resumo microscopia

Rafaella A ndreão M EDU FF 119B BIOLOGIA CELULAR \u201cQue Deus perdoe essas pessoas ruins \u201d MICROSCOPIA 1. Microscopia ópt ica Com base na luz. Seu limite de resolução (menor val or para o qual um objeto pode ser individualiza do) depende do comprimento de onda da l uz visível. Teorica mente, o alcan ce desse microscópio é de 0 ,2 m icrôm etros. Entretanto, as bactérias e as mitocôndrias, que têm cerca de 0,5 micrômetros de largura, são os m enores o bjetos dos quais o formato pode ser claramente disc ernido nesse micr oscópio. 1.1.Microscopia óp tica de campo claro A imagem se forma no olho do observador a partir da passagem da luz pelas l entes. Utilização de corantes: A partir de reações citoquí micas, tais substâncias interagem com o material estudado para que diferentes estruturas possam ser identificadas. São importantes porque as células são transparentes, então sem eles não consegu iríamos anali sá-las. Entretanto, tais corantes podem ser tóxicos, impedindo a visualização de células vivas. 1.2.Microscopia óp tica de campo escuro É utilizada nos casos em que o material é muito homogêneo , como partículas emsuspensão. O sistema de lentes é diferente daquele u sado no microscópi o decampo clar o (forma- se um \u201cnegativo\u201d da imagem, como negativos de fotografia). A imagem se forma em fundo escuro, de forma que o material fica mais claro em relação ao anteparo (a luz que passa pelo material e chega ao fundo preto é que o marca). IPC: Essa técnica aumenta o contraste e não utiliza corante. Somente a luz desviada pelo material chega ao fundo preto (condensação especial). Além disso, esta técnica permite a visualização de c élulas vivas. 1.3.Microscopia de contraste d e fase Também não utiliza corantes, o que permite a visualização de células vivas. Explora a difração, ou seja, a diferença na chegada d a luz após a passagem pelo material (em fase/fora de fase). Utiliza lentes especiais e anéis metálicos. OBS: Variações de fase devido a os diferentes índices d e refração dos componentes do material são ampliadas e transformadas em mudança de intensidade da luz, que são visualizadas como contraste. 1.4.Microscopia de contraste d iferencial (D IC) Sensação de relevo (3D). Trabalha com defasage m dos comprimentos de onda, gerando deformaçã o da imagem, permitindo maior superfí cie de material analisado por contraste interfer encial. 1.5.Microscopia de fluorescência Usa corantes fluoresc entes, que absorve m um comprimento de onda da luz e emitem um comprimento mais longo. Para visualizar isso, utiliza -se um conjun to de filtros: Um filtro para o comprimento de luz que é absorvido e outro para o emitido (refletido). Na maioria das vezes, são vitais, ou seja, não matam a célula. Sonda s fl uorescentes: Quando excitadas, emitem luz por um tempo, e por isso pode m ser mapeadas. Rafaella A ndreão M EDU FF 119B 1.6.Imunofluores cência Anticorpos são marcados co m molécula fluorescente (por ligação covalent e) para encontrar a célula-alvo. . Direta: Marca-se o anticorpo que ating e a célula-alvo. . Indireta: Marca- se o \u201canti - anticorpo\u201d da m oléc ula alvo, pois assim o sinal se torna amplificado. OBS: ELISA Mais enzimas p odem ser u tilizadas em c asos nos quais produzam precipitados quando acoplados aos anticorpos. Este, porém, nã o é um método tão eficaz porque o precipitado pode difun dir-se. Fluorocromos orgân icos: . Desbotam rapida mente; . Precisam de um comprim ento de onda de luz m uito preciso para serem excitados. Quantum do ts (nano partículas f luorescentes): . Maior durabilidad e; . Podem ser excitados por um amplo e spectro de lu z azul, emitindo a luz em diferentes comprimentos de onda, de acordo com seu ta manho; . Energeticamente fav oráveis. IPC: Obtenção d e anticorpos -> Podem ser obtidos em laboratórios, a