Ana Reis Contributos para o desenvolvimento de fagoterapias para infecções hospitalares por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes

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Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto 
Instituto Politécnico do Porto 
 
 
 
 
 
Ana Cristina Pereira Alves dos Reis 
 
 
 
 
 
Contributos para o desenvolvimento de fagoterapias para infecções 
hospitalares por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes 
 
 
 
 
Dissertação submetida à Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto para 
cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Tecnologia 
Bioquímica em Saúde, realizada sob a orientação científica de Professor Doutor Ruben 
Fernandes (Ciências Químicas e das Biomoléculas), Professora Pilar Baylina Machado 
(Gestão em Saúde) e Dr. Ricardo Ferraz (Ciências Químicas e das Biomoléculas). 
 
 
 
 
 
 
Setembro 2011 
 
 
 
"Assim como existe uma forma saudável de definir e viver a doença, existe um desafio 
constante para manter e representar positivamente o estado de saúde". 
(Bolander,1998) 
 
TÍTULO: Contributos para o desenvolvimento de fagoterapias para infecções hospitalares 
por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes 
 
RUNNING TITTLE: Fagoterapias para infecções por Pseudomonas aeruginosa 
multirresistentes 
 
RESUMO 
 As infecções hospitalares podem ser evitadas pelo controlo de determinados factores 
inerentes aos profissionais, material, ambiente. Neste momento, existe legislação própria de 
forma a regulamentar procedimentos que evitam a propagação da infecção e/ou dos agentes que 
a causam. A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa oportunista responsável 
por grande parte das infecções hospitalares. Pelo facto de ser oportunista é mais frequente em 
pacientes imunocomprometidos, sujeitos a transplantes, intervenções cirúrgicas, entre outros. 
Em suma, esta tese contribui para a compreensão da biologia da P. aeruginosa, tratamento 
antibacteriano e sua resistência, bem como compreender a influência do estado metabólico dos 
indivíduos na infecção. Este estudo teve como objectivo compreender os factores de resistência 
manifestados pela P.aeruginosa no sentido de desenvolver alternativas terapêuticas para este 
agente. Numa primeira fase foram caracterizados 72 isolados hospitalares de P. aeruginosa e 
91,67% manifestou resistência a mais do que 3 classes de Antimicrobianos. 
 
PALAVRAS-CHAVE: Pseudomonas aeruginosa; resistência a antibióticos; fagoterapia; 
infecção hospitalar. 
 
RUNNING TITTLE: Phagetherapies for infections caused by multi-resistant 
Pseudomonas aeruginosa. 
 
Summary 
The hospital infections can be prevented by controlling some factors related with 
staff, material, and environment. At this moment the existing legislation regulates 
procedures that prevent the propagation of the infection and/or of the agents that causes 
it. The Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative opportunistic responsible for the 
most of the hospital infections. Because it is opportunistic it is more frequent in 
imunocompromised patients, submitted to transplants, surgical interventions. In short, 
this thesis has contributed for the understanding of the biology of P. aeruginosa, 
antibacterial treatment and its resistance to this treatment by using efflux bombs, and so 
as establishing associations with others factors, such as biochemical. This study has the 
objective to understand the resistance factors used by the P. aeruginosa in order to 
develop alternative therapies for this agent. Initially, 72 hospitalar isolated were 
characterized and 91,67% have revealed more than 3 classes of Antimicrobians. 
 
Keywords: Pseudomonas aeruginosa; antibacterial resistance; phagetherapy; hospitalar 
infection. 
 
Índice 
RESUMO ...................................................................................................................................... 3 
Summary ....................................................................................................................................... 4 
Abreviaturas .................................................................................................................................. 7 
Listagem de antibacterianos .......................................................................................................... 9 
I. Introdução ........................................................................................................................... 11 
1.1. Patogenicidade ............................................................................................................ 12 
1.1.1. Sistemas de Efluxo .............................................................................................. 13 
1.1.1. Enzimas inactivadoras de Aminoglicosídeos ...................................................... 14 
1.1.2. Produção de β-lactâmicos .................................................................................... 15 
1.2. Infecção ....................................................................................................................... 15 
1.3. Controlo ....................................................................................................................... 16 
1.3.1. Antibioterapia ...................................................................................................... 17 
1.4. Novas terapêuticas....................................................................................................... 20 
1.4.1. Vacinação ............................................................................................................ 20 
1.4.2. Fagoterapia .......................................................................................................... 21 
1.4.3. Nanotecnologia .................................................................................................... 22 
1.5. Objectivos ................................................................................................................... 23 
2. Materiais e Métodos ............................................................................................................ 25 
2.1. Instrumentos e Químicos ............................................................................................. 26 
2.1.1. Instrumentos .............................................................................................................. 26 
2.1.2. Químicos e Kits ......................................................................................................... 26 
2.1.3. Bactéria e Plasmídeo ................................................................................................. 26 
2.2. Meios e Aditivos dos Meios ........................................................................................ 26 
2.2.1. Meio de Crescimento .......................................................................................... 26 
2.2.2. Aditivos dos Meios .............................................................................................. 27 
2.3. Preparação de DNA bacteriano ................................................................................... 27 
2.4. Técnicas Microbiológicas ........................................................................................... 27 
2.4.1. Esterilização ........................................................................................................ 27 
2.4.2. Condições Gerais de Crescimento ....................................................................... 27 
2.4.3. Armazenamento da Estirpe Bacteriana ............................................................... 28 
2.4.4. Transformação bacteriana ................................................................................... 28 
2.4.5. Teste da Nitrocefina ............................................................................................29 
2.4.6. Reacção PCR ....................................................................................................... 29 
2.4.7. Preparação do Gel de electroforese ..................................................................... 29 
2.5. População ........................................................................................................................ 30 
2.5.1. Métodos Estatísticos ............................................................................................ 30 
3. Resultados e Discussão ....................................................................................................... 33 
3.1. Resultados Estatísticos ................................................................................................ 34 
3.2. Resultados Laboratoriais ............................................................................................. 47 
3.2.1. Transformação bacteriana ................................................................................... 47 
3.2.2. Teste da Nitrocefina ............................................................................................ 47 
3.2.3. Reacção PCR ........................................................................................................... 48 
4. Discussão /Conclusão .......................................................................................................... 51 
5. Perpectivas Futuras ............................................................................................................. 55 
6. Bibliografia ......................................................................................................................... 59 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
7 
 
 
 
 
Abreviaturas 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
8 
 
GOD – glicose oxidase 
LPS – lipopolissacarídeo 
PCR – polimerase chain reaction 
PrCR - Proteína C reactiva 
POD – peroxidase 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
9 
 
 
 
 
Listagem de 
antibacterianos 
 
 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
10 
 
Antibacterianos β-lactâmicos 
 
Classes 
 
Amoxicilina + ácido clavulânico 
Penicilinas 
Ampicilina 
Ticarcilina 
Piperacilina 
Cefalotina (1.ª geração) 
Cefalosporinas 
Cefpodoxima (2.ª geração) 
Cefuroxima (2.ª geração) 
Cefoxitina (2.ª geração) 
Cefotaxima (3.ª geração) 
Ceftazidima (3.ª geração) 
Cefepima (4.ª geração) 
Aztreonam Monobactâmicos 
Meropenem 
Carbapenemos 
Imipenem 
Outros Antibacterianos Classes 
Levofloxacina 
Quinolonas Pefloxacina 
Ciprofloxacina 
Amicacina 
Aminoglicosídeos 
Gentamicina 
Tobramicina 
Isepamicina 
Nitrofurantoína Sulfonamidas 
Tigeciclina 
Tetraciclinas 
Minociclina 
Colistina Polimixinas 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
11 
 
 
 
 
I. Introdução 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
12 
 
A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa, aeróbia e baciliforme. É um 
agente patogénico oportunista, e quando associado à sua resistência inata a diversos 
antibacterianos e antissépticos tornam-na uma causa importante de infecções hospitalares, 
pertencendo aos 5 patogénios mais comuns em contexto hospitalar. A incidência de infecções a 
nível hospitalar exerce um impacto considerável sobre os quadros de mortalidade e morbilidade 
(Lo et al. 2009). 
1.1. Patogenicidade 
A P. aeruginosa está relacionada com muitas infecções e doenças em humanos 
maioritariamente em pacientes com o sistema imunológico comprometido. Pode causar 
infecções no tracto respiratório, urinário, no ouvido, olho e queimaduras. As infecções 
respiratórias causadas por P. aeruginosa estão associadas à fibrose cística causando a perda 
progressiva do funcionamento pulmonar até à sua total ineficiência (Tsakris et al.2009; Onguru 
et al. 2008; Hirsch et Tam 2011; Baumann et al 2009). 
Os mecanismos de resistência a antibacterianos (figura 1) são vários e incluem a 
aquisição de genes de resistência através de plasmídeos ou transposões que codificam enzimas 
capazes de alterar quimicamente o antibacteriano, a aquisição de genes de resistência 
codificadores de receptores alvo de antibacterianos alterando-os ou a aquisição de bombas de 
efluxo que transportam os antibacterianos para o exterior celular (Tam et al. 2010). 
Figura 1 - Mecanismos de Resistência: 1. Alteração da permeabilidade, 2. Destruição enzimática, 3. Alteração 
do local de acção e 4. Bomba de efluxo. As estrelas representam os antibacterianos, as setas o movimento do 
antibacteriano, o coração representa a bomba de efluxo, os quadrados os receptores do antibacteriano 
modificados e os círculos a forma que os receptores do antibacterianos deveriam apresentar. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
13 
 
