Aula 10 - Reti?culo endoplasma?tico e si?ntese proteica.docx

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Aula 10 – Retículo endoplasmático e síntese proteica
Maquinaria e conceitos relacionados à síntese de proteínas e macromoléculas: RNAm, CAP, 7-metil-guanosina, poliA, promotor, operador, códon inicial, ribossomo, RE, aparato de Golgi (secreção ou armazenamento) e membrana plasmática (para onde parte das proteínas é encaminhada através de vesículas de transporte).
A síntese de proteínas pode ocorrer tanto no RE como no citoplasma, em eucariotos.
Via biossintética secretora: inicia-se com a informação no citoplasma que interage com o ribossomo, modificando-o. Como a sequência linear e estrutural da molécula não é suficiente para interação efetiva, há diversas outras moléculas que atuam como intermediárias no processamento, passando pelo RE e pelo aparato de Golgi, a partir do qual será definido o destino da molécula. 
Código genético universal e degenerado: além de o código ser o mesmo para diversos organismos, vários códons associam-se ao mesmo aa, o que impede que mutações pontuais se propaguem e prejudiquem o organismo. No entanto, dependendo de onde ocorre a mutação, há uma probabilidade de manifestação de problemas na síntese de proteínas. O mecanismo eficiente que evita a inativação da proteína, só não tem efeito em caso de deleção e de inserção, por afetar as bases consecutivas. Cabe ressaltar, que a troca de um aminoácido implica na alteração da cadeia lateral e, por consequência, da estrutura planar da proteína. Nesse sentido, destaca-se que a conformação da proteína é mais relevante que ligação covalente de seus aminoácidos, bem como a existência de mecanismos alostéricos a partir dos quais a célula identifica, degrada e recicla as proteínas mutadas.
Trajeto a ser estudado nessa aula: núcleo ribossomo citoplasma (endossoma) RE (transporte não-vesicular). As etapas posteriores envolvem transporte vesicular e, portanto, proteínas motoras, que interagem com o citoesqueleto.
Dogma central: DNA (transcrição) RNA (tradução) proteínas. Processo cíclico.
Transcrição e processamento de material genético transcrito são feitos no núcleo.
Síntese de proteínas pós-transcricional: a mensagem contida no cístron (porção do DNA que contém a informação genética necessária à síntese proteica) é transcrita pelo RNAm, a partir das fitas de DNA separadas pela helicase. Nesse processo, as bases pareiam-se: a adenina do DNA se liga à uracila do RNA, a timina do DNA com a adenina do RNA, a citosina do DNA com a guanina do RNA, e assim sucessivamente, havendo a intervenção da enzima RNA-polimerase. A sequência de três bases nitrogenadas de RNAm, forma o códon, responsável pela codificação dos aminoácidos. Dessa forma, a molécula de RNAm replica a mensagem do DNA, migra do núcleo para os ribossomos, atravessando os poros da membrana plasmática e forma um molde para a síntese proteica.
Ribossomo: estruturas celulares que contêm RNA autocatalítico e que são compostas por duas subunidades, uma maior e outra menor. A menor apresenta uma unidade de RNAr 18S (região codificante no DNA ribossômico) e contém três proteínas. A maior, por suas vez, apresenta três unidades de RNAr (28S, 5S e 5,8S), além de 49 proteínas. A associação dessas unidades é feito no nucléolo, uma região nuclear densamente proteica. Esses ribossomos se associam no momento da síntese proteica e aparecem sob a forma de polissomos (ribossomo + RNAm). Podem ser encontrados livres no citoplasma ou associados ao RE, sem qualquer distinção.
Plasmócito: estado de diferenciação de linfócito que produzirá anticorpos. É basicamente RE e mitocôndria, pois produz proteínas em larga escala.
Não existem dois retículos. Trata-se de apenas um que se modifica constantemente, por meio da adesão ou liberação de ribossomos de suas paredes.
Todas as fitas são sintetizadas no sentido 5' 3', tanto no DNA quanto no RNA.
