodium lolii, the weevil pest Listronotus bonarien- sis, and its parasitoidMicroctonus hyperodae. New Zealand Journal of Agricultural Research, 43: 227- 233, 2000. GUIMARÃES, V. C. Isolamento de fungos endofíticos do hospedeiro PaulliniacupanaH.B.K.var. sorbi- lis (Mart.) Ducke e análise da vari- abilidade genética, detectada por marcadoresRAPDnoendófitoGlo- merella cingulata. Manaus, FUA/ UFSCAR,1998, 123p., Dissertação Mestrado. GUO,B.;DAI, J.R.;NG,S.;HUANG,Y.; LEONG,C.;ONG,W.;CARTE,B.K. CytonicacidsAandB:novel tridep- side inhbitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cyto- naema species. JournalofNatural Products, 63: 602-604, 2000. HALLMANN, J.;QUADT-HALLMANN, A.;MAHAFFEE,W. F.; KLOEPPER, J. W. Bacterial endophytes in agri- culturecrops.CanadianJournalof Microbiology, 43: 895-914, 1997. KIRCHHOF, G.; REIS, V.M.; BALDA- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 75 NI, J.I.; ECKERT, B.; DÖBEREI- NER, J.; HARTMANN, A. Occur- rence,physiological andmolecu- lar analysis of endophytic diazo- trophic bacteria in gramineous energy plants. Plant and Soil, 194: 45-55, 1997. KOGA, H.; HIRAI, Y.; KANDA, K.; TSUKIBOSHI, T.; UEMATSU, T. Successive Transmission of Re- sistance to BluegrassWebworm to Perennial Ryegrass and Tall FescuePlants byArtificial Inocu- lation with Acremonium Endo- phytes. JARQ-JPN AGR. RES. Q., 31:109-115, 1997. LASOTA , J. A . ; WALDVOGEL, M.G.; SHETLAR, D.J. Fungus found in galls of Adelges abietis (L.) (Homoptera: Adelgidae): identificationwithin treedistribu- tion and possible impact on in- sect survival.EnvironmentalEn- tomology, 12: 245-246, 1983. LEE, J.C.; LOBKOVSKY, E.; PLIAM, N.B.; STROBEL, G.; CLARDY, J. Subglutinol-Aandsubglutinol-B- immunosuppressivecompounds from the endophytic fungus Fu- sarium subglutinans. Journalof Organic Chemistry, 60: 7076- 7077, 1995. LI, J.Y.; STROBEL, G.; HARPER, J.; LOBKOVSKY, E.; CLARDY, J. Cryptocin, a potent tetramic an- timycotic from the endophytic fungusCryptosporiopsis cf.quer- cina. Organic Letters, 23: 767- 770, 2000. MAGALHÃES, A.A.S. Isolamento e variabilidadegenética detectada por RAPD do fungo endofítico Guignardia sp. deHimatanthus sucuuba Spruce (Wood)Apocy- naceae. Manaus, FUA/UFSCAR, 2000, 130p.,DissertaçãodeMes- trado. MAITAN, V.R. Isolamento e Carac- terização de Actinomicetos En- dofíticos Isolados de Solanum lycocarpum (lobeira). Goiânia: ICB/Universidade Federal de Goiás, 1998. 115p. Dissertação deMestrado. MANDALA, S.M.;THORNTON,R.A.; ROSENBACH,M.;MILLIGAN, J.; GARCIA-CALVO,M.;BULL,H.G.; KURTZ, M.B. Khafrefungin, a novel inhibitorof sphingolipid syn- thesis. Journal of Biological Che- mistry, 272: 32709-32714, 1997. MARCON, J. Isolamentoecaracteriza- ção genética de actinomicetos en- dofíticos deCitrus spp. e interação comXylella fastidiosa. Piracicaba, ESALQ/USP, 2002, 91p, Disserta- çãodeMestrado. MATSUURA, T.Ocorrênciadeactino- micetos endofíticos produtores de antibióticos isolados de folhas e raízes de feijão caupi (Vigna un- guiculata). Recife, UFPe, 1998, 69p.DissertaçãoMestrado. MEDEIROS, S.A.F. Microflora da fo- lhagem do cajueiro Anacardium occidentale(L.) e controle biológi- codoagentedaantracnoseColleto- trichum gloeosporioides (Penz) Sacc. in vitro . Recife, UFRPe ,1988, 106p., Dissertação de Mes- trado. MENDES, R., KUKLINSKY-SOBRAL, J.; GERALDI, I. O.; ARAUJO, W.L.; AZEVEDO, J.L.; PIZZIRANI-KLEI- NER, A. A . Monitoring soybean endophytic fungal community as- sociatedwithglyphosate.XXICon- gressoBrasileirodeMicrobiologia, (21-25 Out. 2001) Foz do Iguaçú. SociedadeBrasileiradeMicrobiolo- gia, São Paulo, p.242 MURRAY, F.R.; LATCH, G.C.M.; SCOTT,D.B. Surrogate transforma- tion of perennial ryegrass Lolium perenne using genetically modifi- edAcremoniumendophyte.Mole- cular and General Genetics, 233: 1-9, 1992. NAMBIAR , P.T.C.; MA, S.W.; IYER, V.N. Limiting and insect infestation of nitrogen-fixing root nodules of thePigeonpea (Cajanuscajan)byengineering the expression of the entomocidal gene in its root nodu- les. Applied and Environmental Microbiology,56: 2866-2869, 1990. OLIVEIRA,F.C.O. Fungosendofíticos de folhasdecajueiro,Anacardium occidentale L. Propriedades anta- gônicas aColletotrichumgloeospo- rioides (Penzig)Sacc.Avaliaçãoen- zimática através de eletroforese e substratosespecíficos.Recife,UFR- Pe, 1999, 79p.DissertaçãodeMes- trado PAMPHILE, J.A. Variabilidade, trans- formaçãogenéticae transposons em linhagens endofíticas de Fu- sariummoniliforme isoladas de milho (Zeamays L.). Piracicaba: ESALQ/USP, 1997. 199p. Tese deDoutorado PAMPHILE, J.A. & AZEVEDO, J.L. Molecular characterizationofen- dophytic strainsofFusariumver- ticillioides (= Fusarium monili- forme) from mayze (Zea Mays L.).Word Journal ofMicrobiolo- gy and Biotechnology, 18: 391- 396, 2002. PENNA, E.B.S. Microrganismos en- dofíticos em erva-mate (Ilex pa- raguariensis St. Hil.) e variabili- dadegenética emPhylosticta sp. por RAPD. Curitiba, UFPr, 2000, 123p. Dissertação deMestrado. PEREIRA, J.O. Fungos endofiticos dos hospedeiros tropicais Stylo- santhes guianensis e Musa ca- vendish. Piracicaba:ESALQ/USP, 1993. 105p. Tese de Doutorado. PEREIRA, J.O.; AZEVEDO, J.L.; PE- TRINI, O. Endophytic fungi of Stylosanthes:A first report.Myco- logia, 85: 362-364, 1993. PEREIRA, J.O.;CARNEIRO-VIEIRA, M.L.; AZEVEDO, J.L. Endophytic fungi fromMusaacuminataand their reintroduction into axenic plants. World Journal of Micro- biology and Biotechnology, 15: 37-40, 1999. PIMENTEL, I.C. Fungos endofíticos domilho (Zeamays L. ) e da soja (Glycine max (L.) Merrril e seu potencialvalorbiotecnológicono controledepragas agrícolas. Cu- ritiba, UFPr, 2001, 154p. Tese de Doutorado. POCASANGRE, L.; SIKORA, R. A.; VILICH,V.; SCHUSTER,R.P. Sur- vey of banana endophytic fungi from central America and scree- ning for biological control of the burrowingnematode (Radopho- lus similis). Infomusa, 9: 3-5, 2000. RAPS,A.; VIDAL, S. Indirect Effects of na Unspecialized Endophytic FungusonSpecializedPlant-Her- bivorous Insect Interactions.Oe- cologia, 114: 541-547, 1998. REDMAN,R. S.; FREEMAN,S.; CLIF- TON,D.R.;MORREL, J;BROWN, 76 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 G.;RODRIGUEZ,R. J.Biochemical analysis of plant protection affor- dedbyanonpathogenic endophy- tic mutant of Colletotrichummag- na. Plant Physiology, 119: 795- 804, 1999. RICHMOND, D.S. & SHETLAR, D.J. Hairy chinch bug (Hemiptera: Ly- gaeidae)damage, populationden- sity, and movement in relation to the incidenceofperennial ryegrass infected by Neotyphodium endo- phytes. JournalofEconomicEnto- mology, 93: 1167-1172, 2000. RODRIGUES,A.A.C. Fungosendofíti- cos de sementes de caupi, Vigna uncuiculata (L.)Walp.Ediferenci- açãomorfológica,patogênicaeen- zimática de espécies de Fusarium. Recife, UFRPe, 1999, 87p. Disser- taçãodeMestrado. RODRIGUES, K. F. & SAMUELS, G. J. Fungal endophytes of Spondias mombin leaves inBrazil. Journalof Basic Microbiology, 39: 131-135, 1999. RODRIGUES,K. F. & SAMUELS, G. J. Idriella species endophytic in pal- ms.Mycotaxon, 43: 271-276, 1992. RODRIGUES, K.F. The foliar fungal endophytesof theAmazonianpalm Euterpe oleraceae. Mycologia, 86: 376-385, 1994. RODRIGUES, K.F.; HESSE, M.; WER- NER, C. Antimicrobial activities of secundarymetabolitesproducesby fungi from Spodiasmombin. Jour- nal ofBasicMicrobiology, 40: 261- 267, 2000. ROWAN, D. D. Lolitrems, peramine and paxilline: mycotoxins of the ryegrass/endophyte interaction. Agriculture, EcosystemsandEnvi- ronment, 44: 103-122, 1993. SAKIYAMA, C.C.H.; PAULA, E.M.; PEREIRA, P.C.; BORGES,A.C.; SIL- VA,D.O.Characterizationofpectin lyase produced by na endophytic strain isolated from coffe cherries. Letters inAppliedMicrobiology, 33: 117-121, 2001. SHERWOODPIKE, M., STONE, J.K.; CARROLL, G.C. Rhabdocline pa- rkeri aubiquitous foliar endophyte ofDouglas fir.Canadian Journalof Botany, 64: 1849-1855, 1986. SILVA, A.C. Isolamento de fungos endofíticos de milho (Zea mays, L.). Piracicaba, ESALQ/USP, 1997, 56p., Dissertação deMestrado. SOUZA,A.O.Bactérias endofíticasde milho (Zeamays, L.) e sua variabi- lidadegenéticaanalisadaporRAPD. Piracicaba,ESALQ/USP,1996,85p., DissertaçãodeMestrado. SOUZA, A.Q.L. Fungosendofíticosde plantas tóxicasdaAmazônia,Pali- courea longiflora (aubl.) Rich e Strychnos cogens Bentham. Ma- naus, FUA/UFSCAR, 2001, 102p. DissertaçãodeMestrado. SOUZA,M. L.Utilizaçãodemicrorga- nismosnaagricultura.Biotecnolo- gia, 21: 28-31, 2001. STAMFORD, T.L.M. Isolamento e identificaçãodemicrorganismosen- dofíticos, seleçãoe caracterização de actinomicetos produtores de enzimasamilolíticas.Recife,UFPe, 1997, 110p., Tese de Doutorado. STIERLE, A.; STROBEL,G.; STIERLE, D.Taxoland taxaneproductionby Taxomyces andreanae an endo- phytic fungus of Pacific yew. Sci- ence, 260: 214-216, 1993. STROBEL, G.A.; HESS, W.M. Glu- cosylationof thepeptide leucinos- tatin A, produced by an endophy- tic fungus of European yew, may protect thehost from leucinostatin toxicity.Chemical Biology, 4: 529- 536, 1999. STROBEL, G.; HESS, W.M.; BAIRD, G.; FORD, E.; LI, J.Y.; SIDHU, R.S. Stegolerium kukenani gen, et sp nov na endophytic taxol produ- cing fungus from theRoraima and Kukenan tepuis of Venezuela. Mycotaxon, 78: 353-361, 2001. STROBEL, G.; YANG, X.; SEARS, J.; KRAMER, R.; SIDHU, R.S.; HESS, W.M.Taxol fromPestalotiopsismi- crospora, anendophytic fungusof Taxuswallachiana.Microbiology- UK, 142: 435-440, 1996. STROBEL, G.A.; MILLER, R.V.; MAR- TINEZ-MILLER, C.; CONDRON, M.M.; TEPLOW,D.B.;HESS,W.M. Cryptocandin, a potent antimyco- tic from the endophytic fungus Cryptosporiopsis cf.quercina.Mi- crobiology-UK, 145: 1919-1926, 1999. TOMASINO, S.F.; LEISTER, R.T.; DI- MOCK,R.M.;BEACH,R.M.;KELLY, J.L. FieldPerformanceofClavibac- ter xyli subsp. cynodontisExpres- sing the Insecticidal ProteinGene cryIA (c) of Bacillus thuringiensis againstEuropeancornborer in field corn. Biological Control, 3: 442- 448, 1995. TUNALI, B.; MARSHALL, D.; ROYO, C.;NACHIT,M.M.;FONZO.N.D. I.; ARAUS, J. L. Antagonistic effect of endophytes against several root-rot pathogens of wheat. In: Durum wheat improvement in the Medi- terranean region: new challenges. Proceedings of a Seminar, Zarago- za, Spain, 40: 381-386, 2000. VARMA, A.; VERMA, S.; SUDHA; SAHAY, N.; BÜTEHORN, B.; FRANKEN,P.Piriformospora indi- ca, a cultivable plant-growth-pro- moting root endophyte. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 65: 2741-2744, 1999. VIDAL, S. Changes in suitability of tomato forwhitefliesmediatedbya non-pathogenicendophytic fungus. EntomologiaExperimentalis etAp- plicata, 80: 272-274, 1996 WAGNER,B.L.&LEWIS,L.C.Coloniza- tion of corn, Zea mays, by the entomopathogenic fungus Beau- veria bassiana. Applied and Envi- ronmentalMicrobiology,66: 3468- 3473, 2000. WHITE, J.F.&COLE,G.T. Endophyte- hostassociations in foragegrasses.3. In vitro inhibitionof fungi byAcre- monium coenophialum. Mycolo- gia, 77: 487-489, 1985. WILSON,D.&CARROL,G.C.Avoidan- ce of high-endophyte space by gall-forming insects.Ecology,2153- 2163, 1997. WOLFE,B.A.; BUSH, M.; MONFORT, S.L.;MUMFORD, S.L.; PESSIER, A.; MONTALI, R.J. Abdominal lipoma- tosis attributed to tall fescue toxico- sis in deer. Journal of American Veterinary Medical Association, 213: 1783-1786, 1998. YAMADA, C. M. Detecção de micror- ganismos endofíticos em frutos de café. Viçosa, UFV, 1999, 56p. Dis- sertaçãodeMestrado. YATES, I.E.; HIETT, K.L.; KAP- CZYNSKI,D.R.;SMART,W.;GLENN, A.E.;HINTON,D.M.;BACON,C.W.; MEINERSMANN,R.;LIU,S.; JAWOR- SKI, A.J. GUS transformationof the maize fungal endophyteFusarium moniliforme.MycologialResearch, 103: 129-136, 1999. