Biotecnologia e DNA Recombinante

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Biotecnologia e
 DNA Recombinante
Discentes: Bianca Costa
 Jeisiane Souza
 Jobson Ferreira
 Joyce Brasil
 Tagna Pedroso
Prof. Ms Eveline Sousa
Marabá - PA
2018
Universidade do Estado do Pará
Centro de Ciências Biológicas e de Saúde
Biomedicina 2016
Bacteriologia
Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante
A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética conhecida também por DNA recombinante.
Essa tecnologia permite selecionar um pedaço do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações genéticas.
Ao usar a palavra clonagem é muito comum realizar a associação com o clone de um organismo inteiro, como o caso da ovelha Dolly. 
Entretanto, clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento de DNA.
Aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na ciência, medicina, agricultura e indústria.
Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante
Desde os anos 60 uma série de descobertas revolucionaram o estudo da genética e permitiram um grande desenvolvimento da engenharia genética. 
As indústrias química, farmacêutica e agrária investem milhões em seu desenvolvimento. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.
As bactérias também têm sido usadas na mineração para extrair elementos valiosos do minério. 
Além disso, as células animais têm sido utilizadas na produção de vacinas virais desde a década de 1950.
Assim, bactérias com genes de insulina humana são utilizadas para produzir insulina para o tratamento do diabetes.
Uma vacina contra a hepatite B está sendo produzida em uma levedura portadora do gene que codifica parte do vírus causador da doença (a levedura produz uma proteína do capsídeo viral). 
Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
 Técnica em que pequenas amostras de DNA podem ser rapidamente amplificadas, isto é, aumentadas em quantidades suficientes para que a análise seja feita.
Iniciando com somente um fragmento de DNA do tamanho de um gene, a PCR pode ser utilizada para produzir literalmente bilhões de cópias em poucas horas. 
No que consiste?
Cada fita do DNA-alvo servirá como molde para a síntese do DNA. 
Acrescenta-se a este DNA uma provisão dos quatro nucleotídeos (para serem montados dentro do novo DNA) e a enzima para catalisar a síntese, a DNA-polimerase. Pequenos fragmentos de ácido nucleico, denominados iniciadores (ou primers), são complementares às extremidades do DNA-alvo e 
irão se anelar aos fragmentos a serem amplificados. 
A polimerase, então, sintetiza novos fragmentos complementares. 
Depois de cada ciclo, o DNA é aquecido para converter todo o novo DNA em fitas simples. Cada fita de DNA recém-sintetizada funciona, por sua vez, como molde para novos DNAs.
Continua exponencialmente
Fonte: TORTORA, 2012.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Reagentes: são adicionados em um tubo, que é então colocado em um termociclador.
Ajustado para a temperatura, o tempo e o número de ciclos desejados. 
O uso de termociclador automatizado é possível devido à utilização da DNA-polimerase retirada da bactéria termofílica Thermus aquaticus; Trinta ciclos, completados em apenas algumas horas, irão aumentar a quantidade de DNA-alvo em mais de um bilhão de vezes. 
O DNA amplificado pode ser visualizado por eletroforese em gel. 
Na PCR em tempo real, o DNA recém-formado é marcado com um corante fluorescente, e assim os níveis de fluorescência podem ser medidos após cada ciclo de PCR (por isso a designação tempo real). 
Transcrição Reversa: Utiliza RNA viral ou mRNA como molde. Nesse caso, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma molécula de DNA a partir do RNA molde, e a seguir o DNA é amplificado
Quantidades pequenas e específicas da escolha do primer
Técnicas de Engenharia Genética
Inserção de DNA exógeno nas células
Os métodos para a produção de rDNA exigem que as moléculas, de DNA sejam manipuladas fora da célula e depois reintroduzidas em células vivas. Existem várias maneiras de se introduzir DNA em células. O método de escolha geralmente é determinado pelo tipo de vetor e de célula hospedeira que está sendo utilizado.
Transformação
Eletroporação
Fusão
Microinjeção
Técnicas de Engenharia Genética
Transformação
Normal: Na natureza, os plasmídeos geralmente são transferidos entre micróbios de parentesco próximo por contato célula-célula, como na conjugação. 
Na engenharia genética: Um plasmídeo deve ser inserido em uma célula por transformação, um processo durante o qual as células podem captar DNA do ambiente circundante . 
Muitos tipos celulares, incluindo células de E. coli, de levedura ou de mamíferos, não são transformados naturalmente; entretanto, tratamentos químicos simples podem tornar esses tipos celulares competentes, ou seja, capazes de captar DNA externo. 