Os ribossomos maior e menor são complexos de material genético e de proteínas que se acoplam no momento da tradução. O acoplamento não é único (polissomos), de modo que múltiplos ribossomos traduzem a mesma fita de RNAm, aumentando a eficiência da produção da proteína. Essa eficiência, por sua vez, será modulada por agentes de controle, e dependerá da vida útil do RNAm, dada por suas extremidades: o capacete (CAP) do RNA é uma modificação que ocorre na sua extremidade 5’, conferindo a essa molécula uma maior estabilidade, pois protege-a da ação de fosfatases e nucleases (5’-exonuclease). Além disso, o CAP 5’ aumenta a chance desse RNAm ser capturado pelos sistemas eucarióticos de tradução, levando a uma maior produção de proteínas. Além dos CAPs, a maioria dos RNAs eucarióticos são alterados de forma a conter uma cauda de poliadenilato na sua extremidade 3’, resultante da adição de nucleotídeos contendo a base adenina, por meio de uma enzima polimerase poli-A, dependente de ATP. Nessa cauda estão presentes cerca de 200 aas, que se enrolam ao redor de várias cópias de uma proteína ligadora. Essa cauda tem a função de atuar como acentuadora da tradução, proteger o mRNA da digestão por nucleases presentes no meio e proporcionar uma maior estabilidade à molécula. Especula-se que ela também tenha um papel importante no transporte do mRNA para o citoplasma. Qualquer mudança nessas estruturas promove degradação do RNA. Em meio ao processo de tradução, o CAP 5’ resiste à 5’-exonucleasese, a cauda poli-A é removida com o tempo por 3’-exonucleases e as endonucleases fazem a remoção pelo meio. A não degradação da extremidade 5’ decorre da adição de 7-metil-guanosina, extremamente modificada, o que faz com que a sua ponta fique ao contrário (na realidade, quando a 7-metil-guanosina se liga, uma hidroxila livre direciona-se para um lado específico que a indisponibiliza), impedindo a identificação dessas porções pela enzima.
A formação do CAP exige uma série de alterações químicas na estrutura do RNA, que apresenta a extremidade 5’ com 3 fosfatos. Primeiramente, um fosfato da extremidade 5’ do RNA deve ser liberado por hidrólise, gerando uma extremidade 5’ difosfato. Essa extremidade difosfato deve então se ligar a um átomo de fósforo de um GTP, gerando uma ligação incomum 5’-5’ trifosfato. O nitrogênio que se encontra na posição 7 da guanina da extremidade deve então sofrer uma metilação, mediada pela enzima metil-transferase. As riboses dos dois primeiros nucleotídeos do RNA podem ou não ser metiladas (opcional) na extremidade 2'-OH. RNA pol II – CAP enzyme complex.
Procariotos têm cauda poli-A. 
RNAm é uma fita alongada contendo os códons (código genético). O RNAt, por sua vez, apresenta diversas dobras e duas regiões especiais: CCA 3’, que reconhece o aminoácido, e anticódon, complementar ao códon.
Síntese de proteínas simplificada em 4 etapas: ativação dos aas, inicialização, elongação e terminalização.
Ativação dos aminoácidos: nessa etapa, o RNAt leva os aminoácidos dispersos no citoplasma, provenientes da digestão, até os ribossomos. Em uma das regiões do RNAt está o anticódon, uma sequência de três bases complementares ao códon de RNAm. A ativação dos aminoácidos é dada por enzimas específicas, que se unem ao RNA transportador, levando à formação do complexo aa-RNAt e dando origem ao anticódon, um trio de códons complementar aos códons do RNAm. Dessa forma, o aa será associado a um RNAt específico por meio de uma reação catalisada pela enzima aminoacil RNA sintetase, que forma uma ligação éster. Cabe ressaltar que o sítio de ligação do aa é o mesmo para todos RNAt, de modo que o que os diferenciará será o meio enzimático de efetivação da ligação. Para que esse processo ocorra é preciso haver energia, que é fornecida pelo ATP. Uma mutação em uma enzima provoca a não ativação de um aa específico, o que implica a interrupção da síntese proteica e diversas problemas metabólicos.
Inicialização: a maquinaria responsável pela produção da proteína, começa a se associar a fita de RNAm. Nesse sentido, o CAP, além de impedir que o RNA seja degradado na extremidade 5’, sinaliza para que a maquinaria de iniciação encontre o RNAm. Sendo assim, senão houver CAP, o RNAm não será identificado e não haverá síntese proteica. No caso, há associação do RNAt iniciador carregando metionina à subunidade menor do ribossomo e ao RNAm, por meio do reconhecimento da 7-metil-guanosina. Em seguida, por meio do gasto de energia, esse complexo iniciador desloca-se até o códon AUG. Cabe ressaltar que essa maquinaria simples é regulada, de modo que somente no AUG há acoplamento da subunidade maior do ribossomo, após a associação de diversos fatores de iniciação.