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 77 78 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento- nº 29 PESQUISA Indução de brotações a partir de segmentos nodaisIndução de brotações a partir de segmentos nodaisIndução de brotações a partir de segmentos nodaisIndução de brotações a partir de segmentos nodaisIndução de brotações a partir de segmentos nodais Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores Micropropagação deMicropropagação deMicropropagação deMicropropagação deMicropropagação de PPPPParicáaricáaricáaricáaricá (Schizolobium amazonicum Huber Ex Ducke) Iracema Maria Castro Coimbra Cordeiro Eng. FlorestalMestranda /FCAP cordeiro@canal13.com.br Osmar Alves Lameira Eng.Agro.Doutor/Pesquisador Embrapa Amazônia Oriental osmar@cpatu.embrapa.br Evaristo Francisco de Moura Terezo Eng.Florestal, consultor terezo@terra.com.br Paulo Luís Contente de Barros Eng. Florestal Prof. Dr. FCAP char@amazon.com.br Selma Toyoko Ohashi Eng.Florestal. Doutoranda / FCAP ohashi@terra.com.br INTRODUÇÃO As espécies arbóreas de interesse econômicoconstituemumdosgrupos mais sujeitos à depredaçãodevido ao seuextrativismodesordenado.Portan- to,oestudopropagativopor sementes ou por métodos assexuados é extre- mamente importantenoresgateecon- servaçãodavariabilidadegenéticades- tas espécies. Neste sentido, investiga- ções a respeito de espécies florestais, de rápido crescimento, têmavançado constantemente, sobretudonoque se refere à multiplicação rápida de uma determinadacultivareauniformização de atributos tecnológicos damadeira. Dessemodo, autilizaçãodaculturade tecidos apresenta-se como uma im- portante ferramenta quando se pre- tende multiplicar vegetal promissor, assim como diminui a pressão e o predatismo sobre as florestas. Nosúltimos anos, a técnica de cul- tura de tecidos vegetais in vitro tem sidoaplicadaparapropagaremultipli- car plantas lenhosas (Sommer eWet- zstein,1984) através do uso de calos, órgãos, célulaseculturasdeprotoplas- tos com resultados satisfatórios, não diferindo muito dos tipos utilizados para outras espécies de plantas. O potencial deobtermaioresemelhores plantas mediante técnicas de clona- gem, se origina da capacidade do ex- plante (pequena parte do tecido) em capturar os componentes genéticos aditivos enãoaditivos (Assis, 1996) ao ser colocado em condições físicas e químicas artificiais (Serra, 1999) indu- zindo o vegetal a promover seu me- lhor desenvolvimento e crescimento. Amicropropagaçãoatualmentetem sido muito utilizada, principalmente com a finalidade de clonar árvores selecionadas para o melhoramento genético (PasqualeBarros, 1991),pro- duçãoem largaescala visandoo reflo- restamento, revitalizaçãode áreas de- pauperadaseproduçãobioenergética. Esta estratégia de desenvolvimento possui vantagens de prevenir a disse- minação de pragas e doenças de uma geraçãopara outra, obter umnúmero elevado de plantas num curto espaço de tempo (Souza et al., 1995), do Figura 1 Fluxograma dametodologia adotada para indução de brotações de paricá Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 79 mesmo modo que propicia a conservaçãodos recursos natu- rais,manutençãodopatrimônio genéticoedabiodiversidade(Go- mes, 1987). Grattapaglia e Ma- chado (1990) destacam a técni- cacomoamaisdifundida,preci- sa e concreta. Oparicá(Schizolobiumama- zonicum) é, preferencialmente, propagadopor semente, é uma espécie rústica pouco exigente em adubação e de fácil adapta- ção em diversos tipos de solo, razão pela qual vem sendobas- tante cultivada. Árvore de gran- deportechegandoaalcançaraté 30 m de altura. Sua madeira é branca,mole e leve, sendoutili- zadana fabricaçãode forros,pa- litosde fósforos,papel, compen- sados,pastadecelulose, lamina- dosdealtaqualidade(Meloetal, 1983). No entanto, tem sido ob- servadoqueexistegrandedesu- niformidade nos plantios. Sendo as- sim,aculturadetecidosaparececomo alternativaquepossibilitaaprodução de dezenas ou centenas de mudas, uniformes, a partir de uma semente ou matriz selecionada (Melo et al, 1998) No contexto, o presente trabalho tevecomoobjetivoavaliaroefeitode reguladores de crescimentona indu- ção de brotações de Schizolobium amazonicum a partir de segmentos nodaisdeplântulas assépticasgermi- nadas in vitro, com a finalidade de micropropagar a espécie. MATERIAL E MÉTODOS 1-LOCALDECONDUÇÃO DOESTUDO Asatividades foram realizadasno LaboratóriodeRecursosGenéticos e BiotecnologiadaEmbrapaAmazônia Oriental,Belém-Pará, conformemos- trado na figura 1. Foram utilizados explantesdeplântulasassépticas cul- tivadas invitro. As sementes depari- cá utilizadas foram doadas pela em- presaTramontinaBelémS.A. 2-SUPERAÇÃODEDORMÊNCIA E ASSEPSIA DAS SEMENTES Com base nos resultados de ex- perimentos anteriores, para supera- ção de dormência e favorecimento do rápidometabolismodegermina- ção, as sementes de paricá foram imersas em água por umperíodo de 24horas eemseguida foi realizadoo desponte, ou seja, as sementes sofre- ram um pequeno corte na região lateral do tegumento. No processo de assepsia, as se- mentes foram lavadas em água cor- rente por quinze minutos e imersas em álcool a 70% por um minuto e depois emsoluçãodehipocloritode sódio (NaOCl) a3%pordezminutos, sendocincominutosdeagitação.Em seguida, lavadas três vezes comágua destiladaeautoclavada.Posteriormen- te, acondicionadas sobre um papel toalha, em placas de Petri, previa- mente esterelizada. O processo de desinfestaçãodas sementes foi reali- zado emambiente asséptico. 3- FONTEDE EXPLANTE Para germinação das sementes, utilizou-semeiodeculturacomposto de 0,1% de polyvinylpyrrolidone (PVP)e0,6%agar,naausênciadesais e reguladordecrescimento,determi- nadocomoeficiente emexperimen- tos anteriores de germinação. Omeio de cultura foi ajustado a um pH de 5,8 utilizando-se NaOH(hidróxidode sódio) e/ ou HCl (ácido clorídrico) em solução0,5N.Omeiodecultu- ra foidistribuídonaquantidade de 40ml por frasco. A autocla- vagem foi realizada a 121°C durante 15minutos. Posteriormente, as semen- tes foram inoculadas uma em cada frasco e levadaspara sala de incubação, sob condições de cultivo de 16 horas de luz com uma irradiância de 25µmol.m-2.s-1,porumperíodo de quinze dias. Após a germi- nação e desenvolvimento, as plântulasobtidasserviramcomo fonte de explantes primário, sendoossegmentosnodaisuti- lizados como propágulos ve- getativosparaexperimentosde micropropagação (Figura2). 4- MULTIPLICAÇÃO IN VITRODE SEGMENTOS NODAIS DE PARICÁ Omeiode cultura básicoutilizado neste experimento foi compostopelo meio MS (Murashige e Skoog, 1962) modificado acrescido com 0,1% de ácido ascórbico, 3g/L de sacarose e 0,6%deAgar. Omeio de iniciação foi suplementadocomtrêsconcentrações deBAP (6-benzilaminopurina) eduas concentrações de KIN (Cinetina). As seguintes concentrações foram testa- das:BAP (4,43; 8,87 e 13,31 ìM) e KIN (9,29 e 11,61 ìM). O pH dos meios foi ajustado para 5,8 utilizando-se NaOH e/ou HCl em solução1N.Emseguidaforamdistribu- ídos10mldemeiodeculturaemtubos de ensaio de 20 x 150 mm. Posterior- mente, os tubos foram tampados com papel alumínio e lacrados com filme plástico do tipo pvc. Em seguida foi realizadaesterelizaçãoemautoclavea pressão de 1,2 atm e temperatura de 121°C, por 15 minutos. Paraocontroledaoxidação,ecalo- gênese a concentração de nitrato de amônio (NH 4 NO 3 ) domeio básico foi reduzida à metade, indicada como melhor concentração emexperimen- to anterior. Para equacionar oproble- Figura 2 -Aspecto da plântula de paricá após 7 diasde inoculação. EmbrapaAmazôniaOriental, Belém PA. 2002 80 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 madaoxidaçãoalémdoprocedimen- to citado, cada um dos segmentos nodais foi imersoemsoluçãocontendo ácido ascórbico a 0,1%por 5minutos, antesda inoculação. Emcâmarade fluxo laminar,previ- amentedesinfectadacomálcoola70%, os segmentosnodais (explantes) com aproximadamente0,5 a 1,0 cm de comprimento foram inoculados em posiçãohorizontal, sendoumemcada tubode ensaio. Após a inoculação, os tubos foram tampadose lacrados con- formedescritoanteriormente.Confor- me estabelecido em experimentos anteriores, o cultivo foi mantido na ausênciade luznos seteprimeirosdias e posteriormente nas mesmas condi- çõesdecultivoutilizadoparagermina- ção das sementes. As brotações obtidas foram indivi- dualizadasecolocadasparamultiplica- çãonomelhor tratamentoobservado. Posteriormentesubcultivadasemmeio MScomasconcentraçõesdesais redu- zidasametade, semreguladordecres- cimento, nas mesmas condições do experimento citadoanteriormente. Brotoscomtamanhovariandode2 a 3 cm foram transferidos para omeio deculturadeenraizamento composto domeioMScomametadedasconcen- trações de sais suplementado com3g de sacarose e 6 mg/L de AIB (ácido indolbutírico). 5- CONDIÇÃODO CRESCIMENTO E PARÂMETROS AVALIADOS Apósosétimodia,asculturas foram levadaspara sala de crescimento sob condições de cultivo por 16 horas diárias de luz a 25 + 1°C de tempera- tura, e irradiância de 25µmol.m-2.s-1. Aavaliaçãofoi realizadaaofinalde vinte dias de cultivo, coma observa- ção do número e comprimento de brotos, presençade calos eoxidação porexplante.Asvariáveisnúmerode brotações, foram transformadas pela e a variável de resposta comprimento,nãosofreu transforma- ção. Estas duas variáveis foramanali- sadas através da análise de variância comparando as médias pelo teste SNK. Para a presença de calos e oxi- dação, foi realizada avaliação visual, queconsistiu emobservar aocorrên- ciadecalose freqüênciadeoxidação, nãosendorealizadoanáliseestatística para essas duas variáveis. Odelineamentoexperimentaluti- lizadofoiinteiramentecasualizadocom cinco tratamentosequatro repetições sendo cada unidade experimental constituídadecinco tubosdeensaio com um explante por tubo. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1-COMPORTAMENTO INICIAL DOSEXPLANTES A análise de variância feita para as variáveis, númeromédio e com- primento de brotaçõesmostrou in- teração significativa ao nível de 5% de probabilidade, entre as citocini- naseconcentraçõesdosmesmos.O efeito benéfico das citocininas na multiplicaçãodebrotações relacio- na-se coma influência desses regu- ladores de crescimento na divisão celular e na liberação das gemas axiliares, emitidaspela dominância apical. Os tratamentos que resultaram emmaior número médio de brota- ções foramaqueles suplementados com 13,31 µmol de BAP e 11, 61 µmol de KIN no meio de cultura, com médias de 2,14 e 1,18 brotos por explante, respectivamente. As baixas taxas de multiplicação obti- das no presente trabalho provavel- mente estejam relacionadas com a característicadaprópriaplanta. Resultados similares foram en- contrados por Andrade et al (2000) napropagaçãodearoeira (Myracro- drunurundeuvaFr.All)queconse- guiram apenas um broto por ex- plante. Estes resultados coincidem tambémcomos registradosporPas- qual e Barros (1992) em segmento Figura 3 - A Aspecto de formação de: brotação (a); calos (b) e lenticelas (c). B Detalhe de: brotações (a); formação de calos (b) início de oxidação (d). Embrapa Amazônia Oriental, Belém PA. 2002 TABELA 1-Média do número e comprimento de brotos em função das concentrações dos reguladores de crescimento BAP e KIN MÉDIAS Meios de Cultura MS + 4,43 µMol BAP MS + 8,87 µMol BAP MS + 13,31 µMol BAP MS + 9,29 µMol KIN MS + 11,61 µMol KIN Número dos Brotos. 