Atividade de Estáfilococos

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Centro Universitário Hermínio Ometto de Araras
UNIARARAS
Gabriela Fernanda de Souza: 78068
Jeniffer Gabriela da Silva: 77377
Liliane Cristina: 
Luana Rogerio: 78886
Michaelle Rabelo: 
Thainá Abreu: 
Estaphylococcus sp. 
BIOMEDICINA NOTURNO
Relatório apresentado ao Curso de Biomedicina Noturno do Centro Universitário Hermínio Ometto, como parte da integrante da disciplina Processos patológicos bacterianos.
Professor: Célia.
ARARAS/SP
Setembro/2016
OBJETIVO
Realizar as técnicas de bacterioscopia, semeadura e testes bioquímicos com a finalidade de se obter as características morfotinturiais, o gênero e a espécie das bactérias que ajudam na identificação de microrganismos recorrentes de infecções a fim de auxiliar o diagnóstico do paciente e qual será o o antibiótico para o tratamento (no caso de infecções bacterianas). 
Metodologia
A identificação da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrição de suas características morfológicas, tintoriais, fisiológicas, bioquímicas e antigênicas (MURRAY et. al., 2002). 
A caracterização morfotinturial da bactéria semeada previamente em meio BHI sólido precedeu da seguinte forma: foi posto uma gota de água destilada estéril em uma lâmina, em seguida foi coletado uma colônia bacteriana isolada da placa, com o auxílio da alça de platina e homogeneizou a mistura bacteriana espalhada pela lâmina. A bactéria foi fixada com o auxílio do bico de Bunsen, tomando cuidado para não queimar a bactéria. Posteriormente foi feita a coloração de Gram.
Coloração de Gram:
1 – Cobrir o esfregaço bacteriano com cristal de violeta e deixar por um minuto;
2 – Despejar o conteúdo;
3 – Cobrir a lâmina com lugol e deixar agir por um minuto;
4 – Despejar o conteúdo;
5 – Tirar o excesso do cristal violeta da lâmina com álcool 95%;
6 – Lavar a lâmina com jato fraco de água;
7 – Cobrir a lâmina com fucsina por 30 segundos; 
8 – Despejar o conteúdo e lavar com água destilada; 
9 – Esperar a lâmina secar e fazer a leitura no microscópio; 
Com o auxílio da alça de platina, foram coletadas colônias isoladas no meio BHI para realizar a semeada através da técnica de esgotamento nos meios: Ágar sangue, ágar chocolate, ágar manitol, ágar MacConkey, a fim de identificar o gênero e espécie da bactéria. Estas placas foram deixadas na estufa a 37°C por 24 horas para observarmos o seu crescimento. 
A placas foram analisadas após o período de incubação e precedeu com teste bioquímico para a identificação da classe bacteriana (Staphylococcus ou Streptococcus).
 Teste da Catalase: uma gota de peróxido de hidrogênio 3% (H202) foi sobreposta sob uma lâmina e com o auxílio da alça de platina foi retirada uma colônia bacteriana isolada da placa BHI e a mesma foi homogeneizada com o H202 para que fosse observada a formação de bolhas (catalase positivo)
Provas para identificação da espécie do Staphylococcus:
 Coagulase: Em um tubo contendo coaguloplasma, foi acrescentado uma colônia isolada da bactéria. A amostra foi homogeneizada e incubada por 24 horas em estufa a 37°C. Após o período de incubação foi observado a formação, ou não, do coagulo. 
Testes de resistência a Novobiocina e Polimixina B: Perto do fogo do bico de Bunsen, as colônias bacterianas foram suspensas em solução fisiológica estéril, com auxílio da alça de platina até que o meio ficasse turvo. Foi espalhada a suspensão bacteriana com auxílio de um swab por toda a superfície da placa contendo meio Müller Hinton, a pinça foi flambada ao fogo e colocou os discos de Novobiocina e Polimixina B sobre a placa de forma que estivessem distantes um do outro. Incubou a placa por 24 horas a 37°C e realizou-se a leitura. As amostras resistentes mostraram zonas de inibição de 6 a 12 mm, enquanto as sensíveis apresentam halos acima de 12 mm. 
Antibiograma: As colônias bacterianas foram suspensas em solução fisiológica estéril com auxílio da alça de platina até que o meio ficasse turvo. A suspensão bacteriana foi espalhada com auxílio de um swab no meio Mueller Hinton, foi flambada a pinça no fogo para a esterilização e foram colocados os discos de ampicilina, penicilina, amicacina, cloranfenicol, amoxilina, cefalaxina no meio Müller Hinton, de modo que ficassem distantes uns dos outros. Incubou a placa por 24 horas a 37°C e realizou-se a leitura a fim de verificar quais os antibióticos são ativos contra a bactéria identificada na aula. 