Fatores de iniciação: dois fatores de iniciação entram e saem do ribossomo a cada ciclo, cada um hidrolisando GTP em GDP e levando a modificações conformacionais no processo. O EIF2 e o EIF2B associam-se por fosforilação para formar um complexo inibidor da tradução, com gasto de GTP (esse complexo não é dissociável enquanto o EIF2 encontra-se fosforilado). Desse modo, para que o complexo se associe ao RNAt ligado à metionina – primeiro aa a ser adicionado –, é necessário que o EIF2B se desassocie por ação de uma fosfatase, liberando EIF2-GTP. Caso falte metionina, a tradução não irá se iniciar e o RNAm vai se degradar com o tempo, não havendo síntese proteica. Este complexo sofre, então, mudanças em sua conformação, permitindo o ancoramento da subunidade menor do ribossomo. Em seguida, há a associação do EIF3 e por fim do EIF 4, tornando o complexo capaz de identificar a 7-metil-guanosina, isto é, o CAP, e acoplar-se a ele. Caso haja alguma mutação em qualquer um dos EIF, a síntese não ocorrerá por não haver associação do complexo ao CAP. Finalmente, por meio do gasto de energia, esse complexo iniciador desloca-se até o códon AUG, onde sofre mudanças conformacionais que estimulam a estrutura terciária do ribossomo. A subunidade maior é então atraída, encaixando-se ao complexo e modificando a subunidade menor do ribossomo, de modo que todos os fatores de tradução se desassociam e ficam disponíveis para um novo ciclo. 
EIF é um mecanismo eucarioto, de modo que nem todos organismos usam esse sistema complexo, sendo, portanto, CAP independentes. Muitos apresentam uma sequência IRES (internal Rb entry site) e ITAFs (IRES trans-acting factors), de modo que há acoplamento direto dos ribossomos e início da tradução.
O vírus, por sua vez, não tem maquinaria, de modo que ao entrar na célula, passa a utilizar sua maquinaria para replicação do material genético. A subunidade menor que atuará na tradução é, portanto, a da célula hospedeira, seja ela qual for.
ELONGAÇÃO: um ribossomo contem quatro sítios de ligação para moléculas de RNA, sendo um para o RNAm e três (denominados sítios A, P e E) são para RNAt. Uma molécula de RNAt adere fortemente aos sítios A e P apenas se seus anticódons formam pares de bases com o códon complementar. Uma vez que a síntese de proteína tenha sido iniciada, cada novo aa é adicionada à cadeia em extensão em um ciclo de reações contendo quatro passos principais: ligação do tRNA, formação da ligação peptídica, translocação das subunidades maior e menor. Como resultado dos dois passos de translocação, o ribossomo completo move-se três nucleotídeos sobre o mRNA e é reposicionado para dar início ao próximo ciclo. No passo 1, um RNAt carregando o próximo aa da cadeia liga-se ao sítio RNA ribossomal, formando pares de bases com o códon do RNAm posicionado. Dessa forma, os sítios P e A contêm RNAt adjacentes ligados. No passo 2, a extremidade carboxila da cadeia polipeptídica é liberada ao tRNA no sítio P e ligada ao grupo amino livre do aa ligado ao RNAt do sítio A, formando uma nova ligação peptídica. Essa reação central da síntese é catalisada por uma peptidil-transferase contida da subunidade ribossomal maior. No passo 3, a subunidade maior se move em relação ao RNAm que está preso à subunidade menor, o que interfere nas hastes aceptoras dos dois RNAt que se encontram nos sítios E e P na subunidade maior. No passo 4, outra série de modificações conformacionas move a subunidade menor e o RNAm a ela conectado exatamente três nucleotídeos, reposicionando o ribossomo de tal forma que ele está pronto para receber o próximo aminoacil-RNAt. O crescimento se dá, portanto, da extremidade amino à carboxílica, e cada passo envolve o gasto de um equivalente de ATP.
TERMINALIZAÇÃO: a ligação de um fator de liberação, eRF em eucariotos, no sítio A sobre um códon de terminação (UAA, UAG e UGA), para os qual não há anticódon correspondente, finaliza a tradução. O polipeptídeo completo é liberado e, após uma série de reações que necessitam de proteínas adicionais, dentre as quais a centro-peptidil-transferase do ribossomo (para hidrólise de uma ligação éster), e hidrólise de GTP, o ribossomo se dissocia em duas subunidades. Cabe ressaltar que os fatores de terminação são constitutivos, permanecendo, pois, até a degradação do RNAm.
