Relatório Microbiologia TP2 - Documentos Google

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23/05/2019 Relatório Microbiologia TP2 - Documentos Google
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CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA 
DE BACTÉRIAS 
Ana Gabriela Martins, Jacira Alexandra Afonso das Neves Paulo e Marina Mustefaga 
Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Av. Campo Grande, 376, 
1749-024 - Lisboa, Portugal 
 
 
Resumo: Classificar e identificar microrganismos é um processo importante para 
diferentes áreas da atividade humana. É importante quer na medicina para deteção de 
microrganismos patogénicos responsáveis por intoxicações alimentares, quer na indústria 
para a detecção de contaminantes que possam existir em produtos de consumo humano, 
entre outros. Porém, apenas caracteres morfológicos não são suficientes para a 
classificação das bactérias, devido à grande diversidade existente. Através das atividades 
fisiológicas e bioquímicas dos microorganismo é possível diferenciá-los a nível do género 
ou mesmo espécie. Testámos então alguns dos testes morfológicos e bioquímicos mais 
utilizados. 
 
Palavras-Chave: identificação bacteriana; testes bioquímicos; galeria API 20E 
 
 
1. Introdução 
Os microrganismos constituem parte essencial da vida na terra e são de 
extrema relevância em diversas áreas de interesse humano, como a medicina, 
com a identificação de agentes possivelmente patogénicos e suas 
características e as indústrias alimentícia e farmacéutica, que utilizam tanto os 
próprios microrganismos quanto compostos por eles produzidos em seus 
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processos. Bactérias constituem um grande grupo desses microrganismos e 
possuem uma grande variedade, motivo pelo qual se faz necessária a aplicação 
de uma série de um métodos de identificação para obtenção de resultados 
fiáveis. 
Inicialmente, os primeiros métodos de classificação bacteriana baseavam-se 
na morfologia, tamanho e motilidade das colónias [1], porém o desenvolvimento 
de uma grande gama de testes bioquímicos permitiu a confirmação de diversos 
processos fisiológicos característicos de cada género. Atualmente também é 
possível realizar testes à nível moleculares, como a hibridização do DNA e o 
sequênciamento de DNA ribossomal, porém estes são metódos mais caros e de 
maior complexidade técnica [2]. 
Neste estudo, a caracterização dos microrganismos foi realizada a partir de 
testes bioquímicos laboratoriais, que constituem um método de análise preciso 
porém trabalhoso. Esses testes consistem principalmente em análises da 
presença de enzimas hidrolíticas extracelulares para degradação de amido e 
proteína, detecção da capacidade de fermentação a partir de glícidos, utilização 
do citrato como fonte de energia na ausência de glícidos, capacidade de 
hidrolisar peptona, e indicativos de respiração aeróbica, como o teste da 
catalase e da oxidase. 
Além destes, para o microrganismo 3 foi utilizado a galeria de identificação 
rápida API 20E, que consiste em um kit contendo 20 testes para a identificação 
de enterobacterias . As vantagens da utilização de kits como o API 20E se deve 
pela praticidade e rapidez do método, porém requer muita precisão, pois pode 
não ser possível identificar a espécie. 
 
2. Métodos e Material 
 
Para caracterização fisiológica e bioquímica de bactérias foram testadas 
quatro amostras diferentes de culturas puras, sendo que destas quatro, três 
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foram disponibilizadas pela docente e outra bactéria do solo isolada em cultura 
pura pela nossa equipe ( Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas, Bacillus). 
 
2.1 Testes bioquímicos 
 
Hidrólise do amido e hidrólise de caseína 
As bactérias foram inoculadas por espalhamento em dois diferentes meios de 
cultura contendo nutriente ágar, sendo um deles suplementado com amido e o 
outro com proteína do leite (caseína). Após a inoculação as placas foram 
incubadas em uma estufa a 37°C por 72 horas. O primeiro teste foi realizado 
pela observação de reação nas placas de Petri, após a incubação dos meios de 
cultura. A observação da hidrólise do amido e da caseína, se dá a partir da 
presença de uma zona clara ao redor da cultura. No caso do teste de hidrólise 
do amido, foi adicionado água iodada como reagente, para observar o possível 
surgimento de coloração azul escura caso houvesse amido não digerido ao 
redor do microrganismo, como indicativo de ausência de enzimas do tipo 
amilases. 
 
