ESTUDO MOLECULAR FILOGÊNICO E BIOGEOGRÁFICO DE TARTARUGAS (TESTUDINES TESTUDINIDAE) BASEADO EM BANCO DE DADOS GENÉTICO

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ESTUDO MOLECULAR FILOGÊNICO E BIOGEOGRÁFICO DE TARTARUGAS (TESTUDINES: TESTUDINIDAE) BASEADO EM BANCO DE DADOS GENÉTICO
Nome: 
Período: 5º Ciências Biológicas
Introdução
A genética molecular vem progredindo e possibilitando o desenvolvimento de métodos para caracterizar geneticamente indivíduos e populações. O uso de marcadores moleculares de DNA deu origem à taxonomia molecular. E tornou cada vez mais difícil descrever espécies baseadas apenas em morfologia. Apesar das divergências entre taxonomistas e moleculares o uso integrado de dados genéticos e morfológicos podem fornecer informações mais consistentes na delimitação de espécies. O uso de marcadores de DNA em sistemática filogenética abriu caminho para a sistemática molecular, criação de bases de dados filogenéticos e disponibilidade de infraestrutura computacional para inferência filogenética, garantindo assim, maior eficácia na identificação e descrição das espécies já catalogadas e das que virão.
A família de tartarugas Testudinidae inclui 49 espécies e 12 gêneros, todas terrestres e representam aproximadamente 18% da diversidade de tartaruga do mundo (Ernst e Barbour, 1989; Uetz, 2005). Testudinidae é a família mais amplamente distribuída, ocorrendo em todos os continentes subpolares, exceto Austrália, e ocupando uma grande diversidade de habitats que variam de florestas tropicais do sudeste da Ásia e América do Sul, até desertos na América do Norte e África. Morfologicamente, tartarugas também mostram uma grande diversidade de tamanhos e formas. As maiores tartarugas, em Galápagos (Geochelone nigra), pode chegar a 1,5 m no comprimento, mas a Padloper salpicado (Homopus signatus) chega a fase adulta com apenas 10 centímetros de comprimento. A maioria dos gêneros têm carapaças de cúpula altamente rígidas, mas carapaças articuladas ocorrem no género Kinixys, e a tartaruga do género Malacochersus tem uma notável carapaça achatada e flexível para ocupar fendas de rochas (Crumly, 1984a; Ernst e Barbour, 1989 ). 
Objetivo Geral
Este estudo busca gerar dados utilizando sequênciamento genético de bacos de dados disponíveis na internet, a fim de conhecer melhor as associações genéticas e biogeográficas dos gêneros pertencentes à família Testudinidae.
Objetivo específico
Gerar sequência de alinhamento genético com espécimes da família Testudinidae;
Utilizar esta sequência para produzir uma árvore filogenética; 
Gerar quadro de distância entre os indivíduos estudados;
Analisar e compreender a proximidade gênica entre espécies geograficamente distantes.
Materiais e Métodos
Materiais
	Para este estudo foi utilizado o programa MEGA 6.0.6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Versão disponível para Sistemas Win 32 bits. Disponibilizado de graça pelo site (megasoftware.net), programa utilizado em 199 países, sendo baixado mais de 1 milhão de vezes, segundo o próprio site.
	Para obtenção e importação dos genes, foi utilizado o site NCBI (National Center for Biotechnology Information Search database). O NCBI guarda dados provenientes de sequências de genomas no seu GenBank e mantém um índice de artigos de investigação biomédica que disponibiliza nas bases de dados PubMed. Além disso, recolhe, trata e disponibilizam múltiplos outros tipos de informação relevante para o desenvolvimento da biotecnologia. Todas as bases de dados estão disponíveis na Internet.
	Os espécimes utilizados no estudo para a comparações genéticas são da família Testudinidae que engloba várias espécies de tartarugas terrestres, entre as quais os jabutis. Como todos os outros quelônios, os testudinídeos têm o corpo protegido por uma carapaça (casco) e plastrão (parte de baixo). As tartarugas terrestres podem apresentar, conforme a espécie, dimensões muito variáveis, desde alguns centímetros até mais de um metro. Os espécimes deste estudo estão distribuídos em: 1 Família, 10 Gêneros, 23 Espécies
3.2 Métodos
Após a escolha da família Testudinidae, foram feitos levantamentos dos gêneros pertencentes à mesma, e respectivamente suas espécies, sendo posteriormente lançadas no programa MEGA utilizando o recurso Web bowser através do site NCBI, de onde foram retiradas as sequências genéticas. 
Foi utilizado neste estudo o marcador Cytochrome b, que é uma proteína encontrada na mitocôndria de células eucarióticas. Foram utilizadas sequencias com aproximadamente 1100 pb (pares de bases) que após alinhadas foram corrigidas com a ferramenta (Alingn selected block by ClustalW) na opção (Aling DNA). Para construção da árvore filogênica foi usada a função (Construct/Test Neighbor-Joining Tree), a opção (Test of phylogeny) foi alterada para (Bootstrap method). 
Para a tabela de distância foi usada à opção (Compute Pairwise Distances), depois de gerada foi exportada para o programa Microssoft Excel, onde foi atribuído porcentagem, e numerações, para melhor entendimento do cruzamento de informações. 