A P. aeruginosa apresenta diversos dos mecanismos de resistência a antibacterianos 
mencionados. Os mecanismos mais relevantes são a diminuição da permeabilidade da 
membrana externa, a presença de bombas de efluxo, a bicamada assimétrica na membrana 
externa, a produção de enzimas que inactivam aminoglicosídeos e a produção de β-lactamases 
(Lauretti et al. 1999; Struble et Gill 2009; Tam et al. 2010). 
Para além da sua elevada versatilidade a adquirir nutrientes e de surgir em diferentes 
ambientes, a P. aeruginosa é também conhecida por ser um agente patogénico oportunista para 
plantas, animais e humanos apresentando o mesmo espectro de factores de virulência em todos 
os hospedeiros (Rahme et al., 1995). 
1.1.1. Sistemas de Efluxo 
A P. aeruginosa expressa cinco sistemas de bombas de efluxo diferentes (tabela 1) os 
quais promovem resistência a vários fármacos pela hiperexpressão de genes de efluxo,tais como 
MexAB-OprM e MexXY-OprM (Piddock, 2006; Poole, 2001). Para além destes,dois sistemas de 
efluxo adicionais, MexCD-OprJ e MexEF-OprN, promovem resistência adquirida resultante de 
uma hiperexpressão mutacional dos genes de efluxo (Poole, 2001). Actualmente sabe-se que 
esta resistência resulta da sinergia entre a impermeabilidade da membrana externa e as bombas 
de efluxo cromossomicamente codificadas do tipo RND-MFP-OMF (Poole, 2001; Fraud et 
Poole, 2010). 
Para além dos antibacterianos, estas bombas de efluxo (ver figura 2) exportam corantes, 
detergentes, inibidores, desinfectantes, solventes orgânicos, entre outras substâncias (Poole, 
2001). 
 
Figura 2 – Diagrama comparativo das cinco famílias de bombas de efluxo. 
Estas bombas de efluxo pertencem à família resistance nodulation devision (RND) e 
apresentam um sistema tripartido. São conduzidas pela força motora de um protão e consiste 
numa proteína de transporte localizada na membrana interna, uma proteína membranar externa e 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
14 
 
uma proteína de fusão membranar localizada no periplasma (Piddock, 2006; Poole, 2001; Fraud 
et Poole, 2010). 
Está demonstrado que o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa com 
antibacterianos conduz a mutações no gene mexR (Ziha-Zarifi et al., 1999). 
Tabela 1 - Sistemas de efluxo da P. aeruginosa. 
Organismo 
Componentes de efluxo Genes 
reguladores 
Substratos 
P. aeruginosa 
MFP RND OEP 
MexA MexB OprM mexR 
Violeta cristal; Dodecilsulfato 
de sódio; Hidrocarbonetos 
aromáticos; Β-lactâmicos; 
Fluoroquinolonas; 
Cloranfenicol; Tetraciclina; 
Tiolactomicina; Trimetoprim; 
Sulfonamidas; Triclosan; 
Macrólidos; Irgasan;Brometo 
de estídio; entre outros. 
MexC MexD OprJ nfxB 
Tetraciclina; Β-lactâmicos; 
Cloranfenicol; Macrólidos; 
Trimetoprim; Violeta cristal; 
Brometo de etídio; Triclosan; 
Dodecilsulfato de sódio; 
Hidrocarbonetos aromáticos; 
entre outros. 
MexE MexF OprN mexT 
Fluoroquinolonas; 
Cloranfenicol; Trimetoprim; 
Hidrocarbonetos aromáticos; 
Triclosan; entre outros. 
MexX MexY OprM AmrR 
Fluoroquinolonas; 
Aminoglicosídeos; Tetraciclina; 
Eritromicina; entre outros. 
Fonte: Adaptado de Poole, 2001. 
1.1.1. Enzimas inactivadoras de Aminoglicosídeos 
A produção de enzimas que alteram/inactivam os aminoglicosídeos varia conforme a 
espécie e a estirpe bacteriana, sendo que um mesmo microrganismo pode produzir diferentes 
enzimas. As alterações causadas ocorrem em diferentes locais das moléculas de 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
15 
 
aminoglicosídeos quer através de acetilação, quer por fosforilação e/ou adenilação (Mingeot-
Leclerq et al., 1999). 
Existem 19 tipos de enzimas inactivadoras de aminoglicosídeos, agrupadas em três 
grupos, fosfotransferases, adeniltransferase e acetiltransferase. As fosfotransferases podem ser a 
6-fosfotransferase e a 3’-fosfotransferase, as quais modificam a neomicina e a canamicina 
tornando a P. aeruginosa resistente naturalmente a estes aminoglicosídeos Das 
acetiltransferases, a 3-acetiltransferase e a 2-adenilase,modificam a gentamicina e a 
tobramicina. A produção de 6’-acetiltransferase confere resistência também à amicacina 
(Mingeot-Leclerq et al., 1999). 
1.1.2. Produção de β-lactâmicos 
Todas as bactérias P. aeruginosa são produtoras constitutivas, em níveis baixos, de β-
lactamase da Classe C de Ambler, AmpC. A indução desta enzima ocorre por antibacterinanos 
β-lactâmicos, como a ampicilina e as cefalosporinas de 1.ª e 2.ª geração, os quais são 
considerados fortes indutores, sendo hidrolisados por ela. Os carbapenemos são fortes indutores 
da repressão do gene destas enzimas, sendo o meropenem mais estável que o imipenem à acção 
desta enzima (Livermore, 1992). 
As β-lactamases de largo espectro sintetizadas pela P. aeruginosa pertencem às classes 
A, B e D de Ambler (Nordmann, et al., 1993). 
A hiperprodução de -lactamases da classe C, AmpC, confere resistência a todas as 
cefalosporinas, excepto as de 4.ª geração, e ao aztreonam, assim como as β-lactamases de largo 
espectro da classe A, ESBL, que conferem resistência às Cefalosporinas de 3.ª e 4.ª geração e ao 
aztreonam e, mais recentemente, a produção de carbapenases ou metalo- -lactamases, as quais 
destroem os carbapenemos (Gales et al., 2003). 
A P. aeruginosa é intrinsecamente resistente ao cloranfenicol, a tetraciclinas e a 
algumas quinolonas e β-lactâmicos (Lauretti et al. 1999; Hirakawa et al. 2010). 
1.2. Infecção 
A P. aeruginosa é uma bactéria responsável por um grande número de infecções 
associadas aos cuidados de saúde e por muitas mortes a nível mundial por ano (Onguru et al. 
2008). 
As infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa (tabela 2) afectam na sua maioria 
a função pulmonar, seguida da urinária e das feridas e tecidos moles. As menos frequentes são 
as infecções por septicemia, mas também são as mais graves (Tsakris et al. 2009; Ding et al. 
2009; Onguru et al. 2008; Hirsch et Tam 2011). 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
16 
 
Para além do facto desta bactéria ser resistente intrinsecamente a alguns antibacterianos, 
a prescrição de antibacterianos, a utilização destes em animais dos quais nos alimentamos e o 
acesso não controlado a estes, são outros factores causadores de resistência bacteriana. A 
utilização de anti-sépticos também poderá ser uma das causas para este aumento. 
Tabela 2 - Prevalência das Infecções Hospitalares por P. aeruginosa desde 2001 até 2010. 
PREVALÊNCIA DAS INFECÇÕES HOSPITALARES POR P.aeruginosa 
 2001 e 2002 2007 
Infecção da pele e tecidos moles Sem dados 9% 9,5% 
Infecção Urinária Sem dados 30% 19% 
Infecção Pulmonar 61% 42% 33,3% 
Septicémia 6% 6% 9,5% 
Infecção Gastrointestinal Sem dados 0% 14,3% 
Adaptado de Pina et al 2009. 
 
Entre 2007 e 2010 houve um aumento de infecções hospitalares na área médica, na área 
cirúrgica e nos cuidados intensivos. Na tabela 3 é possível ver a distribuição das Infecções 
Hospitalares por P. aeruginosa pelas áreas hospitalares. 
Tabela 3 - Prevalência das infecções hospitalares por P. aeruginosa segundo os serviços hospitalares de 2007 a 
2010. 
PREVALÊNCIA DAS INFECÇÕES HOSPITALARES POR P. aeruginosa SEGUNDO OS 
SERVIÇOS HOSPITALARES 
 2007 2010 
Área Médica 10,1% 12,9% 
Área Cirúrgica 6,3% 7,7% 
Cuidados Intensivos 23,0% 26,7% 
Adaptado de Pina et al 2009. 
1.3. Controlo 
O controlo de infecções bacterianas no contexto hospitalar depende da 
consciencialização dos profissionais de saúde para a importância deste na prevenção. Para além 
das regras básicas de higiene e esterilização de materiais e salas, os anti-sépticos e os 
antibacterianos também são utilizados no controlo das infecções bacterianas causadas por P. 
aeruginosa. Existe uma necessidade urgente de desenvolver meios alternativos de prevenção e 
controlo de infecções clínicas associadas a este bactéria (Lo et al 2009; Baumann et al 2009). 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
17 
 
1.3.1. Antibioterapia 
Uma das formas de combater esta bactéria é ter conhecimento da sua susceptibilidade a 
antibacterianos e das suas características genéticas. Os antibacterianos mais utilizados no 
tratamento de P. aeruginosa são as penicilinas como a piperacilina, as cefalosporinas tais como 
a ceftazidima e a cefepima, os carbepenémicos como o imipenem e o meropenem, os 
monobactâmicos tais como o aztreonam, os aminoglicosídeos, como por exemplo a 
gentamicina, a tobramicina e a amicacina e as fluoroquinolonas como a ciprofloxacina 
(Hirakawa et al. 2010; Onguru et al. 2008; Tam et al. 2010; Lo et al 2009). 
1.3.1.1. Penicilinas 
Tendo em conta a resistência à acidez gástrica e às β-lactamases, bem como o seu 
espectro de acção, as penicilinas encontram-se divididas em benzilpenicilina e 
fenoximetilpenicilina, aminopenicilinas, isoxazolilpenicilinas, carboxipenicilinas e 
ureidopenicilinas (Freeman et Wilcox, 2001; Khaleghi et al., 2011; Ellison, 2009; Kurochkina et 
al., 2011; Verdon et Couedor, 1998; Manuel, J et al., 2010). A estrutura geral encontra-se 
ilustrada na figura 3. 
 
