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Aula 12 – Aparato de Golgi, glicosilação e secreção celular
Toda secreção associa-se, direta ou indiretamente, ao RE e regula a extensão de suas regiões lisas e rugosas. O RE relaciona-se à síntese de proteínas citoplasmáticas e nucleares, que podem ou não encaminhadas por meio de vesículas ao processamento pós-traducional no aparato de Golgi.
Assim como o RE, geralmente existe apenas um complexo de Golgi por célula, localizado próximo ao RE e ao núcleo. Diferente do RE, com sua rede contínua de túbulos, o complexo de Golgi é formado por lamelas (ou cisternas) que não são contínuas. As vesículas que trazem material do retículo se incorporam à primeira rede de túbulos do Golgi e daí atingem a primeira lamela. O complexo de Golgi é muito polarizado, isto é, tem uma face diferente da outra. As vesículas que vêm do retículo sempre se incorporam ao Golgi pelo mesmo lado. Esse lado de “entrada” do Golgi, que recebe material do RE, é chamado lado (ou face) cis (mais alcalino), enquanto a outra extremidade, mais distante do retículo, o lado de “saída” do Golgi, é o lado (ou face) trans (mais ácido). O número de lamelas entre uma extremidade e outra varia de célula para célula, mas obedece a uma configuração mínima formada por: rede cis do Golgi, ou CGN, lamela cis, lamela medial, lamela trans e rede trans do Golgi, ou TGN. Diversas vesículas trafegam no Golgi e do Golgi para o RE. O tráfego é bidirecional, tanto anterólogo como retrógrado. As vesículas que trafegam no Golgi por clatrina (adaptina tipo 1) ou do Golgi para o RE por COP I (Sarl).
O complexo de Golgi tem três funções principais: realizar a glicosilação, isto é, adicionar açúcares a proteínas e lipídeos que foram sintetizados no RE, assim modificando-os; adicionar grupamentos sulfato a proteínas, participando da síntese de proteoglicanas; distribuir as macromoléculas provenientes do RE e que percorreram o complexo de Golgi entre três possíveis destinos: membrana plasmática, onde tais moléculas se incorporarão ou serão secretadas; vesículas de secreção que se acumulam no citoplasma esperando um sinal para exocitarem seu conteúdo; lisossomos, onde formarão a própria membrana da organela ou terão papel na digestão intracelular.
O Golgi promove a variabilidade proteica no decorrer do processamento, de modo que, caso a proteína não sofra modificações pós-traducionais, ela se manterá altamente específica. O Golgi é ainda responsável pela biogênese dos lisossomos e pela secreção (exocitose) de macromoléculas.
Cada região do Golgi induz modificações específicas, a partir de uma sequência organizada de processamento de proteínas e lipídios. As moléculas são modificadas em estágios sucessivos a medida que avançam as cisternas: rede cis (fosfatase), cisterna cis (manosidades I e II), cisterna média (manosidase III, N-acetil-glicosamina transferase), cisterna trans (galactosiltreansferase), rede trans (fosfatase ácida tiamina-pirofosfatase, TPPase, nucleosídeo fosfatase, NDPase, sialiltransferase e sulfatase).
Como se chegou a essas conclusões? Marcação de enzimas com ouro coloidal e MET.
Movimento anterólogo se dá de cis para e trans, e o retrógrado de trans para cis.
Chegando à rede cis do Golgi, a glicoproteína já tem pronta a cadeia protéica, claro, mas a porção glicídica ainda está em construção. Nessa altura, o açúcar final da árvore glicídica do tipo N é manose, pois três glicoses e uma manose já haviam sido removidas no RE. Antes de continuar acrescentando açúcares, as enzimas da rede cis e da lamela cis ainda retirarão mais manose (três removidos pela manosidase I e dois pela II). A glicoproteína sairá, assim, da lamela cis e, contida numa vesícula, será levada à lamela medial. Lá, vai encontrar enzimas que farão um balanço entre colocar e retirar açúcares, de modo que a cadeia ainda não vai crescer, mas sofrerá modificações. Isso feito, a glicoproteína sairá da lamela medial, mais uma vez a bordo de uma vesícula, e chegará à lamela trans. Na lamela trans, mais açúcares serão acrescentados, e aí a árvore glicídica vai finalmente crescer de novo. Além de outra N-acetilglucosamina, serão adicionadas galactoses. A glicoproteína continuará percorrendo a lamela trans e atingirá a rede trans, onde o último açúcar da árvore será adicionado: o ácido siálico (ou ácido N-acetil-neuramínico, conhecido pela sigla do inglês NANA). O ácido siálico tem enorme importância porque, além de ser um monômero polar, como os outros açúcares, ele tem carga negativa. Assim, ao terminar em ácido siálico, uma glicoproteína passa a ser uma molécula negativa em pH fisiológico, independente da sua porção protéica.