Para E. coli, o procedimento para produzir células competentes é a incubação celular em uma solução de cloreto de cálcio por um período breve. Após esse tratamento, as células, já competentes, são misturadas com o DNA clonado e submetidas a um choque térmico moderado. Algumas dessas células irão captar o DNA.
Técnicas de Engenharia Genética
Eletroporação
Corrente elétrica para formar poros microscópicos nas membranas celulares;
DNA entra nas células através desses poros. 
A eletroporação geralmente é aplicável a todas as células;
Exceção: Aquelas com paredes celulares muitas vezes devem ser convertidas primeiro em protoplastos (remoção enzimática).
Permite um acesso mais direto à membrana plasmática.
Fonte: Profissão Biotec, 2017.
Técnicas de Engenharia Genética
Fusão
O processo de fusão também tira vantagem das propriedades dos protoplastos. 
Os protoplastos em solução se fundem com uma frequência baixa, mas significante; 
A adição de polietileno- glicol aumenta a frequência de fusão. 
Na nova célula híbrida, o DNA derivado das duas células “parentais” pode sofrer recombinação natural. 
Esse método é especialmente importante para a manipulação genética de células vegetais e de algas.
Fonte:TORTORA, 2012.
Técnicas de Engenharia Genética
Método para a introdução de DNA exógeno em células vegetais é, literalmente, o disparo direto do DNA por meio das espessas paredes de celulose utilizando uma pistola de genes . 
As partículas microscópicas de tungstênio ou ouro são cobertas com DNA e arremessadas pelas paredes de células vegetais por uma explosão de hélio. Algumas das células expressam o DNA introduzido como se fosse delas próprias.
Fonte: Genmol, 2013.
Fonte: TORTORA, 2012.
Técnicas de Engenharia Genética
Microinjeção
O DNA pode ser introduzido diretamente em uma célula animal. 
Micropipeta de vidro é necessário, com o diâmetro muito menor que a célula. 
A micropipeta perfura a membrana plasmática e o DNA pode ser introduzido através dela.
A microinjeção de DNA exógeno em um óvulo fecundado de camundongo. Inicialmente, o óvulo é imobilizado com o auxílio de uma pipeta de extremidade rombuda, aplicando uma leve sucção (à direita). Várias centenas de cópias do gene de interesse são então injetadas no núcleo da célula, por meio de uma micropipeta de extremidade minúscula (à esquerda).
Fonte: TORTORA, 2012.
Obtenção do DNA
Existem duas fontes principais: (1) bibliotecas de genes contendo cópias naturais ou cópias de cDNA dos genes produzidos a partir do mRNA e (2) DNA sintético.
Bibliotecas de genes
Uma biblioteca genômica é uma coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo, obtidos a partir da ação de endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e clonados após terem sido inseridos em um hospedeiro. 
Como é obtido?
1. Extração de DNA do organismo: lise celular e precipitação do DNA;
2. Obtenção de todo o genomado organismo;
3. DNA é “digerido” pelas enzimas de restrição;
4. Os fragmentos de restrição são ligados em vetores plasmidiais ou fágicos, e os vetores recombinantes são introduzidos na célula bacteriana.
O objetivo é produzir uma coleção de clones grande o suficiente para assegurar a existência de pelo menos um clone para cada gene do organismo.
Obtenção do DNA
Clonagem de genes eucarióticos: Introns e Exons.
Quando o RNA transcrito de um gene como este é convertido em mRNA, os íntrons são removidos.
Obs: Na clonagem de genes de células eucarióticas, é desejável a utilização de versões dos genes que não possuam íntrons (GRANDE).
Obs ²: Bactéria normalmente não será capaz de remover os íntrons do RNA transcrito =sem produto proteico
Gene artificial com apenas éxons pode ser produzido com a utilização de uma enzima, transcriptase reversa, que sintetiza DNA complementar (cDNA) a partir de um molde de mRNA.
Fonte: TORTORA, 2012.
RNA será eliminado por digestão enzimática
DNA Polimerase sintetiza uma fita de cDNA (fragmentode fita dupla) com informações de mRNA.
Molécula de cDNA produzidas a partir de uma mistura de todos os mRNAs de um tecido ou tipo celular, podem ser clonadas para formar a biblioteca de cDNA.
Dificuldade - Método as vezes não permite a transcrição reversa completa em DNA, muitas vezes é abortada, formando partes do gene de interesse.