Figura 3 – Estrutura do anel β-lactâmico e da penicilina. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
18 
 
1.3.1.2. Cefalosporinas 
A classificação das cefalosporinas inclui actualmente 4 grupos distribuídos de acordo 
com o seu espectro de actividade (tabela 4). As cefalosporinas são por isso divididas em 
cefalosporinas de 1.ª, 2.ª, 3.ª ou 4.ª gerações. 
Tabela 4 – Tabela resumo do agrupamento das cefalosporinas por gerações. 
Cefalosporinas de 1.ª geração Cefalotina 
Cefalosporinas de 2.ª geração Cefuroxima, Cefpodoxima, Cefoxitina 
Cefalosporinas de 3.ª geração Cefotaxima, Ceftazidima 
Cefalosporinas de 4.ª geração Cefepima 
 
As cefalosporinas de 1.ª geração apresentam um espectro de acção semelhante ao das 
aminopenicilinas, boa actividade contra bactérias gram-positivas, e apresentam maior 
resistência à hidrólise pelas β-lactamases (Quintiliani et al., 1982). 
As cefalosporinas de 2.ª geração quando comparadas com as de 1.ª geração,apresentam 
menos actividade contra gram-positivas mas têm maior actividade contra gram-negativas 
(Quintiliani et al., 1982). 
 As cefalosporinas de 3.ª geração apresentam um espectro de acção ainda mais alargado 
no que respeita às bactérias gram-negativas, uma vez que são mais resistentes à hidrólise por β-
lactamases (Zhao et al., 2007) 
Posteriormente descobriram outras cefalosporinas consideradas de 4.ª geração 
(Petrikkos et al., 2007). A estrutura geral das cefalosporinas encontra-se ilustrada na figura 4. 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – Estrutura geral das cefalosporinas. 
1.3.1.3. Carbapenemos 
Estes apresentam um largo espectro de acção, quer sobre a maior parte das bactérias 
gram-positivas, excepto sobre estafilococos meticilina-resistentes, quer sobre as gram-negativas, 
incluindo Pseudomonas spp., aeróbias e anaeróbias. O primeiro carbapenemo disponível foi o 
imipenem (Cook et al., 2011). A sua estrutura geral encontra-se na figura 5. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
19 
 
 
Figura 5 – Estrutura geral dos carbapenemos. 
1.3.1.4. Monobactamos 
O único antibacteriano deste grupo disponível na terapêutica é o aztreonam, o qual é o 
primeiro β-lactâmico com acção exclusiva contra gram-negativas aeróbias (Honderlick, P, 
2007). A sua estrutura geral encontra-se descrita na figura 6. 
 
 
 
 
 
Figura 6 – Estrutura geral dos monobactamos. 
1.3.1.5. Amiglicosídeos 
Estes são antibacterianos bactericidas tendo actividade contra gram-negativas aeróbias e 
contra Staphylococcus aureus. Não são absorvidos por via oral e apresentam oto e 
nefrotoxicidade. 
A estrutura química da estreptomicina encontra-se ilustrada na figura 7. 
 
Figura 7 – Estrutura química da estreptomicina. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
20 
 
1.3.1.6. Fluoroquinolonas 
O protótipo deste grupo de antibacterianos é o ácido nalidíxico. O seu espectro de acção 
engloba sobretudo gram-negativas. 
A ciprofloxacina é considerada a de maior actividade antimicrobiana intrínseca. 
O rápido aparecimento de resistências a este grupo, nomeadamente por Pseudomonas, 
tende a reduzir-lhe as potencialidades iniciais (Cook et al., 20011). 
Na figura 8 encontra-se representada a sua estrutura química. 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.4. Novas terapêuticas 
A utilização repetida de antibacterianos sem prescrição e sem controlo torna mais 
frequente a ocorrência de bactérias multi-resistentes. Alternativas à antibioterapia incluem, entre 
outras, a fagoterapia, a vacinação e a nanotecnologia que poderão ser valiosas ferramentas no 
caso de deixarem de existir antibacterianos capazes de controlar a infecção por P. aeruginosa 
(Lo et al 2009; Baumann et al 2009; Kropinski 2006). 
1.4.1. Vacinação 
As proteínas encontradas na membrana externa da P. aeruginosa, denominadas de 
OMP, outer membrane proteins, no flagelo e, mais recentemente, no transporte de proteínas 
envolvidas na secreção pela P. aeruginosa são de grande interesse. Todas estas proteínas, que 
apresentam potencial para serem eficazes no estímulo de anticorpos para a vacina, estão ainda 
em estudo (Baumann et al 2007; Scarff et Goldberg 2008). 
Figura 8 – Estrutura química das fluoroquinolonas 
geral e específicas. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
21 
 
Outro ponto de partida para a vacinação é o lipopolissacarídeo, ou LPS. Este é 
conhecido por apresentar uma grande força atractiva entre o LPS e os anticorpos, os quais serão 
capazes de causar a destruição da célula bacteriana (Baumann et al 2007; Scarff et Goldberg 
2008). 
Estudos realizados mostraram o retardamento de infecções pulmonares, como a Fibrose 
cística, causadas por P. aeruginosa (Baumann et al 2007; Scarff et Goldberg 2008). 
1.4.2. Fagoterapia 
Um dos métodos alternativos disponíveis à antibioterapia é a fagoterapia (Kropinski 
2006; Sulakvelidz 2001). 
Com os conhecimentos actuais sobre bacteriófagos e com o aparecimento de resistência 
bacteriana a antibacterianos, a fagoterapia voltou a ser pesquisada e vista como terapêutica 
alternativa plausível e/ou como um suplemento à antibioterapia (Kropinski 2006; Sulakvelidz 
2001). 
A fagoterapia envolve o uso de bacteriófagos, ou fagos, no combate a infecções 
bacterianas. Estes são vírus bacterianos e desde muito cedo que são utilizados como terapêutica 
de substituição à antibioterapia. Esta terapêutica foi abandonada, inicialmente, por falta de 
conhecimentos sobre os fagos. Outros factores foram a utilização indiscriminada destes por 
caracterizar e em concentrações desconhecidas, assim como, a aplicação de um qualquer fago a 
uma qualquer estirpe bacteriana (inespecíficos). Estes foram os principais motivos para o 
abandono da fagoterapia (Kropinski 2006; Sulakvelidz 2001). 
A sua estrutura encontra-se ilustrada na figura 9. 
Cabeça 
Pescoço 
Cauda 
Fibras da cauda 
DNA 
Figura 9 – Estrutura do bacteriófago. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
22 
 
Os fagos são vantajosos pois apresentam uma elevada especificidade bacteriana e não 
toxicidade para animais e plantas. Estes podem ser encontrados o solo e na água em maior 
quantidade do que as bactérias (Kropinski 2006; Sulakvelidz 2001). 
1.4.3. Nanotecnologia 
Uma das grandes dificuldades do tratamento farmacológico é o excesso de 
medicamentos utilizados. Quando administramos um antibacteriano para o tratamento de uma 
qualquer infecção estamos a dar doses elevadas deste a células/tecidos/órgãos saudáveis do 
nosso organismo, causando, muitas vezes, intoxicação por medicamentos (Taylor et Webster 
2011). 
A nanotecnologia trouxe uma nova visão do tratamento farmacológico. Esta está a 
estudar formas de produzir e administrar fármacos de dimensões nanométricas, a partir de 
soluções com princípios activos de um antibacteriano e um anti-inflamatório, por exemplo 
(Taylor et Webster 2011). 
 Através de fenómenos físicos, químicos e biológicos e de estruturas com dimensões na 
ordem de um bilionésimo do metro, i.e., o comprimento equivalente a 10 átomos de hidrogénio 
alinhados, transportam as substâncias com acção farmacológica até às células lesadas. Estas 
nanopartículas são lipossomas, nanocarregadores, fosfolípidos ou polímeros biodegradáveis, 
i.e., substâncias biológicas capazes de serem assimiladas pelo organismo humano (Taylor et 
Webster 2011). 
 A sua manipulação decorre num Spray dryer ou Spray drying nano, onde as substâncias 
são transformadas em gotas e “embaladas” em nanocápsulas de diversos tamanhos. Depois disto 
podem ser injectadas na corrente sanguínea, aplicadas na pele, feridas, mucosas, ou via oral. As 
nanopartículas do fármaco atravessam a membrana celular das células lesionadas por forças de 
atracção molecular. A libertação do fármaco ocorre de forma mais concentrada nas células 
lesionadas, não atingindo as células sãs (Taylor et Webster 2011). 
 Os nanofármacos, para além de injectados, também podem ser administrados sob a 
forma de pomada, suspensão oral ou comprimidos (Taylor et Webster 2011). 
 A utilização desta terapia visa evitar os efeitos colaterais causados pela maior parte dos 
fármacos, principalmente em situações oncológicas (Taylor et Webster 2011). 
 Os nanoveículos podem ser micropartículas do polímero de quitosano, substância 
biodegradável derivada dos crustáceos, para administração oral. Os fármacos elaborados com 
esta substância são melhor tolerados pelo sistema gastrointestinal quando comparados com um 
comprimido tradicional. Outro veículo possível e ainda em estudo, são as nanopartículas 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosamultirresistentes 
23 
 
lipídicas, similares às membranas celulares humanas, extraídas da soja e do ovo. Estes 
lipossomas são utilizados para encapsular e transportar vários fármacos em doses bastante 
inferiores às utilizadas na actualidade (Taylor et Webster 2011). 
1.5. Objectivos 
Compreender na população portuguesa a importância do aumento crescente de 
resistência a antibacterianos pela P. aeruginosa no contexto da saúde pública no sentido de 
desenvolver uma estratégia terapêutica que não recorra ao uso de medicamentos antibióticos. A 
moderna biotecnologia apresenta diversas estratégias ao uso de antibióticos. Pretende-se neste 
estudo, desenvolver uma terapia com recurso a fagos da P. aeruginosa. Na primeira parte do 
estudo, transformou-se uma P. aeruginosa com um gene da GFP. A segunda parte do trabalho 
teve como objectivo desenvolver uma fórmula terapêutica com um fago da P. aeruginosa. 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
24 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
25 
 