partir de um mesmo linfócito B ou a partir da imunização primária de um animal (obtenção de um soro com vários anticorpos diferentes, cada u m produzido por um linfócito B). Corantes fluore scentes mais utilizad os: .Dapi: marca DNA . Rodamina .Fluoresceína .GFP: É uma proteína naturalment e verde fluoresce nte e que interage com alvos específicos, mostrando sua localização (PTN repórter). Pode, também, acoplar-se a um gene para mostrar seu padrão de expressão (transgênicos) e ser codificado no final de uma m olécula a qual se quer rastrear. DIRETA INDIRETA 1.7.Microscopia confocal de varredura a laser Muito utilizada para visualização de células v ivas não fixadas e tecidos, com óptica de fluorescência. Ilumina-se profundamente (150 micrô metros) um único ponto através de um laser, formando imagens individuais, que depois são combinadas para a forma ção de um mosai co do material. A imagem formada é bidimensional. -> Técnica de dec onvolução da i magem Transforma várias imagens \u201cborradas\u201d, fora de f oco, em secções ópticas limpas. Precisa-se de pouca lumin osidade (células vivas pode m ser observadas por m ais tempo) e de uma câmara CCD resfriada. - > Observação da dinâ mica das prot eínas FRET: Monit ora interações proteicas. Marcam-se duas ptns com fluoracromos diferente s, sendo que o comprimento de o nda da luz emitida pela primeira excita a segunda. Logo, observa-se no microscópio apenas a cor da emissão da segund a. Fotoativação: Síntese de uma for ma inativa da molécula fluorescente, introdução na célula e ativação por laser ou mudança genética para produzir p roteínas fluorescent es. FRAP: \u201cQueima\u201d a flu o rescência em um determinado local e a observa se re estabelecer. Ex.: Membrana plasm ática. Rafaella A ndreão M EDU FF 119B 1. 8.Microscóp io de fluores cência de reflexão total (TI RF) Utilização de laser excitatório para iluminar a superfície da cobertura de vidro n o ân gulo crítco no qual toda a luz é refletida pela interface entre o vidro e a água. Parte da energia eletromagnética se estende por uma curta distância através da interface como um a onda de evanescência que excita ap enas moléculas que estã o muito próximas à superfíci e. A ssim, quando essas moléculas próximas à supe rfície fluorescem, sua luz não está competindo com a luz fora de fo co das outras moléculas, podendo ser detec tadas. 1.9.Microscopia de força atô mica Ponta pequena e pontiaguda ligada a um braço cantilever flexível capaz de sentir diferenças minuciosas enqua nto se move na superfície. A ssim, revelam-se objetos na superfície que, em tese, seria plana e pode-se pegar e mover moléculas in dividuais. Utilização de radi oisótopos para marcação de células Os radioisótopos são instáveis e sofrem decaimento. Assim, se forem incorporados em mo léculas de interesse, seu percurso pode s er observado. IPC: Preparação do materia l a ser analisado 1º - (Imobilização, preserva ção, per meabilização e morte) Fixação do material com gru po aldeído (formaldeíd o ou glutaraldeído) que fazem ligações covalentes com o material (grupo amino das ptns), estabilizando-o e imobilizando-o. Busca-se sempre pres ervar as estruturas; 2º - Desidratação: Substituição da água por ceras líquidas; 3º - Emblo camento por meio do endureciment o da cera (resfriamento ou polimerização); 4º - Seccionam ento por meio do micrótomo/ultra micrótomo (com navalha de aço); 5º - Coramento (coloração) da amostra para torná-lo visível (normalmente as células são transparentes e \u201c invisíveis\u201d), feita sobre lâmina de vidro. Geralmente, essa coloração é feita com co rantes orgânicos que possuem afinidade específica por determinados componentes subcelulares. Ainda, po de-se utilizar so ndas e m arcadores fluoresc entes (método utilizado frequentemente para marcação de proteínas) e hibridização in situ para visualizar padrões específicos de expressão gênica diferencial (revela a distribuição celular e a abundância de mo léculas de RNA específicas expressa s no material secci onado ou em quantidades inteiras d e pequenos organismos ou órg ãos). 