Fonte: TORTORA, 2012.
Obtenção do DNA
DNA Sintético
Os genes podem ser produzidos in vitro com auxílio de máquinas.
Máquina - Um teclado é utilizado para a entrada da sequência de nucleotídeos desejadas. 
Um microprocessador controla a síntese de DNA a partir do suprimento de nucleotídeos armazenados e dos reagentes necessários.
OBS: Cadeias com mais de 120 nucleotídeos podem ser sintetizadas dessa forma, mas se o gene for muito pequeno, várias cadeias devem ser sintetizadas separadamente e unidas para formar a sequência completa.
A sequência deve ser conhecida. Se o gene ainda não foi isolado, a forma de prever a sequência do DNA é a partir da sequência de aminoácidos do produto proteico. 
Sendo conhecida, pode -se voltar-se para o código genético para obter a sequência.
A degeneração do código genético impede a determinação livre de ambiguidades (exemplo: leucina com 6 códons, qual estará presente no gene?)
Devido a isso, é rara a clonagem de um gene a partir da síntese direta.
É importante para processos de seleção.
Fonte: TORTORA, 2012.
Selecionando um Clone
Selecionar a celula que tenho o gene de interesse especifico
Seleção Branca-Azul das colônias formadas no final do processo
Vetor plasmidial - gene de resistencia a ampicilina
Bacterias resistentes irão se multiplicar
Gene novo no gene de B- galactatosidase - colonias brancas
B- galactatosidase intacto hidrolisa com X-gal colonias azuis 
Selecionando um Clone
Colônias Brancas tem dna exógeno mas não se sabe se é o fragmento desejado
Segundo processo
Hibridização de colônias - identificação de células portadoras de um gene clonado específico
Sondas de DNA - ira se aderir ao alvo
Aplicações Terapêuticas 
Insulina antes extraida de animais
Produção de insulina a partir de tecnicas de DNA recombinante 
Construir genes sintéticos para cada uma das duas cadeias polipeptídicas 
Cada gene inserido em um vetor plasmidial e ligado a extremidade de um gene codificando a enzima B- galactatosidase 
Utilizar culturas bacteriana de E. coli - cada uma produzindo uma cadeia
Polipeptídeos recuperados da bacteria e separados da B- galactatosidase 
Unidos quimicamente para produzir a insulina humana
RNA interferente - tratamento de cânceres e infecções virais
Destruição enzimática - silenciando a expressão do gene
Camundongo inibição do vírus da Hepatite B
Duração de 13 anos
Objetivo:
Sequenciar o genoma humano;
Aproximadamente 3 bilhões de pares de nucleotídeos;
Nº total de genes: 80.000 a 120.000
Participação de pessoas de 18 países;
Sangue e esperma;
Sequenciamento Shotgun
Resultados:
99,9% semelhante em todos os seres humanos;
~25.000 genes;
Cerca de 3% do gene codificam produtos funcionais;
Projeto Genoma Humano
DNA recombinante → “gráfica para imprimir DNA”;
Sequenciamento de DNA;
Sequenciamento aleatório por shotgun; 
Aplicações científicas
Bioinformatica;
Bancos de dados;
Semelhança de genomas de organismos diferentes;
Genética reversa
Sequência gênica X efeitos específicos em um organismo;
Aplicação do sequenciamento;
Fibrose cística;
Southern blotting.
Aplicações científicas
Southern blotting
Aplicações científicas
Técnicas baseadas na hibridização;
DNA fingerprinting;
Identificação de patógenos virais e bacterianos;
Paternidade;
Microbiologia forense;
Hospitais e fabricantes de alimentos podem ser acionados judicialmente;
Microrganismos podem ser utilizados como armas biológicas.
Aplicações na agricultura
Seleção de plantas;
Cruzamentos convencionais (germinação e maturação);
Revolucionadas→ células vegetais multiplicadas em cultura;
Técnicas de DNA recombinante;
Céls→ induzem a regenerar plantas/ melhoramento;
Introdução de DNA recombinante
Fusão de protoplastos
“Projéteis”
Plasmídeo Ti 
Agrobacterium tumefaciens
Infecta plantas→ crescimento tumoral
caracterizada pela formação de tumores na coroa (junção entre o caule e a raiz). As células dessa região se multiplicam descontroladamente devido à transferência de genes da bactéria para estas células.
Fonte: TORTORA, 2012.