Lista de espécies
	Nº
	Nome Científico
	Nome pop
	Marcador
	GenBank
	Ocorrência
	1
	Chelonoidis carbonária
	Jabuti piranga
	Cytb
	FM165602.1
	Brasil
	2
	Chelonoidis denticulata
	Jabuti-tinga
	Cytb
	FM165604.1
	Brasil
	3
	Chelonoidis chilensis
	Jabuti Argentino
	Cytb
	HE648068.1
	Argentina
	4
	Chelonoidis nigra
	tartaruga-das-galápagos
	Cytb
	AY097958.1
	Ilhas Galápagos
	5
	Testudo graeca
	Tartaruga grega
	Cytb
	HF954159.1
	Europa
	6
	Testudo hermanni
	Tartaruga Mediterrãnea
	Cytb
	DQ205437.1
	Espanha
	7
	Testudo horsfieldii
	Tartaruga Russa
	Cytb
	FM883692.1
	Rússia
	8
	Testudo kleinmanni
	Tartaruga Egípcia
	Cytb
	AM398197.1
	Egito
	9
	Pyxis planicauda
	Tartaruga plana de cauda
	Cytb
	DQ497320.1
	Madagascar
	10
	Pyxis arachnoides
	Tartaruga aranha
	Cytb
	DQ497319.1
	Madagascar
	11
	Aldabrachelys elephantina
	tartaruga gigante de Aldabra
	Cytb
	AF371242.1
	Ilha de Aldabra
	12
	Aldabrachelys gigantea
	Tartaruga gigante arnoldi
	Cytb
	DQ497293.1
	Ilhas Seychelles
	13
	Geochelone yniphora
	Tartaruga Angonoka
	Cytb
	DQ497306.1
	Madagascar
	14
	Geochelone radiata
	Tartaruga Radiada
	Cytb
	DQ497304.1
	Madagascar
	15
	Gopherus agassizii
	Tartaruga do deserto
	Cytb
	AY434562.1
	América do Norte
	16
	Gopherus berlandieri
	Tartaruga do Texas
	Cytb
	KT956838.1
	América do Norte
	17
	Manouria emys
	Tartaruga Asiatica da Floresta
	Cytb
	AY434563.1
	Ásia
	18
	Manouria impressa
	Tartaruga Impressionado
	Cytb
	DQ497317.1
	Ásia
	19
	Homopus signatus
	Tartaruga Salpicada (menor)
	Cytb
	DQ497309.1
	Africa do Sul
	20
	Homopus boulengeri
	Tartaruga Karoo (menor)
	Cytb
	DQ497308.1
	Africa do Sul
	21
	Kinixys belliana
	Tartaruga Articulada
	Cytb
	DQ497312.1
	Africa do sul (savana)
	22
	Kinixys homeana
	Tartaruga dobradiça
	Cytb
	HE662386.1
	Africa do sul (Floresta)
	23
	Malacochersus tornieri
	Tartaruga panqueca
	Cytb
	AJ888374.1
	Africa
Tabela 1: Está tabela contém o nome científico de todos os espécimes usados neste estudo, seguidos de nome popular, marcador, Genbank e local de origem. 
Resultados
Figura 1: Árvore genealógica contendo 10 gêneros e 23 espécies da família Testudinidae
Figura2: Tabela comparativa de distância entre os gêneros da família Testudinidae
Discussão
Proximidade entre Chelonoidis chilensis (Tartaruga Argentina) e Chelonoidis nigra (Tartarugas Gigantes de Galápagos)
A Chelonoidis chilensis (Tartaruga Argentina ou Tartaruga de Cacho) é uma tartaruga de tamanho médio que atinge aproximadamente 20cm comprimento. Seu epíteto é errôneo, pois não é encontrada no Chile, mas em Chaco província Argentina e Paraguai até o leste da Bolívia. Mesmo sendo a menor tartaruga do gênero Cheloinoidis, foi determinado através de análises de DNA, que elas são os parentes vivos mais próximos da Chelonoidis nigra (Tartarugas Gigantes de Galápagos). O tamanho pequeno da tartaruga de cacho favorece o transporte por embarcações,o que seria o método mais aceito para a colonização das Ilhas Galápagos. O habitat seco, rochoso e as preferências dietéticas das duas também são muito semelhantes, mais do que as tartarugas do próprio continente, como C. carbonária (Jabuti-piranga) e C. denticulata (Jabuti-tinga) ambas endêmicas do Brasil. A tabela de distância (figura 2) apresenta que as tartarugas chilensis e nigra do gênero Ghelonoidis ficaram apenas 9% distantes geneticamente uma da outra.
Tabelas de distância
	Menor distância entre gêneros iguais
	Nome
	Distância
		A. gigantea x A. gigantea arnoldi (sub espécie) - Africa
	0%
		M. emys x M. impressa - Asia
	6%
	Gopherus agassizii x Gopherus berladieri - America do Norte
	6%
		Testudo horsfieldii x Testudo graeca - Russia/Europa
	8%
		Testudo kleinmanni x Testudo graeca - Egito/Europa
	8%
		Ghelonoidis chilensis x G. nigra - Argentina/Galápagos
	9%
Tabela 2: A tabela mostra as espécies com menor distância genética sendo do mesmo gênero
	Menor distância entre gêneros diferentes
	Nome
	Distância
	Testudo graeca x Chelonoidis nigra - Egito/Galápagos
	9%
	Chelonoides denticulatus x Geichelone radiata - Brasil/Madagascar
	9%
	Testudo kleinmanni x Chelonoidis nigra - Egito/Galápagos
	9%
Tabela 3: A tabela mostra a menor distancia genética entre gêneros diferentes
	Maior distância entre gêneros iguais
	Nome
	Distância
	Testudo horsfieldii x Testudo hermanni - Russia/Mediterrâneo
	16%
	Testudo graeca x Testudo hermanni - Europa/Mediterrâneo
	14%
	Chelonoidis denticulatus x Chelonoidis chilensis - Brasil/Argentina
	13%
Tabela 4: A tabela mostra maior distancia genética entre gêneros iguais
	Maior distância entre gêneros diferentes
	Nome
	Distância
	Kinixys homeana x Malacochersus tornieri - Africa
	21%
	Homopus boulengeri x Malacochersus tornieri - Africa
	21%
	Homopus boulengeri x Gopherus agassizii; Gopherus_berlandieri; Manouria emys; Manouria impressa
	20%
Tabela 5: A tabela mostra maior distancia genética entre gêneros diferentes
	Média entre cruzamentos
	Distância
	