2. Microscopia ele trônica Utiliza feixes de elétr ons. O poder de res olução é superior ao do microscópio óptico, chegando a 0,1 nanôm etros. Isso permite a visuali zação de estrutura s celular es. 2.1. Microscopia e letrônica de transmissão Utiliza feixes de elétrons com alta velocidade, que formam imagens de acordo com a densidad e do material: \uf0e8 Elétron qu e passa livr e: Branco \uf0e8 Elétron que é at enuado: Cinz a \uf0e8 Elétron que nã o passa pelo material: Preto (Observação no anteparo fosforescente que reflete a chegada das partículas ). Como acontece ? Elétrons emitidos do alto d e uma coluna a alta velocidade incidem em amostra, formando imagem por diferença de densidade. Essas par tículas batem e m um anteparo (t ela Rafaella A ndreão M EDU FF 119B fosforescente, placa fotográfica, câmera digital de alta resolução). Esse processo tem que ocorrer no vácuo . Como a maioria dos elementos da célula seria perme ável, faz -se co ntrastaçã o com metais pesa dos, principlamente chumbo e urânio, qu e aderem de for ma distinta às diferentes estruturas, p ermitindo sua individualiz ação e reconheciment o. Imunolocaliza ção com our o O ouro é acoplado a um anticorpo secundário (que, por ser denso, fica preto). Pontos negativos: Perde-se o 3D e não passa pela resina (a marcação tem que ser feita préemblocament o, pois se não só moléculas da superfície responderiam e t eria-se uma falsa impr essão). 2.2. Microscopia e letrônica de varredura Fornece image m 3D de superfície. Essa técnica trabalha através da condutividade do m aterial. Assim, o s elétrons vão \u201cvarrendo\u201d tudo e o caminho é desenhado no mon itor. Normalm ente, o material não é conduto r e precisa ser m etalizado (faz-se a fixação, a desidratação e a cobertura com u ma fina camada de metal pesado). Coloração negat iva Técnica muito utilizada para visualizaçã o de partículas em suspensão (Fundo fica preto e o o bjeto fica clar o). Consiste no envolvimentode partículas com material pesado. P ara visualização detalhada de macromoléculas em isoladas (em superfí cie): \uf0e8 Moléculas sustentadas por filme delgado de carbono são misturadas c om solução salina d e metal pesado; \uf0e8 Secagem deixa camada fina de metal sobre amost ra, menos onde foi ads orvido por macromolécula. OBS: Pós-sombreamento -> Técnica que deposita coberturas sobre amostra, formando réplica que mostra contornos da amostra original (filme de carbono por cima e ela pode ser o bservada pelo microscópi o de transmissão). 2.3. Microscopia crioeletrônica Congelamento muito rápido do material -> Formação de gelo vítreo (sem cristalização, pode ser observado sem fixação). A imagem é o bservada em microscópio especial que mantém as baixas temperaturas. Criofratura: Quebra para fazer s ombreamento da célula. Link interessante: https://blogs.ne1 0.uol.com.br/mundobit /2017/10/ 08/m icroscopia-crio-ele tronica-revela-mundo- molecular/ Rafaella A ndreão M EDU FF 119B Microscopia crioeletrônica: congelar pra ver melhor 2.4. Preparação da amostr a 1º - Fixação do material com glutaraldeído; 2º - Pós-fixação com tetróxido de ósmi o, que se lig a e estabiliza as bicamadas lipídicas e proteínas; 3º - Desidratação (pode ser feita com CO2 líquido, fazendo-o posteriormente a passagem deste para gás) e permeabilização com resina monomérica qu e se p olimeriza p ara for mar um b loco sólido; 4º - Microtomia c om lâmina de vidr o ou diamante; 5º - Corte é posto e m grade metálica pequena; 6º - É feita coloração com contrastan tes.

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