Resumindo, o processamento de macromoléculas envolve a glicosilação tipo O, sulfatação e fosforilação. A diferença de pH entre as cisternas está relacionada ao funcionamento das enzimas. O Golgi controla o pH por meio de um proteína denomina próton ATPase que consome ATP internaliza prótons, mantendo o pH constante.
A glicosilação no aparato de Golgi, diferentemente da do RE, envolve a transferência de apenas um monossacarídeo a cada reação, tendo como resultado a síntese de oligossacarídeos O-ligados e modificações das cadeias N-ligadas dos oligossacarídeos do RE. Essas modificações são relevantes na medida em que implicam mudanças na estrutura quaternária de glicoproteínas, relacionam-se com a adesão e com a sinalização celular, além de proporcionarem resistência à digestão proteica.
A síntese de oligossacarídeos O-ligados, na cisterna cis, envolve a adição de N-acetilgalactosamina ao radical OH da serina ou treonina da proteína. Além disso, monossacarídeos são adicionados sucessivamente nas cisternas até a formação de um oligossacarídeo.
A sulfatação, por sua vez, caracteriza-se pela adição de sulfato nas cadeias glicídicas ou nos resíduos de tirosina, tendo o PAPS (3-fosfoadenosina-5 fosfosulfato), que é transportado para a luz do CG na rede trans, como doador do sulfato. A presença de sulfato confere cargas negativas aos proteoglicanos e a outras proteínas secretadas, aumentando a solubilidade geral e a dispersão dessas moléculas. 
A fosforilação envolve a adição do resíduo de manose-6-fosfato para o endereçamento de enzimas com destino aos lisossomos. Algumas das enzimas responsáveis por tal processamento são a N-acetilglicosamina fosfotransferase e a fosfodiesterase, que adicionam fosfato nos resíduos de manose dos oligossacarídeos N-ligados.
Mas qual a importância de fazer essas modificações conformacionais na estrutura da proteína? A estrutura quaternária tridimensional de uma molécula é mais importante do que a própria sequência da molécula, porque caso ela esteja com a sequência errada, mas a estrutura correta, ainda é possível que a proteína seja capaz de desempenhar sua função, uma vez que erro pode não estar no sítio de atividade. Quando ocorre o contrário, no entanto, a proteína perde sua funcionalida, sendo encaminhada ao proteasoma, onde é degradada e os aa são reaproveitados.
Dependendo da molécula, a quantidade de açúcar presente na proteína pode implicar em interpretações celulares diferentes.
A cobertura de açúcar é essencial para evitar a degradação. Como os nossos órgãos que tem o lúmen cheio de enzimas se protegem da degradação de proteínas na superfície da célula? Suas células são altamente glicosiladas. O açúcar impede, portanto, que enzimas proteolíticas entrem em contato com a célula. É isso, por exemplo, que impede a degradação da membrana lisossomal.
Caso o lisossomo fosse rompido, a célula não é degradada, devido a diferença entre o pH citoplasmático (aproximadamente 7,4) e o pH de atuação das enzimas lisossômicas. (aproximadamente 5). Ela, no entanto, morre, em razão da inexistência de lisossomo para processar todas as moléculas necessárias para o seu metabolismo. A célula, ao captar nutrientes, os cliva no lisossomo e os libera para o interior da célula. Apenas protozoários de vida livre liberam excretas diretamente nesse processo, de modo que, caso a célula humana processe algo que não seja capaz de digerir, elamorre ou acumula.
Para o Golgi ler essas manoses, é necessário que a configuração dessas moléculas seja precisa: o Golgi só consegue ler moléculas que se diferenciam das que não podem ser lidas por um único radical de açúcar que é removido na saída do RE.
Na região trans ocorre adição de manose 6-fosfato às enzimas lisossomais (marcador de enzimas lisossomais), além das outras transferências supracitadas.
Na região trans as proteínas são selecionadas para serem secretadas especificamente por meio de vesículas mediadas por Rab.