RESULTADO E DISCUSSÃO
Bacterioscopia: 
Na bacterioscopia foi possível observar através da coloração de gram as seguintes características morfotinturiais: cocos gram negativos em agrupamentos semelhantes a cachos de uva, porém os cocos com essa disposição são gram positivos. Observando estas características foi possível detectar um erro durante a coloração de Gram, este erro se deve ao fato de utilizarmos o álcool 95% excessivamente para a descoloração, assim a bactéria gram-positiva que devia ser corada com cristal violeta (cor roxa) com o excesso de descoloração corou com fucsina (cor rosa), sendo observado ao microscópio a característica de gram negativas.
Semeadura da suspensão bacteriana em meios de cultura:
A semeadura da bactéria foi feita nos meios de cultura: ágar sangue, ágar chocolate, ágar Manitol e Mac Conkey. Os meios de ágar sangue e ágar chocolate foram utilizados por serem meios de enriquecimento, o ágar Manitol foi utilizado por ser especifico para Staphylococcus sp e o meio Mac Conkey foi utilizado por ser meio específico para Enterobactérias.
Imagem 1: Semeadura nos meios ágar sangue (A) e ágar chocolate (B).A
B
	No meio ágar sangue (imagem 1-A), foi possível observar que houver ß-hemólise, pois foi formado um halo ao redor das colônias, caracterizando a lise dos eritrócitos. Na imagem 1 B correspondente ao meio ágar chocolate foi observada colônias puntiformes e algumas contaminações que podem ser consequentes à esterilização insuficiente da alça, ou pela semeadura distante da zona considerada estéril ao redor da chama do bico de Bunsen.
Imagem 2: Semeadura no meio de cultura Mac Conkey.
Ao analisarmos o meio Mac Conkey foi possível observar que não houve crescimento bacteriano, então a suspensão bacteriana não era de enterobactérias, visto que este meio é seletivos a elas.
Imagem 3: Semeadura no meio de cultura ágar Manitol.
O meio ágar Manitol conhecido também como Salt Manitol é um meio que contém grande quantidade de sal. Quando é observado a mudança de coloração deste meio para amarelo, indica a fermentação do sal manitol feito por Staphylococcus aureus, mas no caso de nossa placa esse processo de fermentação não ocorreu, porém por ser um meio seletivo para Staphylococcus sp procedemos os testes bioquímicos para a identificação da espécie.
 
Provas bioquímicas
Teste da Catalase
A catalase é uma enzima intracelular, encontrada na maioria dos organismos. Ela decompõe o peróxido de hidrogênio – H2O2 (produto decorrente do metabolismo celular) em água (2 H2O) e oxigênio (O2). Os estafilococos possuem catalase e no teste são classificadas como catalase positiva, já os estreptococos não possuem catalase, sendo identificados no teste como catalase negativa.
Imagem 4: Teste da catalase
Nesse teste foi possível observar a formação de bolhas de oxigênio quando foi colocada uma amostra da bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio (catalase positiva), se tratando então de ser Staphylococcus sp. 
Teste da coagulase
Esse teste verifica se o microrganismo possui a coagulase ou um fator aglutinante, que, reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina, esse teste ajuda na identificação da espécie de Staphylococcus. Em nosso teste não foi observado coagulo. 
Disco de Polimixina e Novobiocina
	Nos discos de Polimixina e novobiocina foram observadas a formação de halos ao redor dos discos de polimixina e novobiocina. Para polimicina a bactéria demonstrou resistência,pois obteve diâmetro menor que 10mm e o disco de novobiocina apresentou um halo com um diâmetro maior que 10mm, demonstrando sensibilidade por este antibiótico.
Antibiograma: O antibiograma é um exame de diagnóstico que consegue identificar a bactéria que está causando a infecção no indivíduo, indicando também qual o antibiótico mais indicado para o seu tratamento.
No antibiograma foi observado que os antibióticos: penicilina, ampicilina, amoxicilina e amicacina apresentaram diâmetro do halo inferior ao considerado sensível, considerados então como resistentes. Os antibióticos ciprofloxacina e cloranfenicol apresentaram halos consideravelmente acima do diâmetro considerado sensível.
Considerando os testes realizados foi comparado os resultados à uma tabela para a identificação da espécie de Staphylococcus sp, foi possível chegar a conclusão que se tratava da espécie de S. epidermidis. 
O Staphylococcus epidermidis provoca um grande número de infecções hospitalares, geralmente está presente em feridas abertas e queimaduras, seu tratamento muitas vezes se torna difícil por suas características genéticas e sua crescente resistência aos antibióticos de alta potência.
CONCLUSÃO
Devemos ter cuidado na hora de realizar a coloração para observarmos as características morfotinturiais já que no laudo da bacterioscopia só é dado a sua coloração e morfologia. A identificação do gênero e espécie é realizada seguindo diversas provas bioquímicas e interpretações no crescimento em meios de cultura seletivos ou diferenciais e que estas provas mudam de acordo com o gênero da bactéria. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MURRAY, P.R. et al . Microbiologia médica. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,2002.