Tecnologia da biologia celular

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Tecnologia da Biologia 
Celular e Molecular
Os conhecimentos sobre as células progridem
paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de
investigação. O aparecimento de numerosas técnicas de
uso comum e os diversos ramos da pesquisa biológica
levaram ao surgimento do que se costuma chamar de
biologia celular e molecular, que é o estudo integrado das
células, através de todo o arsenal técnico disponível.
Neste material serão incluídos apenas algumas técnicas
que têm contribuído para o progresso da biologia celular
e molecular.
O MICROSCÓPIO ÓPTICO OU 
MICROSCÓPIO DE LUZ
Limite de resolução e poder de resolução
Limite de resolução: é a menor distância
entre dois pontos que permite distinguí-los
separadamente.
Poder de resolução: é a capacidade de
fornecer imagens nítidas. Quanto menor o LR
melhor poder de resolução.
Fórmula para o cálculo do LR
LR = K/AN
AN = n.sen 
LR = limite de resolução
K = constante experimental
estimada em 0,61
 = comprimento de onda da
radiação
n = índice de refração do meio
 = ângulo formado pelo eixo
óptico da lente objetiva e o
raio de luz mais externo
utilizado na formação da
imagem.
Comprimento de onda da luz varia de 400 – 700 nm.
Comprimento de onda do elétron é de 0,005 nm.
Dica:
relação entre as unidades apresentadas abaixo:
1 mm = 1000 m (micrômetro); 1 m = 1000 nm
(nanômetro); 1 nm = 10 A (angstrom)
Olho humano 0,2 mm
Microscópio de luz 200 nm (0,2 m)
MEV 10 A (1 nm)
MET Ao redor de 1 – 2 A (0,1 – 0,2 nm).
Aspectos comparativos do LR
TIPOS DE MICROSCOPIA
MICROSCOPIA ÓPTICA (MO):
• Campo claro;
• Campo escuro;
• Contraste de fase;
• Contraste interferencial;
• Polarização;
• Fluorescência;
• Microscópio invertido;
• Microscópio estereoscópico;
• Confocal a laser.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA (ME):
• de varredura (MEV)
• de transmissão (MET)
MEV
MET
MO
Formação de imagens ao MO
A imagem final será
virtual, maior e
invertida em relação
ao objeto.
LENTES NO MO
LENTES NO MET
Processamento: MO MET MEV
Dimensão/corte Variável 1mm Variável
Fixação Aldeídos, 
Bouin
Aldeídos Aldeídos 
Pós-fixação OsO4 OsO4
Desidratação Álcool, 
acetona. 
Álcool, 
acetona.
Álcool, 
acetona.
Inclusão Parafina ou
Historesina
Epon, Spur 
ou Araldite
Secagem
Microtomia Micrótomo Ultra-
microtomo
Contrastação Coloração Pb, Uranila e 
etc
Evaporação 
com ouro
Etapas da 
preparação 
das amostras 
para MO. 
Etapas da 
preparação 
das amostras 
para a MET
- Navalhas
Aço
Vidro (1950)
Diamante e safira (1959)
PREPARO DAS NAVALHAS DE VIDRO
MICROTOMIA
NAVALHA DE DIAMANTE
3000 US$
Técnica de contrastação (Dupla contrastação)
Acetado de uranila
Citrato de chumbo
Solução a 2%
de 3 a 10 min.
e lavar 3
vezes em água
destilada.
Solução a 3% com
mesmo processo
anterior.
Somente Pb Uranila + Pb
Fígado de camundongo
Imagens ao MET
Raiz (glutaraldeído seguido por
tetróxido de ósmio).
Pâncreas de rato (glutaraldeído
(2,5%), cacodilato (0,1M),
acetato de uranila/citrato de
chumbo.
Célula de camundongo em 
apoptose mediada por LTC
MEV - UNICAMP 
Imagens ao MEV
CITOQUÍMICA
Citoquímica: compreende técnicas diversas para a identificação e
localização das moléculas que constituem as células
Ácido desoxirribonucléico (DNA): O DNA é demonstrado
citoquimicamente pela reação de Feulgen. Etapas:
• Mergulha-se as lâminas em solução aquecida de ácido clorídrico, o
que promove hidrólise das bases púricas, deixando livre as
extremidades da desoxirribose, que possuem radicais aldeídos;
• Trata-se o preparado pelo reativo de Schiff (solução de fucsina
básica descorada pelo anidrido sulfuroso), que, ao se combinar com
os grupamentos aldeídicos da desoxirribose, forma um complexo de
cor vermelha.
Polissacarídeos: um exemplo é a técnica para evidenciar o glicogênio
conhecida como técnica do PAS (periodic acid Schiff).
• A reação baseia-se na oxidação pelo ácido periódico, de
grupamentos OH vizinhos, formando grupamentos aldeídicos que dão
cor vermelha ao reativo de Schiff.
• A reação não é específica para glicogênio, de modo que se aplica um
artifício: tomam-se duas lâminas com cortes do mesmo tecido, uma
das quais é previamente tratada pela enzima alfa-amilase. Essa enzima
hidrolisa e remove o glicogênio. Portanto, a estrutura que aparecer
corada pelo PAS na lâmina não tratada pela alfa-amilase mas não
aparecer corada na lâmina tratada pela enzima é glicogênio.
A microscopia de fluorescência é geralmente aplicada com técnicas
citoquímicas
• A principal aplicação da microscopia de fluorescência ocorre em
combinação com métodos imunológicos, nas técnicas
imunocitoquímicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos
fluorescentes.
• A imunocitoquímica se baseia na reação antígeno-anticorpo, esta
técnica pode ser realizada aplicando-se a imunocitoquímica direta
(pouco sensível, e por isso, pouco usada atualmente) ou a
imunocitoquímica indireta (maior sensibilidade, permitindo a
demonstração de quantidades mínimas de antígeno, sendo a mais
usada na prática).
• Algumas substâncias podem ser utilizadas para marcar os
anticorpos, dentre elas: peroxidase, ferritina, anticorpo fluorescente,
complexo de ouro coloidal + proteína A (extraída das bactérias
Staphylococcus aureus).
Fonte de luz
Filtro de luz
Espelho difusor 
do feixe
Lente 
objetiva
Objeto
Filtro emissor
Técnica imunocitoquímica direta: O composto (precipitado) formado pela ação da
peroxidase sobre a 3-3’-diaminobenzidina é de cor marrom-clara e elétron-denso.
Por isso, a técnica pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica.
Imunocitoquímica direta com anticorpo
fluorescente
Etapas da imunocitoquímica indireta: Na etapa 1, o antígeno cuja localização se
deseja determinar combina-se com o anticorpo específico, formando um complexo
que não é visível nem no microscópio óptico, nem no eletrônico. A finalidade das
etapas seguintes é tornar esse complexo visível. Na etapa 2, agrega-se
antigamaglobulina marcada com peroxidase ao complexo já formado. Na etapa 3,
por meio da técnica citoquímica para peroxidase, forma-se precipitado visível nos
microscópios óptico e eletrônico, revelando-se assim o local onde está presente o
antígeno cuja localização era desejada.
Esquema para demonstrar a maior sensibilidade da imunocitoquímica
indireta. Pela técnica direta, esse antígeno celular fixaria quatro
moléculas do anticorpo; pela técnica indireta, ele fixou 20 moléculas
de antigamaglobulina.
Esfregaço da bactéria Klebsiella pneumoniae vista ao microscópio de fluorescência