Nem todas as proteínas são glicosiladas.
Como proteínas residentes do RE que são mandadas para o Golgi retornam ao RE? Na membrana do RE há a proteína oligossacaril transferase, que transfere os blocos de açúcar para as proteínas que estão sendo sintetizadas dentro do translocon. Quando há brotamento de vesícula do RE para o Golgi, há uma grande probabilidade de a oligossacaril transferase ser engoblada, de modo que seria necessário que essas enzimas fossem ressintetizadas para reposição. Isso, no entanto, é inviável devido à elevada quantidade de moléculas englobadas. Em razão disso, todas as proteínas do RE possuem uma sinalização, que não compõe a proteína em si, mas indica que a proteína é reticular. Essa “etiqueta” é dada por quatro aminoácidos representados pela sequência KDEL: lisina, asparagina, ácido glutâmico e leucina). Todas as cisternas do Golgi apresentam receptores para a sequência KDEL, de modo que é muito provável que uma proteína contendo a sequência KDEL e que tenha sido encaminhada equivocadamente ao Golgi se ligue a eles e seja encaminhada ao RE por brotamento de vesícula. Esse mecanismo é reconhecido como tráfego retrógrado.
Transporte anterógrado: do RE ao Golgi e da membrana plasmática ao Golgi.
Transporte retrógrado: redireciona as proteínas do RE de maneira inversa ao tráfego de vesículas (KDEL – Lis-Asp-Glu-Leu). 
As proteínas luminais do RE apresentam a sequência KDEL, enquanto as proteínas transmembranares contêm a sequência KKXX.
Fibrose cística: doença genética autossômica recessiva que afeta indiretamente a secreção celular, uma vez que a proteína reguladora da transferência de íons Cl-. Como consequência, há um distúrbio funcional das glândulas exócrinas (glândulas produtoras de muco), devido a alterações no transporte de cloro na membrana celular, que ficam retidos. O defeito ocorre em um gene localizado no braço longo do cromossomo 7. Este gene é responsável pela síntese de uma proteína, a CFTR (Cystic Fibrosis Tranmembrane Conductance Regulator), que se localiza na membrana celular. Assim, enquanto nas células normais, o canal do cloro, quando estimulado pelo AMPc ou pelo cálcio (Ca) ionóforo, se abre dando saída ao cloro, na fibrose cística, o canal do cloro não responde ao estímulo do AMPc, somente os canais estimulados pelo Ca ionóforo se abrem, determinando uma diminuição relativa da permeabilidade ao íon cloro. A menor saída de Cl da célula traz como consequência uma maior reabsorção de Na+2 para manter o equilíbrio. Uma das consequências é a sudorese salina, acompanhada da formação de cristais na pele.
O RE é a organela central das vias secretoras e constitutivas, pois a proteína que será modificada é produzida nele. Se não houver produção ou tráfego de macromoléculas a partir do RE, o Golgi perde sua funcionalidade, pois nenhuma outra estrutura célula encaminha moléculas para ele.
Já no Golgi, temos dois tipos de secreção: a constitutiva, que ocorre o tempo todo (exocitose direta), e a regulada, na qual a molécula só é secretada na presença de um mediador ou sinal (aguarda no citoplasma).
Vesículas secretórias brotam do Golgi e liberam seu conteúdo no meio extracelular. As vesículas de secreção em células especializadas aguardam próximo a membrana até a sinalização para liberação de seu conteúdo (mastócitos).
Algumas pessoas são picadas por um inseto e não apresentam reações significativas. Outras são picadas e ficam com uma pata de elefante. Então qual a diferença? A diferença está na presença de uma célula denominada mastócito no tecido epitelial. Na superfície dos mastócitos existem globulinas que são receptores para diversos antígenos. Quando o mosquito pretende picar uma pessoa, ele se guia por CO2, faz uma leitura do nosso corpo, identifica as artérias mais superficiais e insere trombócitos em nossa pele, de modo que, no momento da picada, uma série de enzimas da saliva do mosquito (anestésicas, anti-hemostáticas e vaso dilatadoras) é liberada. Após isso, ele vai embora, e as proteínas colocadas na nossa pele farão contato com mastócito. Caso ele seja muito sensível, assim que houver contato com as proteínas do inseto, o mastócido ficará doidão, liberando diversas vesículas. O principal mediador do mastócito é histamina, promovendo diversos colaterais. Em outros casos o mastócito é pouco sensível, não haverá grandes efeitos.