 
 
 
2. Materiais e Métodos 
 
 
 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
26 
 
2.1. Instrumentos e Químicos 
2.1.1. Instrumentos 
Os instrumentos utilizados ao longo do estudo laboratorial foram Ansas descartáveis, 
Autoclave (Uniclave 88 AJC), Balança (KERN and Sohn GmbH), Banho de gelo, Banho-
maria (FALC), Cartuchos perfuráveis (Campingaz C206), Cronómetro (NOKIA), Eppendorfs, 
Espátulas metálicas, Estufa (Binder), Hote (F. S. Móvel), Lâmpada UV/transiluminador 
(VILBER LOURMAT 215-LC/ECX 15-M), Micropipetas P10, P100 e P1000 (SOCOREX), 
Pipetas de Pasteur, Placas de petri, Pontas para micropipetas P10, P100 e P1000 (lab box), 
Soldador de Laboratório (Campingaz Labogaz 470), Tubos de ensaio (SCHOIT GL18) e Vidros 
de relógio. 
2.1.2. Químicos e Kits 
Os químicos e kits utilizados foram o Agar granulado (DIFCO), 25mg/mL Ampicilina 
(AMP), o Cloreto de sódio (Carlo ERBa), o extracto de levedura (OXOID), a L(+)Arabinose a 
100mM (BioRAD), a Solução de transformação a 50 mM CaCl2 e pH 6,1 (BioRAD) a Triptona 
(Sigma). 
2.1.3. Bactéria e Plasmídeo 
Relativamentes à Bactéria e Plasmídeo utilizados são P. aeruginosa estirpe DSM 
19880 (Innophage) e pGLO (BioRAD), respectivamente. 
2.2. Meios e Aditivos dos Meios 
2.2.1. Meio de Crescimento 
O meio Luria-Bertani (LB) foi usado como meio complexo standard para o crescimento 
de P. aeruginosa. A composição é baseada no protocolo de Sambrook (1989) e consiste em 1% 
(m/v) triptona, 0,5% (m/v) extracto de levedura e 0,5 % (m/v) NaCl, em água desionizada. 
Para as placas de meio sólido adicionou-se 15 g/L de agar ao meio. 
O meio selectivo para P. aeruginosa foi usado como meio ideal para o crescimento 
isolado esta bactéria. A sua composição é baseada no meio selectivo com cetrimida e consiste 
em Peptona 4g, Sulfato de Potássio 2,5g, Cloreto de Magnésio 0,28g, Cetrimida 12g e Agar 
3g, em água desionizada. 
A Peptona serve como fonte de Azoto. A produção de piocianina é estimulada pelo 
cloreto de magnésio e pelo sulfato de potássio presentes no meio. A Cetrimida (brometo de 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
27 
 
cetilmetilamina) é um composto amónio quaternário, que inibe uma vasta variedade de outros 
organismos, incluindo outras espécies de Pseudomonas spp. e organismos relacionados. 
2.2.2. Aditivos dos Meios 
Foram utilizadas soluções stock concentradas de aditivos aos meios tais como 
Arabinose a 100mM e Ampicilina a 25mg/mL, entre outros antibacterianos, em condições de 
assepsia. 
2.3. Preparação de DNA bacteriano 
Na preparação de DNA bacteriano para análise por PCR colhe-se uma colónia isolada e 
ressuspende-se em 1mL de água autoclavada num tubo micro. De seguida, vai à centrífuga 
durante 1 minuto a 10,000 – 12,000 rpm e remove-se o sobrenadante. Depois são adicionados 
200µL de matriz InstaGene ao pellet e coloca-se a incubar a 56 Cᴼ durante 15 – 30 minutos. 
É importante que a matriz INSTAGENE deve ser misturada a velocidade moderada num 
misturador magnético para manter a matriz em suspensão. A pipeta utilizada deve ser de grande 
tamanho, como por exemplo 1000 µL 
No vortex a elevada velocidade por 10 segundos, coloca-se o pellet recolhido. O tubo é 
colocado numa placa de aquecimento a 100 Cᴼ ou em banho-maria durante 8 minutos. De 
seguida usa-se o vortex novamente a elevada velocidade durante10 segundos e roda-se a 
10,000-12,000 rotações por segundo durante 2-3 minutos. No final usam-se 20µL do 
sobrenadante resultante por 50µL de reacção de PCR. O sobrenadante restante é armazenado a 
20 Cᴼ. 
Aquando da reutilização da preparação de DNA, repete-se o 5.º passo. 
É importante que a amostra preparada seja armazenada a -20ºC. 
2.4. Técnicas Microbiológicas 
2.4.1. Esterilização 
Todos os meios e materiais a utilizar, não termolábeis, foram autoclavados a 121 Cᴼ e a 
uma pressão de 1 bar positivo durante 20minutos. 
2.4.2. Condições Gerais de Crescimento 
Todas as culturas bacterianas foram incubadas a 37 Cᴼ em estufa. O tempo de 
incubação dependeu da técnica usada e é indicado nesta. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
28 
 
2.4.3. Armazenamento da Estirpe Bacteriana 
A estirpe de P. aeruginosa utilizada foi preparada para um armazenamento a longo 
prazo por congelamento. Para tal retirou-se uma colónia de bactérias crescidas em placa com 
meio e molhou-se a ansa no líquido do frasco de congelamento. Reservam-se os frascos bem 
fechados no congelador a -20 Cᴼ. 
2.4.4. Transformação bacteriana 
A transformação bacteriana começa pela preparação do meio para crescimento 
bacteriano e distribuição deste em placas, reservando metade, e guardando em estufa a 55 Cᴼ. 
Ao meio restante, adicionar a ampicilina de forma a obter uma concentração final de 100µg/mL 
e a L-arabinose até uma concentração final de 6mg/mL. As placas são armazenadas no 
frigorífico até usar (no máximo 3 dias). Na véspera, descongela-se a P. aeruginosa e semeia-se 
no meio, deixando a incubar a 35-37 Cᴼ durante a noite. 
Para 2 microtubos limpos e estéreis e em condições de assépsia tranferem-se 250µL de 
solução de tranformação (CaCl2) com a micropipeta P1000 e uma ponta estéril e colocam-se em 
gelo. Com uma ansa estéril, em condições de assepsia, retira-se uma única colónia bacteriana e 
coloca-se no microtubo e rodando a ansa para a esquerda e para a direita até que a colónia se 
dissolva no meio de transformação e repete-se o processo para o segundo microtubo, terceiro e 
quarto. Observa-se o plasmídeo na luz UV. Com a micropipeta P10 e uma ponta estéril pipetam-
se 10µL de plasmídeo (0,08µg/µL) e coloca-se sem agitar nos microtubos colocando novamente 
no gelo. Deixam-se os microtubos a incubar em gelo durante 10-15minutos. Passados os 10/15 
minutos, exerce-se um choque térmico a 42 Cᴼ durante rigorosamente 50 segundos, findos os 
quais se colocam de novo os microtubos em gelo. Em condições de assepsia abrem-se os 
microtubos e transfere-se com a ponta P1000 250µL de meio líquido para cada um deles, 
usando em cada pipetagem uma nova ponta. Trocando sempre de ponta em cada pipetagem, 
transferem-se 100µL com a micropipeta P100 dos microtubos para cada uma das placas. Com 
uma ansa estéril espalham-se as gotas na superfície de cada placa. Selam-se com parafilme e 
colocam-se na estufa a 37 Cᴼ. Passadas 24 horas analisa-se cada placa no transiluminador. 
Se fluorescente, está presente o plasmídeo que confere resistência, caso contrário, este 
está ausente. 
Este processo foi sofrendo alterações ao protocolo inicial ao longo do estudo paraoptimizar as condições. Utilizaram-se também meios diferentes tais como com ampicilina e 
arabinose, sem fonte de carbono para além da arabinose, e enriquecendo-o em sais minerais, ou 
seja, água, agar, muito pouco extracto de levedura, ampicilina e arabinose. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
29 
 