1,77 b 1,87 b 2,14 a 1,2 c 1,8 b Comprimento dos Brotos (cm) 0,86 a 0,71 b 0,53 c 0,72 b 0,42 c Medidas seguidas da mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste SNK ao nível de 0,05 de probabilidade Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 81 caulinar de barbatimão (Strynoden- dron adstringens (Mart.); Arello e Pinto (1993) com o pau santo (Kiel- meyeracoriacea,Martius). Osresultadosmostraramumaten- dência no aumento do número de brotos (1,77 a 2,14 com BAP; 1,12 a 1,18 com KIN) produzidos por ex- plante quando se elevam as dosa- gens dos reguladores de crescimen- to, insinuando que provavelmente maiores concentrações poderiam apresentar maiores taxas de brota- ções. De acordo com Pierik (1990), altas concentraçõesdecitocininas (1 a 10 mg.L-1) no meio de cultura podem induzir a formaçãodebrotos adventícios, porém normalmente o enraizamento tende a ser inibido. Para o comprimento, houve res- posta inversa tantoparaoBAPquan- to para a KIN, ou seja, amedida que aumentava-se as concentra- çõesdos reguladoresdecres- cimentomenor eraocompri- mento. Esta tendência de di- minuiçãodocomprimentoda brotaçãopodeestádiretamen- te ligada às altas concentra- çõesdos reguladoresdecres- cimento, vistoqueascitocini- nas estimulamadivisão celu- lar induzindoamultiplicação de brotos, entretanto inibem o crescimento dos mesmos. George (1993); Garttapaglia eMachado(1998)relatamque a partir de uma determinada concentraçãoocorreumefei- to inibidor, que secaracteriza pela faltadealongamentodas culturas, engrossamento ex- cessivo dos caules e vitrifica- çãogeneralizadadasculturas. ATabela1, sumarizaos resul- tados dasmédias obtidas para o nú- mero e comprimento de brotos por tratamento. Com a redução na concentração do nitrato de amônio para metade; imersão dos explantes em solução antioxidante antes da inoculação; e incubação inicial no escuro houve diminuição na percentagem de oxi- daçãonos explantes, todavianão foi possívelevitá-latotalmente.Estacons- tataçãocomprovaquemesmocoma utilização de pré-tratamentos e mo- dificaçãonomeioMS,oparicá libera substâncias oxidantes. De acordo com Andrade et al (2000), plantas lenhosasacumulampolifenóisepro- dutos de oxidação comomelanina, suberina, lignina, cutinaecaloseem tornodasuperfícieexcisada,osquais modificamacomposiçãodomeiode cultivo eda absorçãodosmetabóli- tos, o que, em muitos casos, pode dificultar oprocessodepropagação in vitro. No caso da calogênese tem sido reportadoquea incubação inicialda culturanoescurodiminuiaoxidação nosexplantesmaspropicia a forma- ção de calos. A presença de calos friáveis se fez sentir com menor freqüência,entretanto,àmedidaque se aumentou a concentração dos reguladoresmaior a incidência des- tes. SegundoGarttapaglia eMacha- do (1990) é comum a formação de calos,nabasedosexplantes,quando são cultivados em altas doses de reguladores de crescimento, com- prometendoa rizogêneseeocresci- mento da parte aérea. Assim, a for- mação de calos no paricá deve-se, provavelmente,aodesbalanceamen- tonosníveisde fitohormôniosconti- dos nos explantes. O aparecimento das brotações ocorreu após seis dias do início do cultivo. Com vinte dias, 86% dos explantes apresentavam brotações. Durante o período de três semanas foramobservadospresençade calos friáveis, de lenticelas e o início de oxidaçãonos explantes (Figura 3Ae 3B), sendonecessário fazer limpeza domaterial vegetal eposterior trans- ferência dos brotos para novo meio decultura. Deve-se ressaltar que os regula- doresdecrescimento sãocapazesde produzir respostasdegrandemagni- tude, regulandoedeterminando res- postas bioquímicas, fisiológicas ou morfogenéticas dos tecidos, o que geralmente varia de acordo com a espécie, demodoque, as condições de cultivo, concentrações e tipo de reguladores de crescimento devem ser ajustadospara cada espécie e até mesmo para cada cultivar (Zimmer- man, 1981). 2- SUBCULTIVOSDE BROTAÇÕES As brotações foram indivi- dualizadase inoculadasnome- lhor tratamento obtido no ex- perimento citadoanteriormen- te (MSmodificado+13,31µmol deBAP).Este tratamentoaliado aos procedimentos para redu- çãodeoxidaçãoecalospassou ser utilizado para o estabeleci- mento in vitro do material a partir de segmentos nodais de paricá.Outraconstataçãonamul- tiplicação foi que o número médio de brotos obtidosnos subcultivos, se apresentou se- melhante ao do cultivo inicial, ou seja, 2,14brotosporexplan- te. A transferência dos brotos para o meio MS, com a metade das concentrações de sais e na ausência dereguladordecrescimento, induziu ummaior crescimentodosmesmos, possibilitandoamanutençãoda cul- tura. Este processo demonstra que a presença de citocinina em subculti- vosdeveserevitada,poiso regulador emexcessoacabapor inibiroalonga- mentodosbrotos. Com quarenta e cinco dias de cultivo as brotações apresentavam- sebem formadas com tamanhovari- Figura 4 - Desenvolvimento de brotação de paricá in vitro cultivada em ½ MS com 13,31 µmol de BAP 82 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 ando de 2 a 3 cm de comprimento, entretanto com a presença de oxida- ção na base do explante. Com esta performance,asbrotações foramtrans- feridas para o meio de enraizamento (Figura 4). Aos sessentadiasdecultivo, apósa transferênciadasbrotaçõesparaomeio decultura suplementadocomauxina, foiobservadoosurgimentodeprimór- dios de raízes adventícias na parte basilardosbrotos, todaviaaindanãose apresentamsuficientesparamanuten- ção da cultura. Certas espécies, entre asquaisestãomuitasplantas lenhosas, apresentaminúmerosmecanismosque podemcontribuirparaa falhaouretar- damentona induçãode raízes. Segun- do Normanly (1997) espécies lenho- saspodemapresentaraltaatividadede enzimas que inativam a auxina por degradaçãooxidativaoupor conjuga- ção,afetandosobremaneiranoproces- so de rizogênese. CONCLUSÕES • O regulador de crescimento BAP é maiseficientenaconcentração13,31 µmolproporcionandomaiornúme- ro de brotos in vitro de paricá; • A Cinetina é menos eficiente na proliferaçãodebrotaçõesdeparicá; • Ocomprimentodasbrotaçõesdimi- nui comoaumento das concentra- ções de BAP e Cinetina e • Houve redução substancial de oxi- dação e de calos na presença do meioMS (½NH 4 NO 3 ) AGRADECIMENTOS AgradecemosàempresaTramonti- na Belém S.A. pelo apoio financeiro para execução deste trabalho e pela bolsa demestrado concedida a Irace- maM.C.CoimbraCordeiro. REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, M. W. de., LUZ, J.M. Q., LACERDA,A. S.,MELO,P.R.A. de. Micropropagaçãodaaroeira(Myra- crodrunurundeuvaFr.All).Ciên- cic. Agrotec., Lavras, v.24, n.1, p.174-180, jan/mar., 2000. ARELLO, E. F. e PINTO, J. E. P. Propagação invitrodeKielmeye- racoriacea I. Efeito das diversas concentrações combinadas de benzilaminopurinaeácidonafta- lenacético na multiplicação de brotos.PesquisaAgropecuária Brasileira, Brasília, v.28, n.1, p.25-31, jan 1993. ASSIS, T.F.,Melhoramentogenético doeucalipto. In: InformeAgro- pecuário-EPAMIG, v.18, n.185,1996. GEORGE,E.F.Plantpropagationand micropropagation. In:GEORGE, E.F. (ed.). Plant propagation by tissue culture: part 1 the technology. 2.ed. Somerset: Exe- getics, 1993. Cap.2. p.37-66. GOMES,A.L.,PropagaçãoClonal: PrincípioseParticularidades. Vila Real, Universidade de Tras- os-MonteseAltoDouro.1987,69p. (Série Didática Ciências Aplica- das.1). GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO. M.A.Micropropagação. In: TOR- RES,A.C.;CALDAS.L.S.Técnicas e aplicações da cultura de te- cidosdeplantas. Brasília: ABC- TP/EMBRAPACNPH.1990.433p. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO. M.A.Micropropagação. In: TOR- RES, A.C.; CALDAS. L.S.; BUSO, J.A.Culturade tecidose trans- formação genética de plan- tas.Brasília:EMBRAPA/CBAB,p. 183-260. 1998. MELO, J.T. de; SILVA, J.A. da; TOR- RES,R.A.deA.;SILVEIRA,C.E.dos S.da;CALDAS,L.S.Coleta,propagação edesenvolvimentoinicialdeespéci- esdocerrado.In:Sano,S.M.;ALMEI- DA,S.P.de. (eds).Cerrado:ambi- enteeflora.Planaltina;EMBRAPA- CPAC.1998.556P.Cap.V.p.195-231. MELO, J. E. de; CARVALHO,G.M.de; MARTINS, V. A.Espéciesmadei- reirassubstitutasdomogno(Swi- eteniamacrophillaKing.).Brasí- lia:IBAMA,1983.16p.(SérieTécnica, 6) MURASHIGE,T.SKOOG,F.A.Arevised mediumforrapidgrowthandbioas- says with tabaco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v.15, p.473-497, 1962. NORMANLY, J.Auxinmetabolism. PhysiologiaPlantarum, 100: 431-442, 1997. PASQUAL,M.eBARROS, Ide.Efei- tos doácidonaftalenoacético e 6-benzilaminopurinasobreapro- liferação de brotos in vitro em barbatimão (Struphnodendron adstringens (Mart.)coville).Pes- quisaAgropecuáriaBrasilei- ra. Brasília, v.27, n.7, p.1017- 1019, jul.1992. PASQUAL, M. & BARROS, I. de. Efeito de benzilaminopurina e ácidonaftalenoacéticonaproli- feração e alongamento de bro- taçõesmicropropagadasemCo- ffea arabica L. in vitro. Pes- quisaAgropecuáriaBrasilei- ra. Brasília(DF), v. 26 n. 2, p. 201-204, fev.1991. PIERIK, R. L. M.,Cultivo in vitro delasplantassuperiores.Tra- dução por Luis Ayerbe Mateo- Sagasta. 3ª ed.Madrid:EDICIO- NESMundi-Prensa, 1990. 326p. Cap. 12, Tradução de: In vitro culture of higer plants. SERRA, A.G.P. Análises bioquí- micas de calos e estudo da divergênciagenéticaemcas- tanha-do-brasil (Bertholletia excelsaH.B.K.). Lavras: UFLA, 1999. 72p. il. Dissertação (Mes- trado)-UFLA,1999. SOMMER,H.E.;WETZSTEIN,H.Y. In: AMMIRATO, P.V.; EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; YAMADA, Y.(eds). Handbook of plant cell culture. Crop species. NewYork:MacmillanPublishing Company. 1984. v.3, cap.19, p.511-540. SOUZA,A.S.; PAZ,O.P. da.;MON- TARROYOS,A.V.V.;GESTEIRA, A. da S. Protocolo de micro- propagação rápida daman- dioca. Cruz das Almas (BA): MAARA-EMBRAPA-CNPMF, 1995. nãopaginado (biotecno- logia em foco,8). ZIMERMAN,R.H.Micropropagati- on of fruit plants. Acta Horti- culturae. V. 120, p. 217-222, 1981. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 83 84 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 PESQUISA Uma relação no milho (Uma relação no milho (Uma relação no milho (Uma relação no milho (Uma relação no milho (Zea maysZea maysZea maysZea maysZea mays Linné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de águaLinné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de águaLinné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de águaLinné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de águaLinné) entre o teor de umidade e o teor de atividade de água Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores Milho:Milho:Milho:Milho:Milho: TTTTTeor de umidade x Atividade de águaeor de umidade x Atividade de águaeor de umidade x Atividade de águaeor de umidade x Atividade de águaeor de umidade x Atividade de água Rupérsio Alvares Cançado DoutorandodoProgramadePós-Graduação em Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Paraná UFPR. cançado@engquim.ufpr.br Renato João Sossela de Freitas Prof.Dr. doProgramadePós-Graduação em Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Paraná UFPR. rfreitas@brturbo.com RESUMO Este trabalho consistiu no estudo da correlação entre a umidade e atividade de água nos grãos de milho, já que estas características físico-químicas são um dos fatores ligados ao desenvolvimento de fungos produtores de micotoxinas. Nas análises dos teores de umidade e de atividade de água não foram constatado diferença estatisticamente significativa (P<0,05). Em relação ao teor deumidade e atividade de água obteve-se a média 13,3% e 0,719, respectivamente, com uma fórmula estatística y=0,01182x+7,605, configurando a in- tersecção em zero. 1 INTRODUÇÃO Dentre os cereais cultivados nomun- do, o milho (Zea mays Linné) coloca-se em terceiro lugar, sendo superado ape- nas pelo arroz e o trigo. Ogrão demilhopossui uma varieda- de de nutrientes que são essenciais para o metabolismo humano e animal. Em sua constituição encontram-se proteí- nas, carboidratos, lipídeos, minerais e vitaminas; porém comumente conside- ram-se a constituição básica de 60% de carboidratos, 10% proteínas e 4% de óleo. Uma das causas preocupantes no mundo hoje é o desenvolvimento de fungos em grãos, principalmente na la- voura e no armazenamento. Atualmente, tanto os agricultores como as cooperativasestão preocupa- dos com o armazenamento do milho e uma destas é o teor de umidade do cereal, sabem que é uma análise que se não for controlada pode vir a danificar o produto e causar sérios prejuízos. A existência do microrganismo não depende apenas da quantidade de água superficial do cereal, mas também da quantidade de água livre existente no interior do mesmo, iniciando pesquisas em análise de detecção da atividade de água, e assim, podendo bloquear o crescimento de fungos e por conseqü- ência suas toxinas liberadas no alimento. CELARO (1992) considerou estes va- lores de temperatura e de atividade de água e ainda as condições precárias de colheita e pós-colheita a que o milho é submetido no país, afirmando que o FIGURA 1 DETECTOR DE ATIVIDADE DE ÁGUA AQUALABMODELOCX-2 FONTE: CANÇADO, 2001. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 85 potencial de contaminação do milho armazenadonoBrasil, nas várias regiões agroclimáticas, é grande. O objetivo deste trabalho foi correla- cionar o teor de atividade de água e o teor de umidade por meio de compara- ção de resultados. TEORDEUMIDADE O teor de umidade do alimento rela- ciona-se com a quantidade de água disponível nele existente. O teor de umidade corresponde à perda em peso sofrida pelo cereal quan- do aquecido em condições nas quais a água é removida. Na realidade, não é somente a água a ser removida mas outras substâncias que se volatilizam nessas condições. O resíduo obtido no aquecimento direto é chamado de resí- duo seco. O aquecimento direto da amostra em torno de 100ºC é o processo mais usual em amostras de alimentos. Amostras de alimentos que se decom- põem, ou iniciam transformações a essa temperatura, devem ser aquecidas em estufas a vácuo, onde se reduz a pressão e semantém a temperatura de 70ºC. Nos casos emque outras substâncias voláteis estão presentes, a determinação de teor de umidade real deve ser feita por pro- cesso de destilação com líquidos imiscí- veis. Outros processos são baseados em reações que se dão em presença de água. Em alimentos de composição pa- dronizada, certas medidas físicas, como índice de refração, densidade, conduti- vidade elétrica e outras, fornecem uma avaliação do teor de umidade de modo rápido, mediante o uso de tabelas ou gráficos já estabelecidos (INSTITUTO ADOLFOLUTZ, 1985). ATIVIDADEDEÁGUA(AW) A atividade de água ou atividade aquosa, com o símbolo Aw ou como alguns autores propõe Aa , vem sendo discutida emdiversos centros depesqui- sas, bem como no âmbito econômico mundial, visto que ela dá a real quanti- dadede águadoalimento.Os economis- tas e os cientistas querem um valor entrelaçando o teor de umidade e o teor de atividade de água do alimento para a venda como para a compra, assim os consumidores e compradores estariam comprando realmente o produto e não percentual dele com o complemento água, e pagariam somente pelo alimento adquirido; além de prevenir o cresci- mento de microrganismos indesejáveis. A necessidade de água dos micror- ganismos (Quadro 1) é referida como atividade de água do ambiente, sendo definida como: a pressão de vapor da solução (águado substrato alimentício), dividida pela pressão de vapor do dis- solvente (água livre), àmesma tempera- tura. A Aw de um alimento ou solução é a razão entre apressãode vapor de água do alimento (P) e a da pura água (PO). A água pura tem Aw igual a 1,0, uma solução de água com 22,0% de NaCl (Cloreto de sódio) tem Aw igual a 0,86 e uma solução saturada de NaCl tem uma Aw igual a 0,75. No Quadro 7 são apresentados os valores de Aw de diver- sos tipos de alimentos. Quando a solução se torna mais concentrada, a pressão de vapor dimi- nui e a Aw é inferior ao valor máximo 1, para a água pura. A Aw está relacionada como ponto de congelamento, o ponto de ebulição, a umidade relativa de equi- líbrio (URE) e a pressão osmótica (PO). URE da mesma forma que Aw, é a razão entre as pressões de vapor da solução e da água pura e é expressa na forma de percentagem: URE(%) = Awx100 URE se refere estritamente à atmos- fera em equilíbrio com uma solução ou alimento e é uma expressão menos adequada do que Aw, como medida da disponibilidade de água. Pressão osmótica (PO) é relaciona- da com Aw, por meio da expressão: onde R é a constante do gás, T a tempe- ratura absoluta, loge Aw o logaritmo natural de Aw, e n1 + n2 é a fração molar parcial de água. O uso de pressão osmó- tica pressupõe a presença de umamem- brana com propriedades de permeabili- dade apropriada. A lei de Raoult pode ser apre- sentada da seguinte maneira: assim, a razão entre a pressão de vapor da solução e a pressão de vapor do solvente puro é igual a fração molar do solvente, onde o P e Po são as pressões de vapor da solução e solvente, respec- tivamente e n1 e n2 são os números de moles de soluto e solvente, respectiva- mente. Onde pode-se expressar em for- mato de Aw: Valores sobre a Aw apresentaram soluções degrande relevância napreser- vação de alimentos, como soluções de cloreto de sódio, sacarose, glucose, açú- car invertido e hidrolisados de amido. Dentre os fatores que reduzem a pressão de vapor de água dos alimentos, além da Aw pode-se incluir a adsorção de moléculas de água na superfície e efeitos capilares (adaptado de ICMSF, 1997). A adsorção de substâncias químicas e microrganismos depende das ligações FIGURA 2 ESTUFA A VÁCUO FABBE-PRIMAR FONTE: CANÇADO, 2001. 86 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 que podem ser formadas entre as molé- culas do agente e a superfície da célula. Isso pode acontecer por meio de liga- ções de Van derWaals, pontes de hidro- gênio, ligações iônicas e ligações cova- lentes. As ligações iônicas são influenci- adas pelo pH que determina a extensão de ionizaçãodo agente antimicrobiano e a disponibilidade de grupos de cargas opostas na célula. Assim como o crescimento, a sobre- vivência microbiana também é afetada pela Aw do ambiente. Em microbiologia de alimentos, a sobrevivência microbiana émais impor- tante ao contexto de tratamento térmico. É menor a sobrevivência a altas tempe- raturas em condições de alta Aw. Para esporos bacterianos, a proteção resul- tante da redução da Aw é máxima no intervalo de Aw de 0,2 a 0,4. LEITÃO (1988) e LACEY et al. (1991) observaramastemperaturasde35ºCcomo ótimaspara o crescimentodeAspergillus flavus e no que diz respeito a atividade de água consideraram 0,78 a 0,80 como nível ótimo de crescimento. Todavia, os teores necessários para a formação das aflatoxinas seriam de 0,83 a 0,87. Porém, durante o armazenamento dos grãos de milho o crescimento do Aspergillus flavus depende ainda princi- palmente da umidade relativa do ar de 85% a 95%, nessas condições a tempera- tura situada entre 30ºC a 35ºC (limites ótimos de metabolismo) determinará a velocidade de crescimento do fungo. Logo, volta-se ao controle da atividade de água (Aw = 0,75) e principalmente com um controle de teor de umidade baixo (13,0%), para evitar a produção de aflatoxinas. 2MATERIAL EMÉTODOS 2.1 MATÉRIA-PRIMA Amatéria-primautilizadaneste traba- lho foram amostras de grãos de milho integral, retiradas conforme ametodolo- gia especificada na seqüência nas Co- operativas do Estado do Paraná, totali- zando 144 amostras provenientes de diversas partes do Estado e cada uma sendo de cinco quilogramas e embala- das em saco de papel multifolhado com a terceira folha impermeável. CadaCooperativapossuioseuranking de agricultores que lhe abastece com milho; as safras 2000 e 2001 ocorreram em condições climáticas definidas com seus ciclos de temperatura e precipita- ção, com meses de verão quentes e pouco chuvosos, e período de inverno com temperatura moderada, mas seco, contribuindo para que fossem safras com contaminação pequena e de maior qualidade. 2.2EQUIPAMENTOS2.2.1 Detector de Atividade de Água O detector de atividade de água AQUALABmodeloCX-2 (Figura 1) utiliza umespelho de resfriamento aoponto de orvalho e ligeiramente aquecido para fazer a medida de atividade de água. Essa técnica é uma medida primária, mais conhecida comométodo de análise de umidade relativa.Quandoumaamostra esta sendo medida no AQUALAB, um espelho de aço dentro da câmara é repetidamente esfriado e aquecido, formando assim, o orvalho e evaporando-o. Um ventilador de ar acelera o processo de equilíbrio dentro da câmara. Cada orvalho criado e evapora- do o AQUALAB mede a temperatura e calcula Aw da amostra. Quando a leitura de Aw no equipamento obtiver um erro 0,001 de diferença na câmara, o equipamento alcançou o equilíbrio e libera o valor da Aw final e da temperatura da amostra em seu visor. A mudança da Aw devido à mudança de temperatura para a maioria dos materiais é menor que 0,02 por grau centígrado, por isso o equipamento deve estar emambiente refrigerado para as suas leituras, de prefe- rência entre 20 a 25ºC. As leituras do equipamento devemestar num período entre 2 a 6 minutos, após oito minutos a amostra foi danificada e se obterá um valor falso. Deve-se calibrar o equipamento com as soluções padrões: uma de cloreto de sódio e duas de cloreto de lítio, com atividade de água 0,760; 0,500 e 0,250, respectivamente. Após essa calibração deve-se checar com a atividade de água pura, resultando o valor de 1,000. O AQUALAB opera com freqüência en- tre 50 e 60 Hz, com as voltagens entre 110, 120, 220 e 240 volts. As amostras devem ser condicionadas em cápsulas plásticas do próprio aparelho, preenchendo 1/3 da altura da cápsula e homogeneizadas. 2.2.2 Estufa a Vácuo de Determinação de Teor de Umidade A estufa a vácuo utilizada neste trabalho foi da marca FABBE-PRIMAR, modelo 221, 600watts, 700mmHg, comescala de tempe- ratura de 0 a 200º C, conforme a Figura 2. Para as análises do teor de umidade dos grãos de milho foram acondicionados cin- co gramas de amostra em pesa-filtro de alumínio com tampa, de 50mmde diâmetro por 30 mm de altura, em uma temperatura constantede115ºCnumperíodode6horas. O método utilizado foi o recomendado pela AmericanOil Chemists Society (AOCS, 1985). 2.3MÉTODOS 2.3.1Amostragem As amostragens foram realizadas se- guindo o critério de coleta de amostras QUADRO 1 VALORES DE ATIVIDADE DE ÁGUA (A W ) DEDIVERSOSTIPOSDEALIMENTOS A W 0,98 0,99 0,93 0,97 0,85 0,92 0,60 0,84 < 0,60 Tipos de alimentos Leite, peixes, carne fresca, vegetais em salmoura, frutas em calda leve Leite evaporado, queijo processado, carne curada, carne e peixe levemente salgado, lingüiça cozida, frutas em calda forte e pão Leite condensado, queijo cheddarmaturado, lingüiça fermentada, carne seca, presunto cru e bacon Farinha, cereais, nozes, frutas secas, vegetais secos, leite e ovos em pó, gelatinas e geléias, melaço, peixe fortemente salgado, alguns queijosmaturados, alimentos levemente úmidos Confeitos, vegetais fermentados, chocolate,mel,macarrão seco, biscoitos e batatas chips. FONTE: GERMANO e GERMANO, 2001. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 87 simples, ou seja, comcalador (amostra- dor de grãos) e de acordo com o tamanho do local de armazenagem da Cooperativa, divididos em 20m2 para a retirada e quantidade de pontos. As amostras foram codificadas de acordo como seu tempo de armazena- gem, sendo imediata, 30 dias e 60 dias; de acordo com a safra, S20 para a safra de 2000 e S21 para a safra 2001 e ainda de acordo com os núcleos, N1 para o núcleo 1, N2 para o núcleo 2 e assim por diante até o N5. 2.3.2 Análise do Teor de Umidade O método utilizado na análise do teor de umidade foi o da AmericanOil ChemistsSociety (AOCS,1985),determi- nação de umidade para cereais, inclu- indo a metodologia para seus deriva- dos. A amostra foi pesada em balança analíticaBOSCH padrão a 20ºC em sala com atmosfera controlada. Para a aná- lise foi utilizada a estufa a vácuo FAB- BE-PRIMAR, comtemperaturade115ºC, numperíodode seis horas de secagem. Para a repesagem a amostra foi resfria- da em dessecador. 2.3.3 Análise da Atividade de Água A determinação do teor de ativida- dede água seguiuométodoespecifica- do pelo fabricante do equipamento, regulamentado pelo Departamento de Boas Práticas de Fabricação do Food and Drugs Administration - FDA dos Estados Unidos, sob o código federal deanálise21CFR110 (DECAGONDEVI- CES INC.,2001). O equipamento empregado foi o detector de atividade de água AQUA- LAB CX-2 em sala com atmosfera con- trolada a 23º C, conforme a Figura 1 do item2.2.1. Acondicionou-se a amostra emcáp- sulas plásticas, homogeneizou-se, sen- do estas colocadas no encaixe apropri- ado do equipamento para a leitura. A resposta da leitura ocorreu entre 2 a 6 minutos. 2.3.4 Análise Estatística As variáveis consideradas foram o teor de umidade, o teor de atividade de água, o teor de aflatoxinas pelo método TLC, o teor de aflatoxinas pelo método CFLAE e o teor de contaminação em amostras das Cooperativas do Estado do Paraná. Esses dados foram obtidos nos grãos de milho em ensaios experimen- tais onde foi utilizado um delineamento em blocos ao acaso com parcelas subdi- vididas. Para os cálculos estatísticos utilizou- se o Programa MSTATC da Michigan State University programado em sistema DOSpara computador; cedidopeloProf. Dr. Henrique Soares Koehler, Laborató- rio de Informática do Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná. 3RESULTADOSEDISCUSSÃO 3.1 TEOR DE UMIDADE EM GRÃOS DE MILHO (Zeamays Linné) Com relação ao teor de umidade e atividadede águadegrãosdemilho (Zea mays Linné) foram utilizadas 144 amos- tras, divididas em dois blocos de 72 amostras cada, conforme a safra de 2000 ou 2001, de acordo com a Tabela 1. A Tabela 2 mostra que a análise individual das safras 2000 e 2001 não apresentou diferença significativa a 5%, isto é, não houve uma variação estatísti- ca no controle de umidade entre as safras, obtendo um coeficiente de varia- ção 4,90% entre as safras e entre os núcleos do Paraná um coeficiente de variação 2,95%, demonstrando que o Paraná possui uma uniformização em decorrência do controle de umidade de grãos de milho. Porém, quando se ana- lisa em conjunto as duas safras houve diferença significativa no nível de 1%, acredita-se que devido as intempéries não se apresentaremuniformes e homo- gêneas. Algumas regiões do Paraná no ano de 2000 estiveram com umidade relativa do ar muito baixa (em torno de 75%) e em outras a umidade relativa do ar foi muito alta (em torno de 90%), e isto ocorreu commenor intensidade no ano de 2001 (SIMEPAR, 2001). As análises das médias do teor de umidade nos núcleos do Paraná apresen- tou um índice favorável para uma seguran- ça aparente, a qual desfavorece o cresci- mento fúngico no mesmo, conforme as pesquisas efetuadas em moageiras de mi- lho que trabalham com no máximo 13,5% para que possam ter uma segurança na qualidade de seus produtos. M e s - mo que a portaria vigente no Estado para umidade do milho tenha fixado o índice máximo 14,5%para o armazenamento, nas safras do milho verificou-se que o teor de umidade apresentou-se na faixa de 13,0 a 13,5%. 3.2 ATIVIDADE DE ÁGUA EM GRÃOS DE MILHO (Zeamays Linné) A Tabela 3 mostra que a análise indivi- dual das safras 2000 e 2001 não apresentou diferença significativa a 5%, isto é, não houve uma variação estatística no controle de Aw entre as safras, obtendo um coefici- ente de variação 4,90% entre as safras e entre os núcleos do Paraná um coeficiente de variação 0,60%. As médias de teor de atividade de água nos núcleos do Paraná analisadas, para o crescimento micelial do fungo Aspergillus flavus é necessário uma Aw de 0,78 e para o seu desenvolvimento de 0,83,pela teoria não haveria crescimento de fungos e nem o desenvolvimento micelial, apresentando uma resposta nula. Porém, quando verifi- ca-se aprática, obtém-se algumas respostas opostas a teoria indicada. Tal fato pode ocorrer devido a umidade relativa do ar alta, acima de 80%, em algumas regiões do Estado, proporcionando o crescimento desses fungos. 3.3CORRELAÇÃOENTRE UMIDADE E ATIVIDADE DE ÁGUA EM GRÃOS DE MILHO (Zeamays Linné) Os itens 3.1 e 3.2 foram analisados TABELA1 DADOSDASAMOSTRASDEGRÃOSDEMILHOCOLETADASNO ESTADO DO PARANÁ - SAFRAS 2000/2001. SAFRAS 2000 2001 N1 18 18 N2 12 12 N3 18 18 N4 12 12 N5 12 12 TOTAL DE AMOSTRAS 72 72 MÉDIA POR NÚCLEO 14 14 NÚCLEOS (Quantidade de Amostras) 88 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 separadamente,mostrandoquenãoexis- tem individualmente diferenças signifi- cativas no nível de 5%. Visualizando graficamente e separadamente, confor- me as Figuras 19 e 21, e se interpolar os dois gráficos e correlacionar os teores de umidadeede atividadede água, retira-se uma fórmula matemática dessa correla- ção. AFigura 3 apresenta o teor deumida- de das safras 2000 e 2001 conforme os dados colhidos nas análises. A Figura 3 mostra o teor de umidade de grãos demilho no Paraná, safras 2000 e 2001, com uma equação linear: Estatisticamentenãohádiferença sig- nificativa, pode-se unir as duas equa- ções, construindo uma única equação das safras para o teor de umidade, por meio de suas médias, configurando a intersecção das retas para 13,25, tem-se: A Figura 4 mostra o teor de atividade de água das safras 2000 e 2001 conforme os dados colhidos nas análises. A Figura 4 mostra o teor de atividade de água de grãos de milho no Paraná, safras 2000 e 2001, com uma equação linear: Estatisticamentenãohádiferença sig- nificativa, podendo unir as duas equa- ções, construindo uma única equação das safras para o teor de atividade de água, configurando a intersecção das retas para a média 0,719, tem-se: TABELA 2 RESULTADOS DE ANÁLISES DE TEOR DE UMIDADE NAS AMOSTRAS DE GRÃOS DE MILHO NO ESTADO DO PARANÁ SAFRAS 2000/2001 NÚCLEOS N1 N2 N3 N4 N5 MédiaGeral SAFRAS 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 Mínimo 11,80 13,00 12,60 12,90 10,80 12,80 12,40 13,20 11,80 13,00 10,80 12,80 Máximo 13,90 14,20 14,10 13,80 14,10 14,40 13,90 13,90 13,90 13,80 14,10 14,40 X 13,08 13,80 13,42 13,34 12,42 13,73 13,23 13,59 13,27 13,33 13,03 13,59 SD 0,61 0,30 0,56 0,25 0,93 0,50 0,47 0,20 0,59 0,23 0,75 0,38 SE 0,16 0,08 0,20 0,10 0,16 0,08 0,20 0,10 0,20 0,10 0,09 0,04 Nota: X - média; SD= desvio padrão; SE= erro-padrão Teor de Umidade TABELA 3 RESULTADOS DE ANÁLISES DE TEOR DE ATIVIDADE DE ÁGUA NAS AMOSTRAS DE GRÃOS DE MILHO NO ESTADO DO PARANÁ SAFRAS 2000/2001 NÚCLEOS N1 N2 N3 N4 N5 MédiaGeral SAFRAS 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 Mínimo 0,704 0,719 0,716 0,716 0,699 0,717 0,715 0,719 0,704 0,718 0,699 0,716 Máximo 0,723 0,725 0,725 0,723 0,723 0,726 0,723 0,723 0,723 0,721 0,725 0,726 X 0,718 0,722 0,720 0,719 0,713 0,722 0,719 0,721 0,718 0,719 0,717 0,721 SD 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 SE 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Nota: X - média; SD= desvio padrão; SE= erro-padrão Teor de Atividade de Água Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 89 Por interpolaçãodas equações de teor deumidade ede teor de atividadede água tem-se uma curva única e homogênea configurando a intersecção das retas no zero, obtendo a fórmula estatística linear: 4CONCLUSÕES Pelos resultados obtidos neste traba- lho, podem-se extrair as seguintes conclu- sões nos testes realizados com grãos de milho (Zeamays Linné). Em relação ao teor de umidade para a safra 2000 encontrou valores entre 10,8 e 14,1%, com uma média de 13,0% e para a safra 2001 encontrou valores entre 12,8 e 14,4%, com umamédia de 13,6%, resulta- doabaixodovalor requeridopelaPortaria nº 845 de 08/11/1976, 14,5%. Não houve diferença significativa entre as amostras no nível de 5%, seja separando as amos- tras por safra ou mesmo por núcleos estabelecidos. O teor de umidade nas safras 2000 e 2001 no Estado do Paraná obtiveram a média de 13,3%, resultado que beneficia a qualidade em referência a micotoxina bem como a prevenção fúngica no armazenamento. Quanto ao teor de atividade de água para a safra 2000 encontrou valores entre 0,704 e 0,725, com umamédia de 0,717 e para a safra 2001 encontrou valores entre 0,716 e 0,726, com uma média de 0,721, resultado abaixo do valor requeridopara crescimento miscelial do fungo Aspergi- llus flavus que é de 0,780. Não houve diferença significativa em relação ao teor de atividade de água destes no nível de 1%, seja separando as amostras por safra ou mesmo por núcleos estabelecidos. O teor de atividade de água nas safras 2000 e 2001 no Estado do Paraná obtiveram a média de 0,719, resultado que beneficia a prevenção de crescimento de fungos no armazenamento. A correlação entre o teor de umidade e o teor de atividade de água foi consta- tada pela fórmula estatística , configurandoa intersecçãoemzero. REFERÊNCIAS ABIMILHO ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS INDÚSTRIAS MOAGEIRAS DE MILHO. Riqueza e produtividade. Disponível em: <http:// www.abimilho.com.br/milho.htm> Acesso em: 13 set.2000. ABIMILHO ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DAS INDÚSTRIAS MOAGEIRAS DE MILHO.Dadosestatísticos. Disponí- velem:<http://www.abimilho.com.br/ milho.htm> Acesso em: 11 nov.2001. ALLINGER, N. L.; CAVA, M. P.; JONGH, D.C.; JOHNSON,CARLR.; LEBEL,N.A. & STEVENS, C.L.QuímicaOrgânica. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 1978. 961p. AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY AOCS.Officialmethodsandrecom- mendedpractices of theAmerican Oil Chemists Society. 3.ed. Cham- paign, IL: AOCS, 1985. v. 1. ARAÚJO, J.M.A.Química de alimentos: teoria e prática. 2.ed. Viçosa: UFV, 1999. 416p. ATKINS, P.W.Moléculas. Tradução: Pau- lo Sérgio Santos e FernandoGalembe- ck. SãoPaulo: Editora daUniversidade de São Paulo, 2000.. p.100-101. Origi- nal inglês. ATKINS, P.W.Moléculas. Tradução: Pau- lo Sérgio Santos e FernandoGalembe- ck. SãoPaulo: Editora daUniversidade de São Paulo, 2000.. p. 153. Original inglês. BUDAVARI, S. Themerck index: an en- cyclopedia of chemicals, drugs and biologicals. 13.ed.WhitehouseStation, NJ:MerckResearchLaboratories, 2001. 1818p. BÜLL, L.T.Culturadomilho: fatores que afetam a produtividade. Piracicaba: Potafos, 1993. 301p. CAMPO E CIDADE. Milho. São Paulo: Livraria Nobel S.A., 1998. 63p. CANÇADO,R.A.Acervodefotosexperi- mentais para dissertação. 2001. 