Em bactérias, existem proteínas sintetizadas independentemente de ribossomos, que são os peptídeos não ribossomais (NRP), como sideróforos, toxinas ou pigmentos. Sendo não ribossomal, ela também é não RNA e não DNA. A síntese, nesse caso, envolve a atividade de uma peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS), independente de RNAm. Além disso, envolve enzimas dividas em módulos rearranjáveis, as quais catalisam, cada uma, ligações peptídicas específicas para um aa.
Conforme apresentado anteriormente, além da síntese proteica citoplasmática, há a reticular. O reticulo endoplasmático é um sistema ramificado, que se interconecta e delimita um espaço luminal. O RE rugoso (granuloso), mais distendido e volumoso, apresenta ribossomos aderidos na membrana (síntese de proteínas), enquanto o  RE liso não os contêm (síntese de esteroides). Ao contrário do que se imagina, os RE rugoso e liso compõem um retículo único e extremamente dinâmico. Desse modo, balanço entre a composição lisa e rugosa depende, portanto, da função celular desempenhada. O reticulo é contínuo com a membrana nuclear, de modo que não há diferença significativa de composição entre os dois (diferem apenas na composição proteica). O RE apresenta ainda poros, denominados translocons, que servem como canais para a produção interna da proteína ou sua inserção na membrana.
Os ribossomos podem, portanto, ser encontrados livres, atuando na síntese de proteínas citoplasmáticas e nucleares, ou aderidos ao RE, produzindo proteínas com destino ao processamento pós-traducional.
Hipótese de sinal: o RNAm para proteínas secretoras contém uma sequência de códons sinais, que não o compõe funcionalmente, e a tradução deles para o início da síntese protéica acontece nos polissomos livres do citoplasma. Dessa forma, os polissomos livres são trazidos para o RER para iniciar o processo de descarga unidirecional, ocorrendo, para isso, a ligação do peptídeo sinal e da subunidade menor do ribossomo com uma partícula citoplasmática denominada partícula de reconhecimento do sinal (PRS), com consequente interrupção da tradução (não há descoplamento). Ao chegar ao translocon (como chega, não se sabe), ocorre a associação do complexo a um dos diversos receptores para PRS e para o ribossomo presentes no RE, de forma a aproximar o ribossomo do translocon. Essa aproximação promove uma mudança conformacional que implica na dissociação da PRS, que torna-se disponível para reconhecer outro sinal, bem como o reinício da tradução e a inserção da sequência no translocon. A maioria dos aminoácidos encontrados em sequências de sinal, cadeias laterais hidrófobas (leucina e valina), geram conformações que favorecem a penetração na dupla camada lipídica do RER. Quando a cadeia de polipeptídeos atravessa a membrana do RER, ocorrem modificações importantes, como a remoção do peptídeo de sinal antes do término da síntese protéica, por meio de uma peptidase sinal presente no lúmen. Ao fim da tradução, a proteína sintetizada é liberada no lúmen do RE e o que define se um ribossomo ficará livre ou aderido ao retículo é o tipo de proteína (com ou sem seqüência de sinal) que ele estiver sintetizando naquele momento.
Nota-se que a síntese relatada é majoritariamentehidrofílica, havendo, pois, dobramento das regiões hidrofóbicas.
Direcionamento e redirecionamento: nem todas as proteínas direcionadas ao RE são liberadas no lúmen. Algumas destas proteínas permanecem na membrana do RE, como as proteínas transmembranas. O processo de translocação destas proteínas é mais complicado do que o das proteínas solúveis, pois enquanto parte dela é translocada pela bicamada lipídica, outra fica presa à membrana do RE. As proteínas transmembranas, caracterizadas pela presença de regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, apresentam dobramentos significativos em sua região hidrofóbica durante a síntese ribossomal, em razão do caráter hidrofílico do translocon. Isso promove uma tensão nas paredes do canal, de modo que elas se afastam e se abrem para uma região hidrofóbica. Torna-se possível, assim, a ocorrência do efeito hidrofóbico, com junção das estruturas apolares. Por consequência, a tensão é aliviada e o translocon se fecha. A parte hidrofílica da proteína transmembrana vai para o lúmen, a parte hidrofóbica para a membrana e o restante continua sendo sintetizado, externamente ao RE. Caso haja mais regiões hidrofóbicas, o processo se repetirá. Esse mecanismo é válido para proteínas hidrofóbicas (mas, no caso, não haverá extremidades hidrofílicas expostas), transmembrana unipasso e transmembrana multipasso.