2.4.5. Teste da Nitrocefina 
Usando uma pinça esterilizada, remove-se um disco com nitrocefina do frasco e coloca-se 
numa caixa de petri vazia. De imediato guardam-se os restantes discos no frigorífico a - 10 Cᴼ. 
Retira-se uma colónia isolada com uma zaragatoa ou com uma ansa esterilizadas e espalha-
se na superfície do disco. 
Observa-se o disco inoculado até mostrar alteração da sua cor. 
Aguardam-se 5 minutos. 
Caso o resultado seja positivo há alteração da cor, caso contrário mantém-se da mesma cor. 
2.4.6. Reacção PCR 
Usando a amostra de DNA extraído da bactéria em estudo leva-se ao vortex a 
velocidade elevada por 10 segundos e rotação a 10 000 – 12 000 rpm por 2-3minutos. 
O mastermix é preparado através do descongelamento dos stocks, mantendo-os sempre 
no frio, pipetam-se 72,5µL de água num eppendorf normal. De seguida, pipetam-se 12,5µL de 
buffer 10x, sem MgCl2, 3,75µL de MgCl2, 2,5µL de dNTP’s, 1,25µL de cada primer (GFP – R; 
GFP – F), 1,25µL de Taq lentamente por causa da sua viscosidade. Agita-se a mistura 
gentilmente com a ponta do dedo indicador. 
Depois pipetam-se 20µL do mastermix para 4 microtubos de PCR e a cada microtubo 
adicionam-se 5µL do DNA extraído de P. aeruginosa. O termociclador é programado para os 
ciclos de 1 vez a 94ºC durante 2 minutos, de 30 vezes a 94ºC durante 40 segundos, a 52ºC 
durante 45 segundos e a 72ºC durante 1minuto e meio e no último ciclo 1vez a 4ºC por tempo 
indeterminado. 
2.4.7. Preparação do Gel de electroforese 
A composição do gel de electroforese, para 100mL, consiste em 0,8g de agarose e 
100mL de TAE 1x. Para a preparação do TAE 1x é utilizada uma relação de 50miliLitros para 
1Litro (50mL : 1L). Depois de tudo pesado e medido vai a fundir ao microondas até 
homogeneizar (aproximadamente 1 minuto e 10 segundos) na potência máxima. Deixa-se 
arrefecer (morno) e prepara-se o suporte de gel. Acrescentam-se 4µL de Brometo de etídeo ou 
cyber green (10mg/mL) e mistura-se com agitação leve. Verte-se a solução de gel no suporte 
sem que faça bolhas. Coloca-se o pente da espessura desejada no suporte (ter em atenção o nº e 
o volume das amostras na escolha do pente mais adequado). Deixa-se que a solução solidifique. 
Coloca-se o suporte com o gel na cuba de electroforese e adiciona-se o tampão TAE 1x até 
cobrir a superfície do gel. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
30 
 
2.5. População 
De forma a estimar a prevalência de infecções resistentes por P. aeruginosa 
seleccionou-se a população em estudo segundo o diagrama a seguir representado: 
 
Pretende-se elaborar um estudo sobre toda a população de pacientes com infecções 
causadas por P. aeruginosa nos hospitais de Portugal. O ideal seria ter acesso aos últimos dados 
bacteriológicos/antibiograma e bioquímicos dos pacientes com infecção hospitalar causada por 
P. aeruginosa. Para um melhor estudo seria necessário aumentar o N populacional de modo a 
poder extrapolar para o universo. Extender-se-ia esta pesquisa aos hospitais de todo o país e 
aumentar-se-ia a informação colectada quer no exame bacteriológico/antibiograma, quer nos 
exames bioquímicos. 
A população de pacientes em análise pertence a um determinado hospital da região 
Norte de Portugal, e consiste em 72 pacientes com infecção causada por Pseudomonas 
aeruginosa multirresistente. 
Visto tratar-se de uma população não foram realizados quaisquer testes probabilísticos e 
apenas se recorreu à estatística descritiva. 
2.5.1. Métodos Estatísticos 
Os dados bioquímicos e bacteriológicos/antibiograma obtidos num determinado hospital 
da região Norte foram introduzidos no programa Portable IBM SPSS Statistics v19 para serem 
posteriormente tratados e analisados. O Microsoft Office Excel 2007 serviu de apoio. 
Hospital 
Todos os doentes 
infectados por P. 
aeruginosa 
(N=72) 
Todos os resistentes 
Todos os sensíveis 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
31 
 
2.5.1.1.1. Testes laboratoriais 
De acordo com as últimas recomendações do CLSI (Clinical Laboratory Standard 
Institute). 
 A dosagem de Glicose envolve a glicose oxidase (GOD), a qual catalisa a oxidação da 
glicose a ácido glicónico e peróxido de hidrogénio. Através de uma reacção oxidativa de 
acoplamento catalisada pela peroxidase (POD), o peróxido de hidrogénio formado reage com a 
4-aminoantipirina e fenol, formando um complexo de côr vermelha (quinoneimina), cuja 
absorvância medida em 500 nm, é directamente proporcional à concentração de glicose na 
amostra. 
2221/2cos OHGlicónicoÁcidoOHeGli
GOD
 
OHaQuinoneiFenolaoantipirinaOH POD 222 4minmin42 
 A dosagem da Proteína C reactiva (PrCR) é normalmente utilizada para determinar a 
presença/ausência de inflamação. O sangue recolhido num tubo separador de soro é analisado 
laboratorialmente. Existem diversos métodos de determinação de PrCR, tais como ELISA, 
imunoturbidimetria, imunodifusão rápida e aglutinação visual. Para a determinação de PrCR de 
alta sensibilidade a nefelometria é utilizada muitas vezes. Este teste apresenta resultados em 25 
minutos com uma sensibilidade de 0,04mg/L. 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
32 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
33 
 
 
 
 
3. Resultados e Discussão 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
34 
 
3.1. Resultados Estatísticos 
Foram analisados 72 relatórios bacteriológicos/antibiograma e bioquímicos de pacientes 
de um determinado hospital da região Norte de Portugal. Da análise estatística realizada, 
relativamente às idades dos pacientes, a idade mínima é de 1 ano e meio e a máxima de 95 anos. 
As idades mais frequentes entre os pacientes são de 78 e 88 anos (6,97%). Pela medida de 
assimetria é possível verificar que existe um grupo pequeno com valores muito pequenos, i.e., a 
idade dos pacientes internados é maioritariamente acima dos 68 anos (ver tabela 4 e gráfico 1). 
A diferença entre o Percentil 75 e 25 descreve a variação dos dados, assim 
sendo, temos o âmbito das idades de 28,75. Segundo a medida de assimetria, a qual é 
negativa, temos que esta distribuição é assimétrica, estando perante uma assimetria 
negativa, na qual . 
Relativamente à mediana, estamos perante um valor estatisticamente 
significativo. A mediana é uma medida de tendência central que caracteriza as 
observações de uma determinada variável de tal forma que o seu valor separa a metade 
inferior da amostra, da metade superior, i.e., metade dos pacientes têm idades iguais ou 
inferiores a 78,5 anos e a outra metade tem idades superiores ou iguais à mediana. 
O paciente mais novo tem 1,5 anos e o paciente mais velho tem 95 anos de 
idade. 
Tabela 5 - Estatística Descritiva sobre a idade dos pacientes internados. 
Idade 
N 72 
Média 68,113 
Mediana 78,500 
Moda 
78,0 
88,0 
Desvio Padrão 26,4339 
Medida de Assimetria 
(grupo pequeno com valores muito pequenos) 
-1,292 
Desvio padrão da Medida de Assimetria 0,283 
Mínimo 1,5 
Máximo 95,0 
Percentis 
25 58,000 
50 78,500 
75 86,750 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
35 
 
Relativamente ao sexo traçou-se um gráfico de barras de forma a caracterizar 
essa variável segundo a idade dos pacientes (vergráfico 1), sendo que 59,7% dos 
pacientes são do sexo feminino e 40,3 % do sexo masculino. A idade foi agrupada 
segundo seis grupos do seguinte modo [0,15]; ]15,30]; ]30,45]; ]45,60]; ]60,75]; >75. 
Nas idades mais baixas existem somente pacientes do sexo feminino e o mesmo 
acontece relativamente ao sexo masculino entre os 45 e os 60 anos. Dos 15 aos 30, dos 
30 aos 45 e nos pacientes com mais de 75 anos existe um predomínio do sexo feminino 
sobre o masculino. No grupo dos 60 aos 75 anos existe o mesmo número de homens e 
de mulheres (ver gráfico1). 
 
Gráfico 1 – Distribuição da idade por grupos de faixas etárias segundo o sexo dos pacientes. 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
36 
 
 A caracterização da população segundo a glicose encontra-se descrita no gráfico 
2. Na população de 72 pacientes, 73,61% é não diabético e 26,39% é diabético. 
 
Gráfico 2 – Frequência de pacientes diabéticos e não diabéticos. 
O Serviço com maior número de pacientes internados é a Unidade de Medicina Adultos 
(27,78%), segue-se o Internamento Medicina (25,00%) e o terceiro serviço com mais pacientes 
é o de Medicina (piso 5) (13,89%) (ver gráfico 3). 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
37 
 
 
Gráfico 3 – Distribuição dos pacientes por serviço hospitalar. 
Relativamente aos locais de infecção, a amostra é constituída por 72 pacientes, 9 
(12,5%) têm Infecções nos tecidos moles, 22 (30,6%) apresentam Infecções urinárias, 3 
(4,2%) têm Septicémia e 38 (52,8%) apresentam Infecções do tracto respiratório (Mo = 4) 
(ver tabelas 6 e 7 e Gráfico 4). 
Tabela 6 – Estatísticas Descritivas dos Locais de Infecção. 
Estatísticas 
N 72 
Moda 4,00 
Tabela 7 – Locais de Infecção – Frequências Absoluta e Relativa. 
 Frequência Frequência Relativa 
 Feridas/Infecções Tecidos Moles 9 12,5% 
Urina/Infecções Urinárias 22 30,6% 
Sangue/Septicémias 3 4,2% 
Infecções Tracto Respiratório 38 52,8% 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
38 
 
 
Gráfico 4 – Locais de Infecção e sua frequência. 
Consideremos duas variáveis contínuas, a idade dos pacientes e o valor de 
glicose. Pretendemos ver como a variação da idade poderá influenciar o valor de glicose 
no sangue (ver gráfico 5). 
 