1 álbum (51 fotos): color. e p & b; várias dimensões. CELARO, J.C. Unidades armazenadoras a nível depropriedade. In:CONGRESSO NACIONALDOMILHOE SORGO, 19, Porto Alegre, 1992. Conferências. Porto Alegre: SAA, 1992. p. 234-46. CIRIO, G. M. Detecção e controle de fungosemsementesdemilho(Zea maysL.)armazenados.Curitiba,1998, 69 f. Dissertação (Mestrado emCiênci- as) Setor de Ciências Agrárias, Uni- versidade Federal do Paraná. COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, FIGURA 3 TEOR DE UMIDADE DOS GRÃOS DE MILHO NO ESTADO DO PARANÁ - SAFRAS 2000/2001 FIGURA 4 TEOR DE ATIVIDADE DE ÁGUA DOS GRÃOS DE MILHO NO ESTADO DO PARANÁ - SAFRAS 2000/2001 90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 P.S.. Introduçãoamétodoscromato- gráficos.Campinas:EditoradaUNICAMP, 1997.279p. CRUZ,I.Manejodepragasdaculturadomilho.In: SEMINÁRIOSOBREACULTURADOMILHO SAFRINHA,5,1999,Barretos,SP.Cursospara agricultores.Campinas:IAC,1999.p.27-56. DECAGONDEVICESINC.Wateractivitymet-ter:operatorsmanual.3.ed.Pullman,WA: Decagon,2001.185p. FAOFOODANDAGRICULTUREORGANIZATI- ON. World agricultural information center.Disponívelem:<http://www.fao.org/ waicent/search/default.asp>Acessoem:12 set..2001. GERMANO,P.M.L.;GERMANO,M.I.S.Higiene e vigilância sanitária de alimentos: qualidadedasmatérias-primas,doençastrans- mitidasporalimentosetreinamentoderecur- soshumanos.SãoPaulo:LivrariaVarela,2001. p.37-42. GOULD,W. A; GOULD, R. W. Total quality assurance. 2.ed.Baltimore:CTIPublicati- ons, Inc.,1993.463p. HOBBS,B.C.; ROBERTS,D.Toxinfecçõese controle higiênico-sanitário de ali- mentos.Tradução:SilviaPanettaNascimen- to,MarceloArrudaNascimento.SãoPaulo: LivrariaVarella,1998.p.03-47.Originalinglês. ICMSFCOMISSÃOINTERNACIONALPARAESPE- CIFICAÇÕESMICROBIOLÓGICASDOSALIMEN- TOS.APPCCnaqualidadeesegurança microbiológicadealimentos: análises deperigosepontoscríticosdecontrolepara garantiraqualidadeeasegurançamicrobio- lógicadealimentos.Tradução:D.AnnaTerzi Giova;revisãocientífica:EneoAlvesdaSilva JR. SãoPaulo: LivrariaVarela, 1997. 377p. Originalinglês. ICMSFINTERNATIONALCOMMISSIONONMI- CROBIOLOGICALSPECIFICATIONSFORFOO- DS. Ecologia microbiana de los ali- mentos:factoresqueafectanalasuperviven- ciadelosmicrorganismosemlosalimentos. Zaragosa:Acribia,1983. ICMSFINTERNATIONALCOMMISSIONONMI- CROBIOLOGICALSPECIFICATIONSFORFOO- DS.Microorganismsinfoods:characte- risticsofmicrobialpathogens.London:Black Academic&Professional,1996. INSTITUTOADOLFOLUTZ.Normasanalíticas doInstitutoAdolfoLutz:métodosquími- cosefísicosparaanálisedealimentos.3.ed. SãoPaulo:OInstituto,1985.v.1,cap.4,p.21- 22. INSTITUTOADOLFOLUTZ.Normasanalíticas doInstitutoAdolfoLutz:métodosquími- cosefísicosparaanálisedealimentos.3.ed. SãoPaulo:OInstituto,1985.v.1,cap.2,p.04- 09. KOEHLER, H. S. Estatística experimental. Curitiba:UFPR,1999.124p.(Apostila). KOEHLER,H.S.Manualdeusodoprograma mstatc.Curitiba:UFPR,1996.38p.(Aposti- la). LACEY,J.Preventionofmouldgrowthandmyco- toxinproductionthroughcontrolofenviron- mentalfactors.In:INTERNATIONALIUPAC SYMPOSIUMONMYCOTOXINSANDPHYCO- TOXINS,7,Tokyo,1988.Mycotoxinsand phycotoxins88, editedbyS.Natori and others.Amsterdam:ElsevierScience,1989.p. 161-9.(BioactiveMolecules,10). LACEY,J.;RAMAKRISHNA,N.;HAMER,A.;MA- GAN,N.;MARFLEET,C.Grainfungi.In:ARO- RA,D.K.;MUKERJI,K.G.;MARTH,E.H.(Ed.). Handbookofappliedmycology: foo- dsandfeeds.NewYork:MarcelDecker, 1991. LEHNINGER,A.L.Princípiosdebioquímica. Traduzidopor:W.R.Lodi,A.A.Simões.São Paulo:SARVIER,1990.p.203-222.Original inglês. LEITÃO,M.F.F.Microbiologiadealimentos.In: ROITMAM,I.;TRAVASSOS,L.R.;AZEVEDO, J. L. Tratado de microbiologia. São Paulo:Manole,1988.p.1-81. MALLOZZI,M.A.B.;CORRÊA,B.Fungostoxigêni- cosemicotoxinas.BoletimTécnicoIns- titutoBiológico, SãoPaulo,n.12,p.5-26, jul.,1998. MARTIN,P.M.D.;GILMAN,G.A.Aconsiderati- onof themycotoxinhypothesiswith specialreferencetothemycotoxinof maize, sorghum,wheat andground- nuts. London:TropicalProducts Institute. 1976.111p.(Report,G105). MILLER,B.M.Mycotoxins:general informati- ons.Lansing:NeogenCorporation,1999.39p. (Report). MICHIGANSTATEUNIVERSITY.MSTATC,ver- são2.10,EastLansing,MI,1989,2disquetes 3½pol.,MSDOS. NORTHCAROLINASTATEUNIVERSITY.Unders- tanding and coping with effects of mycotoxins in livestock feed and fo- rage.NC-USA:NCCES,1993.p. 4-17. (Re- port). PATERNIANI,E.;CAMPOS,M.S.Melhoramento domilho. In:BORÉM,A. (Ed.).Melhora- mentodeespéciescultivadas. Viçosa: EditoraUFV,1999.p.429-485. PIMENTEL, I.C.Estudodefungosendofíti- cos domilho (Zeamays L.) e da soja (Glycine max (L.) Merril) e busca de possíveis entomopatógenosnocon- troledepragasagrícolas.Curitiba,2001. 149f.Tese(DoutoradoemProcessosBiotec- nológicos)SetordeTecnologia,Universida- deFederaldoParaná. PRADO,G.;MARTINS-VIEIRA,M.B.C.;SANTOS, J.P.;NICÁCIO,M.A.S.Ocorrênciademicoto- xinasemmilhopós-colheitaearmazenadono EstadodeMinasGerais,safra1991.ParteI.In: CONGRESSOBRASILEIRODECIÊNCIAETEC- NOLOGIADEALIMENTOS13.,SãoPaulo, 1992.Anais.SãoPaulo:SBCTA,1992.p.41. ROMEIRO, R. S.Bactérias fitopatogênicas. Viçosa:UFV,1995.283p. SÃOPAULO.CódigoSanitáriodoEstadodeSão Paulo:Leinº10.083,de23desetembrode1998. Decretonº12.342,de27desetembrode1978 (Regulamentodapromoção,preservaçãoe recuperaçãodasaúdenocampodecompetên- ciadaSecretariadoEstadodaSaúde).Nor- mas técnicas e legislação estadual e federalbásicaecomplementar. Bauru, SP:EDIPRO,4.ed.atual.ampl.,2001.nta.33. (SérieLegislaçãoEstadual). SCUSSEL, V. M. (Org., Ed.). Atualidades em micotoxinasearmazenagemdegrãos. Florianópolis:Ed.daAutora,2000.382p. SCUSSEL,V.M.MicotoxinasemAlimentos. Florianópolis:Insular,1998.144p. SECRETARIADAAGRICULTURAEDOABASTECI- MENTODOPARANÁSEAB.Acompanha- mento da situação agropecuária do Paraná.Curitiba:SEAB/DERAL/CEPA/PR,v. 25,n.10,p.26-42,out.1999. SEGANFREDO,R.Micotoxinas:paraprevenir,o segredoémonitorarplantio,colheita,armaze- nagem,ração...RevistaBatavo,Castro,n.79, p. 8-10,Mai. 1998. InformaçõesAgronô- micas, Piracicaba, n. 83, p. 5-6, Set. 1998. Resumo. SEMPLE,R.L.;FRIO,A.S.;HICKS,P.A.;LOZARE, J. V. (Ed.).Mycotoxin prevention and controlinfoodgrains.Bankok,Thailand: FAO/UM,1998.2v. SETTI,T. IndustrializaçãodomilhonoBrasil. In: CONGRESSONACIONALDOMILHOESOR- GO,19.,PortoAlegre,1992.Conferências. PortoAlegre:SAA,1992.p.176-85. SILVAJR.,E.A.Manualdecontrolehigiênico- sanitárioemalimentos. 4.ed. SãoPaulo: LivrariaVarela,2001.432p. SILVERSTEIN, R.M.; BASSLER,G.C.;MORRI- LL, T.C. Identificaçãoespectrométrica de compostos orgânicos. 3.ed, Rio de Janeiro: Ed. Guanabara, 1987. 299p. SIMEPARSISTEMADEMETEREOLOGIADO PARANÁ.Monitoramentoeprevisãodo tempoParaná. Disponível em: <http:/ /previsao.simepar.br>Acessoem:26nov. 2001. SPIEGEL, M.R. Estatística. 2ª. Ed. Rio de Janeiro: Ao Livro Técnico, 1970. 580p. TOXINA. In:MICHAELIS2000:modernodici- onárioda línguaportuguesa.Riode Janei- ro: Readers Digest; São Paulo: Melhora- mentos, 2000. v.2, p. 2090 -2091. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ DepartamentodeBioquímica.Bioquími- ca : aulas práticas. 6.ed. Curitiba: Ed. da UFPR, 2001, 178p. USDA UNITED STATESDEPARTMENTOF AGRICULTURE. Office of operations. Disponível em: <http://www.usda.gov/ oo/services.httm>Acessoem09abr.2000. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 91 92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 PESQUISA Uma agenda positiva de pesquisa sobre os impactos de árvores geneticamente modificadas no meio ambienteUma agenda positiva de pesquisa sobre os impactos de árvores geneticamente modificadas no meio ambienteUma agenda positiva de pesquisa sobre os impactos de árvores geneticamente modificadas no meio ambienteUma agenda positiva de pesquisa sobre os impactos de árvores geneticamente modificadas no meio ambienteUma agenda positiva de pesquisa sobre os impactos de árvores geneticamente modificadas no meio ambiente Fotos e Ilustrações cedidas pelos autores Árvores Geneticamente Modificadas na Silvicultura Intensiva Di Ciero, Luciana, Doutora,Pesquisadora,ESALQUSP, E-mail: ldctleme@terra.com.br; Amaral, W., PhD,Professor, ESALQUSP, E-mail:wanamara@esalq.usp.br INTRODUÇÃO esde 1885, quando Louis Pasteur fez grandes avan- ços sobre a fermentação do açúcar, a questão da natureza e modo de ação das enzimaspara a soluçãodeproble- mas começou a ser elucidada, dando início a enzimologia e ao estudo de proteínas. Após este período, as ciên- cias biológicas e especialmente as áre- as ligadas agenética e abiologiamole- cular vêm se desenvolvendo a uma velocidade cada vez maior. Com o postulado de Watson-Crick sobre a estrutura doDNAem1953, e os traba- lhos de seqüenciamento de nucleotí- deos, reconhecido com um prêmio Nobel aFredSangernadécada seguin- te, deu-se início a uma nova era da ciência a era da genômica. A partir deste período os trabalhosna área da genéticaebioquímicamigraramparaa chamadaBiologiaMolecular,originan- do ainda a Engenharia Genética, ou seja a alteração direta do material ge- nético através de processos físicos e biológicos. Atualmente são raros os trabalhos científicos envolvendo fisio- logia, bioquímica e genética que não usemferramentasdabiologiamolecu- lar para a explicação de eventos e processosbiológicos.Éneste contexto que se insere a Biotecnologia moder- na. OconceitoamplodeBiotecnologia se pauta na aplicação em grande escala, ou transferênciapara indústria, dosavançoscientíficose tecnológicos, resultantes de pesquisas em ciências biológicas. Porématualmente enten- de-seporbiotecnologiaousodeorga- nismos vivos (ou suas células e molé- culas) paraprodução racionalizadade substâncias, gerandoprodutos comer- cializáveis. A biotecnologia moderna tambémpode ser aindadefinida como o grupo de tecnologias que implicam na modificação direta do genoma de um organismo alvo pela introdução intencional de fragmentos de DNA exógenos, equepossuemuma função conhecida. A partir daí o gene que contém as informações para a síntese de uma proteína, a qual por sua vez esta inserida no mapa metabólico da síntese de umamolécula de interesse, pode ser transferido para outro orga- nismo que então produzirá grandes quantidades da substância e/ou ex- pressará as características desejadas. Diversos exemplos de produtos que têm sido produzidos pela biotecnolo- giamodernasãoconhecido,porexem- plo: a) interferonhumano (substância natural sintetizada no organismo hu- mano para defesa contra vírus), b) insulinahumana,c)hormôniosdecres- cimento humano, d) plantas resisten- tes a vírus, e) plantas tolerantes a insetos e f) plantas resistentes a herbi- cidas.Outrouso importantedabiotec- nologia é a produção de bactérias, utilizadasparabiodegradaçãodevaza- mentos de óleos ou lixos tóxicos, ou Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 93 como produtoras de aromatizantes e outros produtos para a industria ali- mentícia. Abiotecnologiamoderna temsido largamente utilizada em agricultura e florestas, contribuindo para aumento da produtividade e/ou, como ferra- menta para resolver problemas de nutrição humana, diminuindo custos de produção, bem como produzindo materiais genéticos adaptados para condições adversas de clima e solo através de cultivares tolerantes à es- tresses hídricos e nutricionais e resis- tentes a pragas e doenças. Com o advento do desenvolvimento da bio- tecnologia eespecialmente comapro- dução de organismos geneticamente modificados, também verifica-se o desenvolvimento de medidas de se- gurança e de normas para pesquisa e uso comercial destes organismos e seus derivados. Essas medidas de se- gurança, ou seja o conjunto de ações voltadas para a prevenção, minimiza- ção ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, visando à saúde do homem, dos animais, a pre- servação do meio ambiente e a quali- dade dos resultados é chamada de biossegurança(Teixeira&Valle, 1996). O Brasil estabeleceu por meio de legislação específica, normas debios- segurançapara regular ousode enge- nharia genética e a liberação nomeio ambiente deorganismosmodificados por essa técnica. Essas