Proteínas de cobertura: clatrina, COP I e COP II. Promovem a formação de vesículas, que desenvolvem processos de seleção da proteína a ser carregada e de fusão da vesícula (somente na membrana do compartimento-alvo). Selecionam as proteínas específicas em locais da membrana doadora e moldam a membrana de forma curva para iniciar o brotamento.
Clatrina: proteína de brotamento com enriquecimento e elevada especificidade do conteúdo englobado, além de um esqueleto triplo com três cadeias pesadas (grandes) e três cadeias leves (pequenas). A clatrinas purificadas em água formam espontaneamente estruturas esferoideas, como hexágonos e pentágonos. Brotamento de vesícula rápido e enriquecido.
COP: formam de vesículas revestidas por coatômeros, COP I (brotam do CG - transporte anterógrado e retrógrado - e COP II - brotam do RE, RE - CG). Também reconhecem as moléculas a serem transportadas, apresentando um mecanismo semelhante ao das clatrinas.
Mas como ocorre o brotamento? Os receptores da proteína que devem sair são, por exemplo, específicos para o brotamento de clatrina. A COP, portanto, não pode se associar a ele, porque a cauda desse receptor não o permite. Além disso, a clatrina não se associa diretamente à cauda do receptor, mas precisa de uma proteína adaptadora denominada adaptina, que pode ser tanto do tipo I (Golgi), quanto do tipo II. Na cisterna trans, as moléculas se associam aos seus receptores no lúmen do Golgi, de modo que a cauda do receptor, fora do Golgi, muda de conformação. Essa alteração permite a associação da adaptina à cauda do receptor, e da clatrina à adaptina. Quando a clatrina se encaixa nas adaptinas, ela vai evaginando a membrana e promovendo a formação da vesícula. 
O detalhe é: como para montar a vesícula a clatrina sobrepõe suas projeções, a distância entre os vértices é muito pequena, de modo que há muito mais proteínas sendo transportadas do que uma vesícula por COP, que é grande, linear e apresenta uma associada ao extremo da outra. 
Sistema nervoso central: secreção o tempo todo, síntese o tempo todo, processamento de moléculas o tempo todo, membrana plasmática polarizando e despolarizando o tempo todo e tráfego de vesículas o tempo todo. Quando pensamos na conexão nervosa, na qual a transmissão a partir de um neurotransmissor, como a dopamina, de uma célula para outra, abordamos todo esse mecanismo estudado.
Outro exemplo são as dinaminas, GTPases que participam da formação de vesículas, tanto na membrana celular quanto no complexo de Golgi. Nos estágios finais da formação da vesícula, a dinamina se polimeriza ao redor do pescoço que liga a vesícula à membrana, formando um anel helicóide, e começa a hidrolisar GTP. A energia da hidrólise habilita um mecanismo que faz com que o pescoço se rompa separando a vesícula (fissão). Ela funciona, de fato, como uma mola que, por meio do gasto de uma molécula energética, contrai e estica, promovendo o colapso vesicular da membrana. Existem, no entanto, vesículas como as COPI e COPII que aparentemente são capazes de se separar sem a necessidade de uma GTPase como a dinamina.
Não há brotamento de membrana por clatrinanem COP em região de lipid raft, pois, para que esse fenômeno ocorra, a fluidez da membrana é fundamental. Nesses casos o brotamento é feito por meio de caveolinas, sendo mais lento e, por isso, menos específico.
Célula de Schwann é um tipo de célula glial que produz a mielina que envolve os axônios dos neurônios no sistema nervoso periférico, isolando eletricamente os nervos e assim permitindo a propagação rápida de potenciais de ação. Nas células motoras, o impulso para contração se dá a partir da liberação de acetilcolina na sinapse. Já glicina é liberada por interneurônios que limitam a ativação de neurônios motores e possibilitam o relaxamento muscular.
Funcionalmente, as proteínas de vesícula sinápticas são separadas em dois grupos: o das proteínas de transporte que executam a captação de neurotransmissores e outros componentes para dentro das vesículas (bomba de prótons, transportadores de neurotransmissores, transportadores de cloreto e zinco, etc.), e o das proteínas de tráfego que atuam no tráfego intracelular de vesículas sinápticas (proteínas Rab, sinapsinas, anfifisina, AP2, dinamina, dineína, etc.).