Gráfico 5 – Glicose (mg/dL) vs Idade (anos). 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
39 
 
Em 72 pacientes, 41 (56,9%) não são diabéticos, dos quais 16 são do sexo 
masculino e 25 do sexo feminino, e 31 (43,1%) são diabéticos, dos quais 13 são do sexo 
masculino e 18 do sexo feminino (Mo = sexo feminino) (ver tabelas 8 e 9). 
Tabela 8 – Estatística descritiva. 
Estatísticas 
N 72 
Moda Sexo feminino 
Tabela 9 – Frequência, percentagem. 
 Frequência Frequência Relativa 
 Glicose<=90 41 56,9% 
Glicose > 90,1 31 43,1% 
 Num total de 46 pacientes nos quais foi testada a Amoxicilina + Ácido 
Clavulânico, 45 apresentaram resistência a estes, enquanto somente 1 paciente 
evidenciou sensibilidade. Dos 45 resistentes 24 eram não diabéticos e 21 eram 
diabéticos. 
Para a Amicacina, em 45 pacientes nos quais foi usada no antibiograma, 40 
apresentaram sensibilidade a esta, enquanto apenas 5 mostraram resistência a esta. Dos 
40, 24 eram não diabéticos e 16 diabéticos. Dos 5 apenas 1 era diabético. 
No que respeita à Ampicilina, em 46 pacientes sujeitos a antibiograma, apenas 1 
mostrou sensibilidade e os restantes 45 evidenciaram resistência a esta. Destes 45, 24 
não eram diabéticos e 21 eram Diabéticos. 
Passa-se exactamente o mesmo relativamente à Cefotaxima. A Cefalotina, em 69 
pacientes, nos quais esta foi testada no antibiograma, 49 apresentaram sensibilidade a 
esta, enquanto 20 apresentaram resistência. Destes 20 pacientes, 9 eram diabéticos e 11 
não diabéticos. 
No que diz respeito à Gentamicina, esta foi testada em todos os pacientes, i.e., 
em 72 pacientes. Destes apenas 14 mostraram resistência enquanto os restantes 58 
evidenciaram sensibilidade a esta. Dos 14 resistentes, 6 eram diabéticos e 8 não 
diabéticos. 
O Meropenem foi testado em 29 pacientes. Destes apenas 6 mostraram 
resistência a este, enquanto 23 apresentaram sensibilidade. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
40 
 
A Tobramicina foi testada em 31 pacientes. Destes apenas 5 apresentaram 
resistência, sendo 1 diabético e 4 não diabéticos. 
A associação Trimetorpim + Sulfametoxazol foi testada em 71 pacientes. Destes 
70 apresentaram resistência, sendo 31 diabéticos e 39 não diabéticos. Apenas 1 paciente 
evidenciou sensibilidade a este. 
Relativamente à Levofloxacina, em 16 pacientes apenas 5 mostraram resistência 
e tratava-se de diabéticos, enquanto os restantes 11 eram sensíveis. 
A Nitrofurantoína foi utilizada no antibiograma de 21 pacientes. Todos os 
pacientes apresentaram resistência a esta sendo 11 não diabéticos e 10 diabéticos. 
A Tigeciclina foi testada em 15 pacientes e todos apresentaram resistência a esta, 
sendo 8 diabéticos e 7 não diabéticos. 
No que respeita à Cefpodoxima, em 12 pacientes testados, todos apresentaram 
resistência a esta sendo 8 diabéticos e 4 não diabéticos. 
Na associação Piperacilina + Tazobactam, em 60 pacientes, apenas 12 
apresentaram sensibilidade, os restantes 48 pacientes apresentaram resistência sendo 24 
pacientes diabéticos e 24 não diabéticos. 
A Tetraciclina foi utilizada em 10 pacientes e todos eles evidenciaram 
resistência a esta sendo 4 diabéticos e 6 não diabéticos. 
A Cefoxitina foi aplicada no antibiograma de 27 pacientes. Destes todos 
apresentaram resistência a esta sendo 12 diabéticos e 15 não diabéticos. 
O Imipenem foi testado em 34 pacientes, destes apenas 7 apresentaram 
resistência a este sendo 3 diabéticos e 4 não diabéticos. 
No que respeita ao Aztreonam, em 20 pacientes, 14 apresentaram resistência 
sendo 5 diabéticos e 9 não diabéticos. Os restantes 6 apresentaram sensibilidade a este. 
A Cefepima foi utilizada em 15 pacientes. Destes, 8 apresentaram resistência 
sendo 3 diabéticos e 5 não diabéticos. 
A Minociclina foi aplicada em 26 pacientes, os quais apresentaram todos 
resistência a esta. Destes 11 são diabéticos e 15 não diabéticos. 
Na Pefloxacina, em 26 pacientes nos quais foi aplicada apenas 14 apresentaram 
resistência dos quais 5 diabéticos e 9 não diabéticos. 
A Piperacilina foi utilizada em 12 pacientes dos quais 6 apresentaram 
resistência. Destes apenas 1 é diabético enquanto 5 são não diabéticos. 
A Ticarcilina fo aplicada em 10 pacientes sendo 7 resistentes. Destes apenas 1 é 
diabético e os restantes 6 são não diabéticos. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
41 
 
Relativamente à Ticarcilina + Ácido Clavulânico, esta associação foi utilizada 
no antibiograma de 25 pacientes, apresentando 12 resistência e 13 sensibilidade. Dos 
resistentes 5 são diabéticos e 7 não diabéticos. 
A colistina foi testada em 19 pacientes. Destes 5 apresentaram resistência sendo 
3 diabéticos e 2 não diabéticos. 
No que respeita à Isepamicina, esta foi testada em 11 pacientes dos quais 9 
mostraram ser sensíveis e 2 resistentes. 
A Norfloxacina foi testada em 26 pacientes dos quais 8 apresentaram resistência 
sendo 1 diabético e 7 não diabéticos. 
Estes dados encontram-se descritos no Gráfico 6. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
42 
 
 
Gráfico 6 – Relação entre a resistência/sensibilidade a antibacterianos com o facto de ser um paciente diabético/não diabético.
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
43 
 
Num total de 45 pacientes nos quais foi testada a Amoxicilina+ Ácido 
Clavulânico, 44 apresentaram resistência a estes, enquanto somente 1 paciente 
evidenciou sensibilidade. Dos 44 resistentes 26 têm valores normais de Proteína C 
reactiva 18 têm valores elevados de Proteína C reactiva. 
Para a Amicacina, em 44 pacientes nos quais foi usada no antibiograma, 39 
apresentaram sensibilidade a esta, enquanto apenas 5 mostraram resistência a esta. Dos 
39, 21 têm valores normais de Proteína C reactiva e 18 valores elevados. 
No que respeita à Ampicilina, em 45 pacientes sujeitos a antibiograma, apenas 1 
mostrou sensibilidade e os restantes 44 evidenciaram resistência a esta. Destes 44, 26 
têm valores normais de Proteína C reactiva e 18 têm valores elevados. Passa-se 
exactamente o mesmo relativamente à Cefotaxima. 
A Cefalotina, em 14 pacientes, nos quais esta foi testada no antibiograma, todos 
apresentaram resistência a esta. Destes, 11 têm valores normais de Proteína C reactiva e 
3 têm valores elevados. 
No que diz respeito à Gentamicina, esta foi testada em 71 pacientes. Destes 
apenas 14 mostraram resistência enquanto os restantes 57 evidenciaram sensibilidade a 
esta. Dos 14 resistentes, 5 têm valores normais de Proteína C reactiva e 9 têm valores 
elevados desta. 
O Meropenem foi testado em 28 pacientes. Destes apenas 6 mostraram 
resistência a este, enquanto 22 apresentaram sensibilidade. 
A Tobramicina foi testada em 31 pacientes. Destes apenas 5 apresentaram 
resistência, sendo 2 com valores elevados de Proteína C reactiva e 3 com valores 
normais desta. 
A associação Trimetorpim + Sulfametoxazol foi testada em 70 pacientes. Destes, 
69 apresentaram resistência, sendo 33 com valores elevados de Proteína C reactiva e 36 
com valores normais desta. Apenas 1 paciente evidenciou sensibilidade a este. 
Relativamente à Levofloxacina, em 15 pacientes apenas 4 mostraram resistência, 
enquanto os restantes 11 eram sensíveis. 
A Nitrofurantoína foi utilizada no antibiograma de 20 pacientes. Todos os 
pacientes apresentaram resistência a esta sendo 6 com valores normais de Proteína C 
reactiva 14 com valores elevados desta. 
A Tigeciclina foi testada em 14 pacientes e todos apresentaram resistência a esta, 
sendo 9 com valores normais de Proteína C reactiva e 5 com valores elevados desta. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
44 
 