normas estão regulamentadaspela lei no. 8974, san- cionada em 05/01/1995 e regulamen- tada pelo Decreto Lei no. 1752 de 20/ 12/1995. Este decreto alémde regula- mentar a Lei deBiossegurança, dispõe sobre a vinculação, competência e composiçãodaComissãoTécnicaNa- cionaldeBiossegurança -CTNBio,que integra a estrutura doMCT (Ministério da Ciência e Tecnologia). Esta comis- são é composta por representantes do Executivo, do setor empresarial que atua em biotecnologia, de represen- tantes de consumidores e do órgão legalmente constituído de proteção à saúde do trabalhador. Em resumo, a CTNBio tem o propósito de avaliar os riscos a utilização de transgênicos no Brasil, porémnão sendo umórgão de caráternormativo. Em recente reunião do CONAMA (ConselhoNacional doMeioAmbien- te), ocorrida em 12 de Junho de 2002, foram retiradosdaCTNBioospoderes para dispensar produtos transgênicos do licenciamento prévio, porém a Advocacia-Geral da União (AGU) re- conheceuopoder conclusivodaCTN- Bio nas análises sobre repercussões dos transgênicos à saúdehumanae ao meio ambiente. CULTURASTRANSGÊNICAS NOBRASIL No contexto global sobre o uso culturas transgênicas,oBrasil temassu- midoumaposiçãode cautela em rela- ção amaioria dos países industrializa- dos, incluindoEUA, amaioria dospaí- ses da Europa e o Japão. Este postura cuidadosapodeapriori ser considera- da uma desvantagem para o setor agrícola exportador brasileiro, porém ainda não existem dados disponíveis provandoas reais vantagens competi- tivas do uso destas tecnologias para o país, considerando as restrições que começam a ser impostas pelos com- pradores, principalmentepelospaíses daComunidadeEuropéia. Umestudo feito pelo pesquisador da EMBRAPA TRIGOEriveltonRoman,mostrouque, considerando o preço por quilo da semente transgênica a US$ 1,15, a estimativadecustoda tecnologia (her- bicida e semente) por hectare, no Brasil, seria de US$ 69,50 para a soja transgênica eUS$ 70 para a convenci- onal, ou seja barateando o custo de produção em US$ 0,50, o qual seria muito interessanteparagrandes áreas, o que vem a ser muito comum no Brasil Central. Porém esta vantagem econômica aindanão incorpara apos- sibilidadedasojanão transgênica rece- ber preços maiores no mercado, ou alternativamente, a soja transgênica receber umdescontopara comerciali- zaçãono exterior. O Brasil tem adotado uma política de biossegurança, analisando caso-a- casoospedidosde liberaçãodeplantio de OGMs. O fato da CTNBio ter dado oparecer favorável aopedidode libe- raçãodacomercializaçãopelaMonsan- to de sementes de soja transgênica resistente aherbicidas semestudosde impacto ambiental prévio. Este fato catalizou um grande e tardio debate pela opinião pública sobre OGMs, acompanhadodeumabatalha judicial parabarrar a sua liberaçãonoambien- te,principalmente lideradopororgani- zações não-governamentais, a Socie- dade Brasileira para o Progresso da Ciência (SBPC),o InstituoBrasileirode Defesa do Consumidor (IDEC) e Gre- enpeace permanecendo sob judicie até recentemente, quandoaMonsanto ganhou emprimeira instância. Porém por enquanto, os agricultores brasilei- ros não têm permissão oficial para plantar qualquer cultura transgênica. Países em desenvolvimento com a política debiossegurança semelhante a do Brasil incluem Quênia e Índia, segundo Relatório publicado pelo IF- PRI em2000 (International Food Poli- cy Research Institute). Este relatório aponta a China como o país mais permissivo nesta área em relação aos outros três analisados, já tendoprodu- Silvicultura Taxa de crescimento Eficiêncianutricional Forma do fuste Controle de florescimento Tolerância aherbicida Adaptabilidade Tolerância a seca Tolerância ao frio Resistência a fungos Resistência a Insetos Qualidade da madeira Densidadedamadeira Reduçãode lignina Extraçãode lignina Qualidadede fibra Tabela 1 . Características florestais que podem ser melhoradas através da combinação demétodos clássicos demelhoramento comnovas ferramentas moleculares Fonte: Adaptado de Sedjo, A. R. Biotechnology and planted forests: assessment of potential and possibilities, Discussion Paper 00-06, RFF 1999. http://www.rff.org 94 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 tos GM liberados para o plantios co- merciais desde 1997. DIFERENÇASENTREESPÉCIES AGRÍCOLAS E FLORESTAIS EOUSO DASNOVASFERRAMENTASBIO- TECNOLÓGICAS Ousoda técnica deDNA recombi- nante em espécies florestais seguiu muito deperto os avanços empesqui- saagrícola.Emboraousoda técnicade engenharia genética emárvorestenha derivado do desenvolvimento desta técnica em sistemas modelo e a partir de espécies agrícolas, o plantio de espécies arbóreas geneticamentemo- dificadas introduznovascircunstâncias de manejo e preocupações ambien- tais. A biologia de espécies florestais difere de espécies agrícolas em diver- sos aspectos que devem ser levados em conta para avaliação de riscos: a) Espécies florestais são organismos com ciclos de vida longos, grande porte e essencialmente não do- mesticados. Poroutro lado, espéci- es agrícolas têm sido cultivadas e selecionadas por séculos emilêni- os. O processo de domesticação normalmente leva a perda de ca- racterísticas que são importantes para a planta se estabelecer no ambientenatural. Como resultado, espera-seque a variedade transgê- nicas destas culturas reduza a pro- pensão por invasividade em habi- tats naturais. Entretando, emespé- cies arbóreas, os ciclos de vida são muitomais longos que para amai- oria das espécies agrícolas, e as condiçõesambientaisnão sãobem controladas, desta forma árvores depararam-se repetidamente com estresse ambiental, extremos cli- máticose flutuaçãonaspressõesde uma série de pragas e doenças. As populações florestais exibemgran- de diversidade, e freqüentemente crescemsobcondiçõesvariadasde local e emmuitas associações eco- lógicas diferentes.No seu ambien- tenatural, tais espécies são relativa- mente bemadaptadas e altamente competitivasemecossistemascom- plexos, alémdemanter altosníveis de diversidade genética. O papel dareproduçãosexuadagaranteque as populações plantadas mais se assemelhemaspopulaçõesnativas que as culturas agrícolas.Ousode poucos genótipos geneticamente modificados por afetar este balan- ço. b)Enquantohádiversos tiposdeecos- sistemas florestais, amaioria deles são marcadamente diferentes da- queles tipicamente usados para a produção agrícola em países em desenvolvimento. O uso de insu- mos (fertilizantes e agroquímicos) em plantios florestais é relativa- mentemais baixo, poroutro ladoo nível dediversidadebiológicanes- tes ecossistemas é muito alto. A manutenção da diversidade para muitas espécies não cultivadas é freqüentemente um objetivo im- portante e é considerado para o desenvolvimentosustentadodeflo- restas, enquanto que os objetivos demanejopara amaioriadosecos- sistemasagrícolasconsideramqual- quer outra planta comoplantas in- vasoras.As interaçõesentreespéci- esflorestaissão,relativamentemuito mais complexas que aquelas em sistemasagrícolas,ondeaabundân- cia de espécies e a distribuição são normalmentealtamente regulados. Nosecossistemasagrícolas, asdeci- sões de manejo são geralmente feitas embasede campo-a-campo, e os benefícios resultantes para uma cultura particular são pouco afetados pelo manejo de campos vizinhos. A situação em floresta é freqüentemente um pouco dife- rente, onde as decisões demanejo devemser integradasdentrodeum sistema florestal. c) A variaçãogenética dentrode espé- cies tem,por séculos, fornecidoum pooldegenes ricoqueosmelhoris- tas têmmanipuladoe reunidopara melhorar a produção e qualidade das culturas. Trabalhando-se com espécies altamente domesticadas, os agricultores geralmente visamo potencial dopool de gene restante que é acessível através da transfe- rência sexual queé as vezes limita- do.Poroutro ladoconsidera-seque a tecnologia de transferência de genes entre espécies via engenha- ria genética pode romper estas limitações. Embora estesmétodos convencionais de melhoramento Figura 1 . Número de liberação de novas espécies de árvores geneticamentemodificadas Fonte:http://www.panda.org/resources/publications/forest/gm/gm- forestry.html#box1 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 95 têm levadoa rápidadomesticação e o melhoramento das espécies agrícolas, ela émuito lenta e cara quandodiretamenteaplicadapara espécies florestais.Osganhosde- vidos aomelhoramento emespé- cies florestais temsido reportados como relativamente restritos, não somente pela necessidade de se- leção dentro de um imenso pool de genes disponível, mas pelo tempo e custo necessários para manipular genes selecionados dentrodaspopulaçõesdemelho- ramento. Por outro lado, os me- lhoristas florestais têm sido rápi- dosemusarqualquernova tecno- logia que melhore a sua taxa de progresso: tratamentos para esti- mular o florescimento precoce, aumenta na eficiência estatística de campos de teste e previsão dosganhosdemelhoramento, se- leçãoassistidapormarcadoresde seleção, etc. POTENCIALDASNOVASFERRA- MENTASBIOTECNOLOGICASEM SILVICULTURAINTENSIVA Noâmbito florestal, asnovas ferra- mentas biotecnologicas devem com- binar o desenvolvimento de árvores superiores com métodos clássicos de melhoramentoepossibilitar amultipli- cação em larga escala do material ge- nético melhorado a partir de seleção genotípica.Omelhoramento florestal clássico é freqüentemente visto como umacondiçãoprévia para a utilização efetiva de técnicas sofisticadas debio- tecnologia tais comoaengenharia ge- nética. Na agricultura por exemplo, foram necessárias muitas décadas de melhoramento clássico antes da trans- ferência de genes via engenharia ge- nética. Na área florestal, considera-se que a tecnologia de transferência de genes pode contribuir paraminimizar as limitações intrínsicas do melhora- mentodeespécies arbóreas, tais como o longo tempo para obtenção de no- vas gerações e a grande variabilidade existente entre e dentro de espécies, que de um lado é uma das grandes vantagens das plantações florestais, e aomesmo tempoexige grandes esfor- çospara seleçãodosmelhoresmateri- ais. Em plantações florestais para fins industriais, busca-senormalmente au- mentonas taxasde crescimento, resis- tência apragas edoenças, tolerância a herbicidas,adaptabilidadeàscondições climáticas e de solo, formada árvore e qualidade de fibra (Tabela 1). Porém dentro de um contexto de sustentabi- lidade a longo prazo das plantações florestais, novaspreocupaçõesdevem surgir, principalmentequantoamanu- tenção da produtividade florestal ao ínvezdabusca constantedeaumentos deprodutividade. Paralelamente, além de asse- gurar o estabelecimento, a sobrevi- vência, e o crescimento rápido dos genótipos, os programas demelhora- mento de árvores focalizam também naqualidadedemadeira. No setor florestal, o número de espécies modificadas geneticamente liberadas no ambiente aumentou 45 vezes (Fig. 1), divididas em24 espéci- es geneticamentemodificadas (Tabe- la 2). Atualmente no Brasil desenvol- ve-se dois projetos genoma de Eu- calyptus, um financiado por um con- sórcio entre a FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) e iniciativa privada e outro fi- nanciado por um consórcio entre o Governo Federal e iniciativa privada, utilizando-seduasestratégiasdiversas, Tabela 2 . Espécies de árvores geneticamente modificadas liberadas entre os anos de 1988 a 1998 Nome vulgar (em inglês) Europeanaspen Americanblackwalnut Apple European sweet chestnut Plum Red River gum Black spruce Sweetgum Europeanblackpoplar Silverbirch American chestnut