Capacidade de infectar a planta hospedeira;
Regiões essenciais:
Região do T-DNA → que é transferida;
Região vir (região de virulência) → que codifica proteínas responsáveis pelo processo de transferência do T-DNA para a célula vegetal.
Trabalho com vegetal:
Plasmídeo Ti→ veículo
Introdução de DNA geneticamente modificado em plantas;
Processo:
Aplicações na agricultura
Um cientista pode inserir genes exógenos no T-DNA, reintroduzir o plasmídeo recombinante em uma célula de Agrobacterium e utilizar a bactéria para inserir o plasmídeo Ti recombinante em uma célula vegetal. A célula vegetal com o gene exógeno pode então ser utilizada para gerar uma nova planta. Com sorte, a nova planta expressará
o gene exógeno. Infelizmente, Agrobacterium não infecta gramíneas
naturalmente, de modo que não pode ser utilizado no melhoramento
de cereais como trigo, arroz e milho.
Infelizmente a Agrobacterium t. não infecta gramíneas naturalmente
Plantas resistente ao herbicida glifosato e a toxina (Bt) (Bacillus thuringiensis)
Herbicida→ mata ervas daninhas; plantas úteis;
Inibindo uma enzima
Salmonella:
Enzima mutante resiste herbicida;
→ Introdução do DNA planta cultivada→ resistência ao herbicida→ mata ervas daninhas
Plantas resistentes→ herbicidas e pesticidas→ introduzida por EG;
Resistência à seca, a infecções virais e a vários outros estresses ambientais;
Bacillus thuringiensis→ patogênica p/ insetos:
Proteína toxina Bt→ TGI;
Gene Bt é inserido na planta (Algodão e batata);
Aplicações na agricultura
Realizações importantes obtidas com essa abordagem foram
a introdução em plantas da resistência ao herbicida glifosato e a
toxina (Bt) derivada da bactéria Bacillus thuringiensis que funciona
como inseticida.
Aplicações na agricultura
Ex. bactéria modificada→ Pseudomonas fluorences,
Alterada p/ produção de toxinas (Bacillus thuringiensis.)
Mata patógenos→ Broca do milho europeia;
Pseudomonas alterada geneticamente→ adicionada a sementes;
Toxina→ mata a larva da broca
Inócua p/ humanos e outros animais.
Criação de animais:
1º produto da EG→ Hormônio do crescimento humano;
Produção do hormônio do crescimento bovino (bGH)
Peso; produção de leite;
Resistencia dos consumidores.
Um exemplo de uma bactéria modificada por engenharia genética
que agora está sendo utilizada na agricultura é Pseudomonas
fluorences, que foi alterada de modo a produzir uma toxina normalmente
produzida por Bacillus thuringiensis.Essa toxinamata
certos patógenos de vegetais, como a broca do milho europeia. A
Pseudomonas alterada geneticamente, que produz muito mais toxina
que B. thuringiensis, pode ser adicionada a sementes de plantas
que posteriormente terão a bactéria em seus sistemas vasculares. A
toxina bacteriana mata a larva da broca que se alimenta das plantas
inoculadas (
Questões de segurança e ética na engenharia genética
Dúvidas de segurança;
Razões da preocupação→” impossível provar que alguma coisa é inteiramente segura”
Temem→ técnicas de alteração podem tornar um organismo patogênico;
Laboratórios empregando técnicas de DNA recombinante→ atender rigorosos padrões de controle;
Evitar liberação acidental;
Redução de riscos→ Remoção do genoma microbiano;
“Genes de suicídio” (cumprir o propósito)
Sempre existirão dúvidas a respeito da segurança de qualquer tecnologia
nova, e a engenharia genética e a biotecnologia certamente
não são exceções. Uma das razões para esse tipo de preocupação
reside no fato de que é quase impossível provar que alguma coisa
é inteiramente segura sob todas as condições imagináveis.
A tecnologia genética suscita questões éticas: O aconselhamento genético estará disponível para todos? Diagnóstico de doença em feto; Decisões reprodutivas;
As culturas de alimentos alterados por engenharia genética devem ser seguras para consumo e para serem liberadas no meio ambiente.
O desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante está causando mudanças profundas na ciência, na agricultura e na saúde humana→ com base na capacidade de manipular o DNA com precisão.
Daqui a 30 anos→ Substituição das técnicas por novas.
Questões de segurança e ética na engenharia genética
Referências Bibliográficas:
TORTORA,G. J., FUNKE, B. R., CASE ,C. L. MICROBIOLOGIA. 10ª ed. São Paulo: Artmed, 2012.