No que respeita à Cefpodoxima, em 12 pacientes testados, todos apresentaram 
resistência a esta sendo 8 com valores normais de Proteína C reactiva e 4 com valores 
elevados desta. 
Na associação Piperacilina + Tazobactam, em 59 pacientes, apenas 12 
apresentaram sensibilidade, os restantes 47 pacientes apresentaram resistência sendo 
que 25 pacientes apresentam valores normais de Proteína C reactiva e 22 valores acima 
dos normais desta. 
A Tetraciclina foi utilizada em 10 pacientes e todos eles evidenciaram 
resistência a esta sendo 8 com valores normais de Proteína C reactiva e 2 com valores 
acima do normal desta. 
A Cefoxitina foi aplicada no antibiograma de 27 pacientes. Destes, todos 
apresentaram resistência a esta sendo 12 com valores acima do normal de Proteína C 
reactiva e 15 com valores normais desta. 
O Imipenem foi testado em 34 pacientes, destes apenas 7 apresentaram 
resistência a este sendo 3 com valores elevados de Proteína C reactiva e 4 com valores 
normais desta. 
No que respeita ao Aztreonam, em 20 pacientes, 14 apresentaram resistência 
sendo 5 com valores normais de Proteína C reactiva e 9 com valores elevados desta. Os 
restantes 6 apresentaram sensibilidade a este. 
A Cefepima foi utilizada em 15 pacientes. Destes, 8 apresentaram resistência 
sendo 2 com valores normais de Proteína C reactiva e 6 com valores elevados desta. 
A Minociclina foi aplicada em 26 pacientes, os quais apresentaram todos 
resistência a esta. Destes 10 têm valores de Proteína C reactiva normais e 16 têm valores 
elevados desta. 
Na Pefloxacina, em 26 pacientes nos quais foi aplicada apenas 14 apresentaram 
resistência dos quais 5 têm valores normais de Proteína C reactiva e 9 valores acima do 
normal desta. 
A Piperacilina foi utilizada em 12 pacientes dos quais 6 apresentaram 
resistência. Destes apenas 2 têm valores normais de Proteína C reactiva enquanto 4 têm 
valores acima do normal desta. 
A Ticarcilina fo aplicada em 10 pacientes sendo 7 resistentes. Destes apenas 2 
têm valores de Proteína C reactiva normais sendo os restantes 5 com valores acima do 
normal. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
45 
 
Relativamente à Ticarcilina + Ácido Clavulânico, esta associação foi utilizada 
no antibiograma de 25 pacientes, apresentando 12 resistência e 13 sensibilidade. Dos 
resistentes 4 têm valores normais de Proteína C reactiva e 8 valores acima do normal. 
A Colistina foi testada em 19 pacientes. Destes 5 apresentaram resistência sendo 
3 com valores normais de Proteína C reactiva e 2 com valores acima do normal. 
No que respeita à Isepamicina, esta foi testada em 11 pacientes dos quais 9 
mostraram ser sensíveis e 2 resistentes. Dos 2 resistentes ambos têm valores elevados de 
Proteína C reactiva. 
A Norfloxacina foi testada em 27 pacientes dos quais 8 apresentaram resistência 
sendo 5 com valores normais de Proteína C reactiva e 3 com valores elevados desta. 
Estes dados encontram-se descritos no Gráfico 7. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
46 
 
 
Gráfico 7 – Relação entre a Resistência/Sensibilidade a antibacterianos e os valores altos ou baixos de Proteína C reactiva. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
47 
 
3.2. Resultados Laboratoriais 
3.2.1. Transformação bacteriana 
A transformação bacteriana envolveu várias etapas devido aos resultados não 
satisfatórios que foram sendo obtidos. Na 1.ª vez, as placas surgiram sem fluorescência e 
crescimento exacerbado (possível contaminação) (figura 10A). Na 2.ª vez, surgiram igual à 
primeira vez. A 3.ª vez envolveu um crescimento bacteriano sem fluorescência quer em E. coli 
quer em P. aeruginosa. Na 4.ª vez, apareceu uma fluorescência e um crescimento bacteriano 
normal (figura 10B). 
 
Figura 10 – Transformação: A) estirpe original (ausência de fluorescência e meio sem antibiótico) B) estirpe 
transformada (presença de fluorescência em meio com antibiótico). 
3.2.2. Teste da Nitrocefina 
Sabe-se que algumas bactérias são capazes de produzir enzimas que inactivam os 
antibacterianos β-lactâmicos. Algumas hidrolisam as cefalosporinas e chamam-se 
cefalosporinases e outras as penicilinas e denominam-se penicilinases. Existem bactérias que 
possuem enzimas capazes de hidrolisar quer cefalosporinas quer penicilinas. Um teste à β-
lactamase rápido pode ser concretizado e ceder informação relevante mais rápida que um exame 
microbiológico. Os testes clínicos existentes detectores de β-lactamases são o método 
acidométrico, o método iodométrico e os substratos cromogénicos. O teste da Nitrocefina 
pretence ao método cromogénico. A nitrocefina é uma cefalosporina cromogénica usada para 
testar Neisseria gonorrhoeae, Moraxella (Branhamella) catarrhalis, Staphylococcus spp., 
Haemophilus influenzae, Enterococcus spp., e algumas bactérias anaeróbias, e é efectiva na 
detecção de todas as β-lactamases conhecidas. Os discos usados estão impregandos com 
nitrocefina. Assim que a ligação amida no anel β-lactâmico é hidrolizada pela β-lactamase, a 
nitrocefina muda de cor de amarelo a vermelho. As bactérias que produzam β-lactamases em 
quantidades significativas desenvolvem esta alteração de cor de amarelo a vermelho. Estas β-
A B 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
48 
 
lactamasessão capazes de inactivar, por exemplo, a amoxicilina, a penicilina, a ampicilina, a 
piperacilina, entre outros antibacterianos. 
 Os resultados obtidos foram indicadores de transformação concretizada. Usou-se 
um controlo de bactéria não transformada para se distinguir a alteração de cor da não 
alteração de cor (ver figura 11). 
 
Figura 11 – Teste da Nitrocefina: o disco da esquerda apresenta alteração de cor (bactérias transformadas) e o 
disco da direita não apresenta alteração de cor significativa (bactérias não transformadas). 
3.2.3. Reacção PCR 
A Reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica da Biologia Molecular que 
permite replicar in vitro o DNA de modo rápido. Com esta técnica, as quantidades mínimas de 
material genético podem ser amplificadas em milhões de vezes em poucas horas, permitindo 
uma detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos em estudo. 
 O PCR decorre em três passos os quais em conjunto se designam como um ciclo, o qual 
se repete um número específico de vezes. Estes três passos envolvem a Desnaturação, a 
Hibridização ou Anealing e a Extensão. 
 O termociclador automaticamente controla e alterna as temperaturas durante 
períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (normalmente 
entre 30-40 ciclos). 
 Relativamente ao primeiro passo, a Desnaturação térmica, envolve uma 
temperatura elevada (geralmente> 90ºC) à qual a cadeia dupla de DNA separa-se em dois 
filamentos, denominando-se de “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são 
mantidos (as) juntos (as) por pontes de hidrogénio, as quais, por serem relativamente fracas, 
quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e 
desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
49 
 
 O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a 
sequência de interesse. O segundo passo, a Hibridização ou Annealing, envolve os iniciadores, 
ou primers, os quais marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas 
sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases. Numa reacção de PCR são utilizados 
dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de 
desnaturação. O início da sequência do DNA alvo é marcado pelos primers que se hibridizam, 
i.e., ligam-se, com a sequência complementar. A Temperatura de annealing ou de hibridização, 
normalmente, situa-se entre os 40ºC e os 65ºC, dependendo do comprimento dos primers e da 
sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadoras 
se liguem à sequência alvo com uma especificidade elevada. 
 No terceiro passo, a Extensão, após a ligação dos primers ou iniciadores às 
sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72ºC e ocorre 
replicação da cadeia de DNA por acção da enzima Taq polimerase. A Taq polimerase é uma 
polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao 
contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas. O processo de 
síntese é iniciado numa zona com dupla cadeia, na qual estão ligados os primers, incorporando 
os nucleótidos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. A extensão 
inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das 
cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direcção 5’ para 3’. 
 No final do primeiro ciclo de PCR encontramos duas novas cadeias de DNA 
idênticas à original. 
 No ponto final, a DNA polimerase não reconhece o final da sequência. Assim, as 
novas cadeias sintetizadas têm o seu início definido pelo primer, mas a sua extremidade 3’ não 
está definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, 
esta cadeia irá servir de molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra 
extremidade da cadeia. A cadeia de DNA, sintetizada a partir deste molde, terá então o 
comprimento definido, com os limites definidos pelos primers. Estas cadeias chamam-se 
Amplicons. Após alguns ciclos, as cadeias de DNA, que correspondem ao tamanho exacto da 
sequência alvo, estão presentes num número muito maior do que as sequências de comprimento 
variável. Por outras palavras, a sequência flanqueada pelos iniciadores ou primers é a secção do 
DNA que se amplifica, neste caso a do gene pGLO. 
O PCR foi utilizado para determinar a presença do gene que confere resistência a 
antibacterianos, pGLO. A existência de bandas altamente inespecíficas evidenciava a 
necessidade de ajustar as condições de PCR. Os resultados obtidos não foram conclusivos. 
Como poderia demorar desde dias a semanas ou até mesmo a meses até optimizar as condições 
optou-se por recorrer ao estudo estatístico deixando este num progresso mais lento (ver figura 
12). 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
50 
 
 
Figura 12 – Gel de electroforese: é possível verificar que existe DNA nos poços e que as bandas presentes são 
altamente inespecíficas sendo necessário optimizar as condições de PCR. Analisou-se o DNA de E. coli e de P. 
aeruginosa. 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
51 
 
 
 