Sweet orange Tasmanianblue gum Norway spruce Scots pine Acaciamangium Monterey pine Teak Floodedgum Olive Easterncottonwood Quakingaspen Cherry Nome científico Populus tremula Juglansnigra Malusdomestica Castanea sativa Prunus domestica Eucalyptuscamaldulensis Piceamariana Liquidambarstyraciflua Populus nigra Betulapendula Castaneadentata Citrus spp. Eucalyptus globulus Picea abies Pinus sylvestris Acaciamangium Pinus radiata Tectonagrandis Eucalyptusgrandis Olea europea Populus deltoides Populus tremuloides Prunus avium Ano de liberação 1988 1989 1991 1992 1992 1993 1993 1994 1995 1996 1996 1996 1996 1996 1996 1997 1997 1997 1998 1998 1998 1998 1998 96 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 uma baseadaem sequenciamento de sequências expressas (EST: Expressed SequenceTags) eooutrobaseadouso demarcadoresmoleculares para loca- lização de de genes e QTLs através uma rede de experimental de clones instalados em diferentes regiões do Brasil. POTENCIAIS RISCOS AMBIENTAIS RELACIONADOS A USO DE ÁRVORES GENETICAMENTE MODIFICADAS Ospotenciais impactos ambientais do uso de organismos geneticamente modificados devem levar em conta diversos fatores, tais como: técnicas usadas para transformação, gene(s) transferido(s), espécia transformada, localizaçãogeográficada liberaçãodo OGMnomeio ambiente, a biodiversi- dadeda região,distâncias filogenéticas entre a espécies modificadas e outras espécies presentes no ambiente, ca- racterísticas fenotípicas e ecológicas da planta e espécies relacionadas, en- tre outros. De acordos com estes fato- res, os impactos podem ser classifica- dos em diretos e indiretos. ImpactosDiretos Impactosdiretos sãoaqueles relaci- onados diretamente ao organismo modificadogeneticamenteouseualvo de ataque. No contexto florestal para os principais genes de interesse cita- dos acima, os impactosdiretospodem ser: a) Interações químicas com orga- nismos vivos, por exemplo para genes ligados a tolerância a inse- tos: - Efeitos não alvo de resistência a inseticidas - Destino eConseqüências de toxi- nas inseticidas no solo b) Mudanças na persistência ou invasividade da cultura - Aumentodapersistência nohabi- tat - Invasão emhabitats naturais c) Fuga de genes - Transferência de tolerância a her- bicidaspara ervasdaninhas - Transferência de tolerância a es- tresse biótico ou abiótico a ervas daninhasouespécies alimentícias - Transferência sexual de genes de árvores geneticamente modifica- das com resistência a antibiótico para microorganismos patogêni- cos, vindo de árvores genetica- mentemodificadas comgenes de resistência a antibióticos na cons- trução - Fuga de genes de herbicidas em progênies sexuais a árvores em ambientes onde aquelas árvores são indesejáveis e ondeoherbici- da alvo é usado - Dispersão de transgene para po- pulaçõesnativasoudaninhas,com impactos potencialmente negati- vos de Árvores geneticamente modificadas não-estéreis ou da- quelas com esterilidade instável ou incompleta. Algumas evidências indicam que sobcondiçõesexperimentais, culturas transgênicas podem hibridizar com espécies ou sub-espécies relaciona- das,umpré-requisitopara introgressão gênica. Há 4 elementos básicos que de- terminam a possibilidade e conseqü- ências da fuga de genes desse modo: 1. A distância domovimento de pó- lendas culturas transgênicas; 2. Asincroniado florescimentoentre o doador e o receptor de pólen; 3. A compatibilidade sexual entre as espécies; 4. A ecologia das espécies recepto- ras. Estes são portanto alguns dos fatores que devem estudados em programas depesquisa sobreos impactos ambie- tais de árvores geneticamentemodifi- cadas. Infelizmente muitas destas in- formações básicas não estão disponí- veis, e portanto devem ser obtidas para cada espécie a ser modificada. Impactos Indiretos Os impactos indiretos estãoassoci- adosaos riscospotenciaisparaosdife- rentes compomentes do ecossistema florestal: a) Redução da eficiência de con- trole de pragas, doenças e ervas daninhas - Desenvolvimento de ervas dani- nhas tolerantes a herbicidas por evolução e seleção de dentro do pooldegenesdaervadaninha -As ervasdaninhas resistentes aherbi- cidas podemsedesenvolver den- tro de populações de ervas dani- nhas continuamentepulverizadas comomesmo herbicida. - Desenvolvimentode resistência a toxina Bt em pragas - Mudanças na integridade estrutu- ral, adaptação e resistência a pra- gas das árvores, taxa debiomassa e estrutura do solo, biologia e fertilidade, vindodeárvoresgene- ticamentemodificadas commodi- ficaçõesquímicas de lignina b) Efeito na Biodiversidade nativa - Reduçãodabiodiversidadedeor- ganismosdependentesde flores e frutos pelo uso de árvores geneti- camentemodificadas - Efeitos deletérios em inimigos naturais das pragas alvo - Efeito deletério em insetos não- alvo comoborboletas, insetospo- linizadores emicroorganismosdo solo, vindo de árvores genetica- mente modificadas com resistên- cia a insetos. c) Efeitos no solo - Mudanças nos padrões de distri- buiçãoe abundânciadamesofau- na Convém ressaltar que estes im- pactos (a, b e c) também podem ocorrer normalmente em plantações não transgênicas. Desta forma as aná- lises dos impactos indiretosdevemser feitas levando-se em consideração as linhas de base das práticas de implan- tação e manejo florestal adotadas em largaescala. d) Outros impactos - Potencial instabidadedasconstru- ções transgênicas dentrodospro- cessos ontogenéticos das árvores - Redução da diversidade genética pelo usodeumoupoucos clones - Persistênciapor longoperíododos impactosdevidoao longociclode vida das espécies florestais - Dificuldadedemitigar os escapes de genes e reverter os danos po- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29 97 tenciais - Dificuldade em prever as conse- qüências em ecossistemas com- plexos, devido a falta de linhas de baseapropriadas RISCOSPOTENCIAISESPECÍFICOS AMUDANÇASQUÍMICAS NAMOLÉCULADELIGNINA Asmodificações genéticas para re- duzir o conteúdode ligninanamadei- ra, oualterar suaestruturaquímica são usados para aumentar a qualidade e eficiência da polpa e diminuir os eflu- entes industriais.A ligninaéoprincipal componente estrutural da parede ce- lular das células vegetais, e confere força, rigidez e impermeabilidade a água. A transformação com genes de modificação de lignina pode levar a efeitos colaterais não intencionais os quaispodemtrazer implicaçõesecoló- gicas. Por exemplo, a alteração de enzimas envolvidas em biossíntese pode resultar emmuitos efeitos pleio- trópicos, particularmente quando são usadospromotoresquenão forneçam expressão específica de xilema. Dife- rentes quantidades de lignina afetam ainda a habilidade de herbívoros em digerir material vegetal, e estas altera- ção pode afetar a nutrição e a taxa de crescimentodedesfoliadores epragas demadeira. Finalmente a lignina retar- da a degradação da biomassa por mi- croorganismos e deixa a decomposi- çãodematerial sobreosolomais lenta. Asárvoresgeneticamentemodificadas com modificação de lignina podem eventualmente desta forma afetar a estrutura e fertilidade do solo. CONCLUSÕES Nosúltimosanos temseobservado que a grande maioria das empresas florestais noBrasil tem investidomaci- çamente em propagação vegetativa, conhecidacomoclonagemna termi- nologiausadaemsilvicultura intensiva. Concomitantemente verifica-se que a produçãodeárvores transgênicas será somente comercialmente atrativa caso estes genótipos geneticamentemodi- ficados possam ser propagados em larga escala e a baixos custos. Nos trópicos,muitas espécies de Eucalyp- tus, gmelina e outras espécies folho- sas, têm semostradode fácil propaga- ção. Entretanto, muitas espécies não são propagadas facilmente quando o conteúdo genético é modificado, e o custo de propagação em larga escala tem semostrado alto. Nestes casos, as árvores geneticamente modificadas, que combinemomelhoramento clás- sico e as novas ferramentas da enge- nharia genética, podemexigir um lon- go período de tempo antes que estas possam sermultiplicadas em larga es- cala. Nesta situação a utilização da transferência de genes limitaria o seu usocomercialdevidoaosaltoscustose tempoexigidos. Em resumo, a capaci- dadedaengenhariagenéticade inserir ou modificar genes alienígenas para prover as características desejadas em árvores superiores está diretamente associada ao sucesso de propagação de árvores superiores em larga escala e a baixo custo. Apesar de existiremmuitas expec- tativas quanto ao uso de engenharia
Mais conteúdos dessa disciplina
BIOFISICA E BIOMECANICA APLICADAS ENGENHARIA BIOMEDICA PRONTO 2025 ABNT PDF- ATIVIDADES COMPLEMENTARES ENGENHARIA DE PRODUCAO PRONTO 2025 ABNT PDF INTELIGENCIA ARTIFICIAL ENGENHARIA DE SOFTWARE PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA VIDA E CARREIRA GESTAO FINANCEIRA PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA VIDA E CARREIRA ENGENHARIA QUIMICA PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA VIDA E CARREIRA DESIGN DE INTERIORES PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA VIDA E CARREIRA CIENCIAS BIOLOGICAS BACHARELADO PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA USABILIDADE, DESENVOLVIMENTO WEB, MOBILE E JOGOS ANALISE E DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA UNIDADE CLINICA EXPLORATORIA ODONTOLOGIA PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA TRANSDUCAO E INSTRUMENTACAO EM SISTEMAS BIOMEDICOS ENGENHARIA BIOMEDICA PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA TRABALHO DE CONCLUSAO DE CURSO ENGENHARIA ELETRONICA PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA TRABALHO DE CONCLUSAO DE CURSO ENFERMAGEM PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA TRABALHO DE CONCLUSAO DE CURSO CIENCIAS BIOLOGICAS BACHARELADO PRONTO 2025 ABNT PDF
- ATIVIDADE PRATICA TEORIA DO DIREITO DIREITO PRONTO 2025 ABNT PDF
- Projeto Integrador em Ciências Biológicas I
ANÁLISE DO pH DE DIFERENTES TIPOS DE ÁGUA UTILIZANDO INDICADORES CASEIROS
- Projeto Integrador em Ciências Biológicas.
ANÁLISE DO pH DE DIFERENTES TIPOS DE ÁGUA UTILIZANDO INDICADORES CASEIROS
- Assinale a alternativa cuja(s) palavra(s) complete(m) adequadamente a frase: Durante a _____________________________, a sequência de nucleotídeos n...
- Os fundamentos da genética molecular aplicada exploram a estrutura do DNA nas plantas e a organização de seus genes. Essas informações são fundamen...
- Qual das seguintes opções é uma aplicação do laboratório de imunologia clínica no diagnóstico individual? A Contribuição no diagnóstico diferencial en
- a transmissao de caracteristicas hereditarias dos seres vivos pluricelulares ocorre por meio da produçao e fusao
- quais são os cromossomos da mulher
- quais sao os cromossomos do homem
- O ácido desoxirribonucleico possui características próprias com relação a autoduplicação e suas características posteriores, analise as afirmativas...
- A terapia gênica consiste em: 2025/4 - AVALIAÇÃO REGULAR Curso: FARMÁCIA Disciplina: GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Turma: FAR2025 S4 M16 2025/4 A T...
- A terapia gênica consiste em: 2025/4 - AVALIAÇÃO REGULAR Curso: FARMÁCIA Disciplina: GENÉTICA E BIOLA Transferir proteínas para células que não as ...
- 00: galactosemia, doença metabólica hereditária <<00 <<< enzima galactose 1-fosfeto uridiltransferase, ------------------------- 1 ## enzima provoc...
- Quanto ao sexo das minhocas: Questão 3Escolha uma opção: a. Os machos são maiores b. Sexos separados (macho e fêmea) c. São hemafroditas d. As fêmeas
- MEMBROS SUPERIORES
- Morfofuncional