	
	Média mais alta entre cruzamentos
	
	Homopus boulengeri (Menor)
	18%
	Testudo hermanni
	17%
	
	
	Média mais baixa entre cruzamentos
	
	Chelonoidis nigra (Gigante)
	12%
	Geochelone radiata
	12%
Tabela 6: Os dados desta tabela são uma média entre a espécie citada, em relação a todos as outras espécies presente neste estudo.
A (Tabela 6) demostra que a tartaruga (homopus boulengeri) conhecida como Padloper Karoo, menor tartaruga da família Testudinidae, chegando a fase adulta com apenas 10cm de comprimento, endêmica de Karoo região de Nana – África do Sul, é dentre todas as tartarugas presentes neste estudo, a mais diversa e mais distante não apenas morfologicamente, mas também geneticamente. 
Seguida de (Testudo hermanni) conhecida como tartaruga de Hermann, endêmica do Sul da Europa, que na árvore genealógica (figura 1), posicionou-se afastada de outras três espécies do mesmo gênero, já tendo sido sugerido em 2006 a mudança da mesma para o um novo gênero Eurotestudo, criado para incluir a espécie hermanni retirando-a do gênero Testudo, sendo, portanto conhecida hoje como Eurotestudo hermanni. 
Referências 
BUENO-SILVA, Marlus. Genética molecular e sistemática animal: Um breve histórico, contribuições e desafios. Estudos de Biologia (UCP. Impresso), v. 34, p.
Crumly, C.R., 1984b. A hypothesis for the relationship of land tortoise genera (family Testudinidae). Studia Geol. Salmanticensia 1, 115–124.
Ernst, C.H., Barbour, R.W., 1989. Turtles of the World. Smithsonian Institution Gmelin, 1789 (Chelonii, Testudinidae). The new genus is created to include the species of the hermanni group, which is within Testudo (Chelonii, Testudinidae).
Homopus boulengeri, Duerden, 1906, Taxonomic Serial No.: 551785, Retrieved August 20, 2013, from the Integrated Taxonomic Information System (ITIS) on-line database, http://www.itis.gov.
Le, Minh et all. "A molecular phylogeny of tortoises (Testudines:Testudinidae) based on mitochondrial and nuclear genes". In: Molecular Phylogenetics and Evolution, volume 40, nº 2, 2006, pp. 517–531.
MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Acessado em 14/05/16 pelo site: www.megasoftware.net.
NCBI (National Center for Biotechnology Information Search database) Acessado em 14/05/16 Pelo site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Uetz, P., 2005. EMBL Reptile Database. <http://www.reptile-database.org/>. van der Kuyl, A.C., Ballasina, D.L.P., Dekker, J.T., Maas, J., Willemsen, R.E., Goudsmit, J., 2002. Phylogenetic relationships among the species of the genus Testudo (Testudines: Testudinidae) inferred from mitochondrial 12S rRNA gene sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 22, 174–183.