 
4. Discussão /Conclusão 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
52 
 
Segundo os resultados obtidos a amostra em estudo apresenta idades 
envelhecidas pois 50% dos pacientes têm idades superiores a 78,5 anos o que deve-se ao 
facto de serem idades mais susceptíveis a doença e consequentemente a internamentos, 
pelo seu sistema imunitário mais débil (DGS, 2004). 
Nos internamentos verificou-se um predomínio do sexo feminino sobre o 
masculino pois existem mais mulheres do que homens sendo maior a probabilidade de 
uma mulher adoecer e ficar internada. Estudos têm demonstrado que as mulheres 
apresentam maiores necessidades de cuidados de saúde do que os homens (Artur et 
Fachada, 2004). 
Apesar de haver um grande número de pacientes envelhecidos, a percentagem de 
diabéticos é inferior à de não diabéticos, logo a idade não parece ter influência para os 
valores mais altos ou mais baixos de glicose. No entanto sabe-se que a partir dos 35 
anos é mais frequente a Diabetes do tipo II (NDSS, 2011). No gráfico traçado é possível 
verificar que existe uma relação entre a idade e os valores de glicose no sangue. 
Relativamente aos serviços de internamento, os serviços com maior número de 
pacientes são os Serviços de Medicina (Adultos, Pediatria, …), seguindo-se o serviço de 
Cirurgia. Segundo a bibliografia consultada os Cuidados intensivos seriam os serviços 
com maior número de pacientes com infecção por P. aeruginosa, seguindo-se da 
Medicina e por último a Cirurgia. Com estes resultados pode-se afirmar que tem havido 
um aumento no número de pacientes com infecções por esta bactéria nos serviços de 
Medicina e Cirurgia sendo necessário estar alerta pois é indicador de um agravamento 
ou descuido relativamente às condições de limpeza quer da equipa quer do próprio 
equipamento (Pina et al, 2009). 
No que diz respeito aos resultados relativos à relação entre a idade e a 
resistência/sensibilidade a antibacterianos não foi possível encontrar uma relação, no 
entanto sabe-se que existe uma relação. Quando mais avançada for a idade menor é a 
sensibilidade aos antibacterianos pelo facto de ao longo da vida já ter estado em 
contacto com um maior número de antibacterianos. Seria necessário expandir o número 
da amostra para ser possível tirar mais conclusões (Ribeiro, M. et Pinto, I.(2009)). 
Os locais de infecção mais comuns desde 2001 até 2009 são as Infecções 
Respiratórias. Em 2001 estas eram seguidas pelas Septicémias. Em 2002 estas 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
53 
 
seguiram-se pelas Infecções urinárias, Infecções de Tecidos Moles e por último pelas 
Septicémias. Em 2007 estas seguiram-se pelas Infecções urinárias, Infecções 
gastrointestinais e pelas Septicémias (Pina et al, 2009). No presente estudo piloto, 
referente a 2011, o local de infecção mais comum continuou a ser as Infecções 
respiratórias, seguidas das Infecções urinárias, das Infecções dos tecidos moles e por 
último as Septicémias. Foi possível verificar que mantêm-se as mais comuns, Infecções 
Respiratórias e Urinárias, mas com uma diminuição na frequência. As menos comuns, 
Infecções tecidos moles e Septicémias, mantêm-se como menos comuns mas 
apresentam um aumento na sua frequência, o que significa que será necessária atenção 
redobrada sobre estes pacientes. 
Relativamente à resistência a antibacterianos e os valores de glicose, 
diabético/não diabético, em todos os pacientes que apresentaram sensibilidade aos 
diversos antibacterianos testados existem diabéticos e nem em todos os pacientes que 
apresentaram resistência a estes existem diabéticos, a presença/ausência de diabetes, 
segundo o presente estudo, não tem qualquer influência na resistência/sensibilidade aos 
antibacterianos. Por exemplo, a Colistina apresenta um maior número de pacientes 
diabéticos resistentes a esta, acontecendo o mesmo com a Levofloxacina, mas a 
Ticarcilina apresenta um maior número de pacientes diabéticos no grupo dos pacientes 
que mostraram sensibilidade a esta. A existência de poucos estudos que relacionem as 
duas variáveis dificultou o estudo por não haver um termo de comparação. Apesar de 
tudo, reconhece-se que os pacientes diabéticos apresentam uma maior frequência de 
infecções em relação aos pacientes não diabéticos. Desta forma tomam mais 
frequentemente antibacterianos podendo desenvolver mais facilmente resistência a 
estes. No entanto, alguns estudos dizem que a diabetes por si só não é um factor causal 
para a resistência a antibacterianos (Meiland et al, 2004). 
Os valores da Proteína C Reactiva também demonstraram não ter qualquer 
influência na resistência/sensibilidade a antibacterianos pois em todos os pacientes que 
mostraram ser sensíveis aos antibacterianos existem valores elevados desta, assim como 
em todos os que mostraram ser resistentes aos antibacterianos. Por exemplo, A 
Isepamicina apresenta elevadas percentagens de pacientes com valores de PrCR 
elevados quer em pacientes que mostraram sensibilidade a esta quer nos que mostraram 
resistência. Do mesmo modo acontece na Ticarcilina e Ticarcilina + Ácido Clavulânico, 
na Piperacilina, Minociclina, Cefepima e Aztreonam. A proteína C reactiva é indicadora 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
54 
 
de infecção no organismo mas não foi encontrado qualquer estudo que atribua uma 
associação dos valores desta ao facto de o paciente ser ou não resistente aos 
antibacterianos (NIH, 2011). 
Segundo uma notícia publicada no Jornal de Notícias a 5 de Setembro do 
corrente ano, Portugal revelou uma taxa de infecções hospitalares superior à média 
mundial. A média nacional atingiu os 11% enquanto a média total foi de 2,6%. Dos 
pacientes internados 20% apresentavam mais de 85 anos (Tavares, 2011). 
Segundo o Diário da República n.º 49 Série I Parte A de 27/02/2001, Decreto-
Lei n.º 76/2001 de 27/02/2001, capítulo III – Órgãos e competências, secção VI – 
Órgãos de apoio técnico, artigo 32º - Comissão de controlo da infecção hospitalar, “a 
comissão de controlo da infecção hospitalar é presidida por um adjunto do director 
clínico, competindo-lhe o estudo e a apresentação de medidas de prevenção e combate 
à infecção hospitalar” (Diário da República, 2001). 
O hospital em estudo apresenta um sistema de vigilância com uma política de 
controlo de infecções hospitalares, impostos pela Comissão de controlo da infecção 
hospitalar. Este hospital contém uma carta ecológica bacteriana e a equipa contém, entre 
outros, um epidemiologista e um biólogo. 
Tendo em consideração que 91,67% dos pacientes em estudo manifestou 
resistência a mais do que 3 classes de antimicrobianos, torna-se realmente urgente o uso 
controlado de antibacterianos e a pesquisa de novas terapêuticas em alternativa a estes 
de modo a evitar e a controlar as resistências bacterianas aos antibacterianos disponíveis 
neste momento no mercado. 
 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
55 
 
 
 
 
5. Perpectivas 
Futuras 
 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
56 
 
O aumento crescente da resistência a antibacterianos aumentou a necessidade de 
uma pesquisa intensa de novas terapêuticas em alternativa à antibioterapia. 
A partir do estudo realizado a pesquisa laboratorial, a qual por falta de tempo 
ficou pela parte da transformação bacteriana, teria ainda como passo seguinte a 
utilização de bacteriófagos em culturas bacterianas de modo a avaliar a velocidade e a 
densidade do crescimento bacteriano. 
Primeiramente seria necessário caracterizar o crescimento do bacteriófago 
descrevendo o seu ciclo infeccioso e para tal determinando a fase latente e burst size. 
Segundo Kutter e Sulakvelidze (2004), é melhor infectar a bactéria numa fase de 
crescimento exponencial para obter células metabolicamente activas. O burst size 
descreve o número médio de fagos libertados pela célula bacteriana (Kutter e 
Sulakvelidze, 2004). 
O próximo passo seria determinar a fase de desenvolvimento bacteriano ideal 
para aplicação da fagoterapia nas culturas bacterianas. Determinar qual o pico do seu 
crescimento e aplicar a fagoterapia de forma a verificar se seria esse o melhor método 
de aplicação da terapêutica. Para tal as culturas bacterianas transformadas ficariam em 
crescimento em meio líquido sendo sujeitas a análise da densidade óptica de hora em 
hora de modo a traçar a curva do seu crescimento. Depois de traçadas as curvas de 
crescimento bacteriano aplicam-se os fagos no ponto do crescimento exponencial. 
Após vários testes de forma a determinar a eficácia in vitro da fagoterapia no 
tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa transformada, ou seja resistente, 
passar-se-ia para a fase da utilização do modelo animal. 
Utilizar-se-iam modelos animais fêmea aos quais seria causada uma ferida 
cutânea e infectada por P. aeruginosa transformada. A composição do cocktail de P. 
aeruginosa seria de 100 µL de inoculum (2x10
2
 a 3x10
2
 CFU). De seguida analisar-se-
ia o desenvolvimento da infecção. Uns modelos animais iriam ser tratados com uma 
preparação farmacêutica (pomada) com fagos, enquanto outros iriam servir para estudar 
a evolução da infecção de modo a determinar a durabilidade dos modelos infectados 
para um controlo, e ainda outros seriam usados para determinar a toxicidade dos fagos 
no nosso organismo. O diagrama seguinte descreve a distribuição dos diferentes 
modelos animais durante o estudo. 
Fagoterapias para infecções por P. aeruginosa multirresistentes 
57 
 
 
A pomada utilizada iria ter em conta, primeiramente, a composição do cocktail 
de fagos, o qual teria que ter uma concentração de 3,0 x10
8
 PFU total. Depois seria 
envolvido numa pomada composta por vaselina pura e parafina qbp de forma a ser 
melhor absorvida pela pele. A sua aplicação poderia ser igualmente numa gaze 
impregnada por este cocktail. 
Modelo animal 
Fago + P. aeruginosa 
(avaliação da 
eficácia do 
tratamento)