Teste do citrato 
Para do teste do citrato foram inoculadas por espalhamento as quatro amostras 
de bactérias em 4 tubos distintos com meios de citrato inclinado e 
posteriormente incubados na estufa a 30° C por 72 horas. O objetivo foi 
observar se os microrganismos das amostras possuem a enzima citrase, que 
permite a utilização do citrato como substrato na ausência de outras formas de 
energia, a partir do crescimento dos mesmos. 
 
Teste de fermentação de glícidos 
Nos testes de fermentação de glícidos o objetivo é identificar quais tipos de 
açúcares o microrganismos pode utilizar como susbstrato, realizando 
fermentação. Foram utilizados 3 tubos testes contendo lactose, sacarose e 
glucose para cada amostra bacteriana a ser identificada. Com o auxílio de uma 
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ansa, cada cultura pura foi inserida nos tubos. A incubação foi em estufa a 37° 
por 72 horas. 
 
Hidrólise de proteínas (gelatina) 
Em um meio inclinado composto por ágar nutritivo suplementado com gelatina, 
as amostras foram inoculadas por espalhamento, a fim de observar se os 
microrganismos possuem a enzima proteolítica gelatinase, que permite a 
degradação do colagénio. Após incubação em estufa a 30°C por 72 horas, 
observa-se se ocorreu liquefação do meio, que indica a presença da enzima. 
 
Teste de produção de indol (IMViC) 
O teste de produção do indol faz parte de uma conjunto de testes utilizados na 
identificação de bactérias da família . Em quatro tubos com peptona, com o 
auxílio de ansas, foram inoculadas os microrganismos, sendo depois incubados 
em uma estufa a 37°C por 72 horas. A peptona pode ser convertida a indol por 
atividade enzimática de algumas bactérias, e por isso é útil na diferenciação 
desses microrganismos. Para observar a ocorrência da reação com produção de 
indol, é adicionado 0,5ml do reagente Kovacs em cada tubo, com agitação em 
seguida e repousar de 5 a 10 min. 
 
Teste da produção de sulfureto de hidrogênio 
Em tubos com tiossufato de sódio e ágar para tornar o meio semi-sólido, 
inoculamos por picada as bactérias, seguido de incubação em estufa a 37°C 
durante 48 horas. O resultadofoi observado pela presença ou ausência de 
coloração negra ao longo da linha de inoculação. 
 
Teste da Catalase 
O teste da catalase é um teste rápido que tem como objetivo a detecção da 
produção de catalase através da observação de bolhas. Introduzimos uma gota 
de peróxido de hidrogénio numa lâmina e posteriormente o microrganismo, 
observando-se imediatamente os resultados, na liberação ou não de bolhas de 
gás. 
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Teste da citocromo-oxidase 
Também considerado um teste rápido, observa-se a capacidade das bactérias 
produzirem citocromo oxidase através da adição do reagente dihidrocloreto de 
tetrametil-p-fenilalanina. Para isso, foi necessário um disco de papel de filtro 
onde dividimos em 4 e adicionamos uma porção das respectivas bactérias 
seguido do reagente dihidrocloreto de tetrametil-p-fenilalanina, após poucos 
segundos já se obtém o resultado. 
 
Testes de galeria de API 
Para realização deste teste foi preparado uma suspensão com a bactéria 
Escherichia coli, e em seguida inserida nos compartimentos das galerias 
pequenas quantidadez da suspensão e água esterilizada (para não haver 
desidratação) até a metade do compartimento, enchendo até o limite apenas 
aqueles cujo nome do teste se encontrava dentro de um quadrado. Nos 
compartimentos em que os nomes se encontram sublinhados o restante do 
espaço foi preenchido com parafina. A galeria foi incubada em para estufa a 
37°C por 72 horas. Passado o tempo de incubação, concluímos os testes 
adicionando os seguintes reagentes TDA, James e VP1+VP2 ao TDA, IND e VP 
respectivamente, aguardamos cerca de 10 minutos e analisamos os resultados 
com base no catálogo de identificação da API. 
 
3. Resultados e discussão 
Hidrólise do amido 
Dentre as amostras testadas, apenas o microorganismo 1 formou um zona 
de cor clara em torno da colónia, o que indica hidrólise do amido presente no 
meio, como resultado da presença de amilases extracelulares. A inoculação 
da amostra 3 não foi bem sucedida, pelo que não foi verificado crescimento 
de colónia bacteriana, e as amostras 2 e 4 deram resultado negativo, como 
observado na figura 1. 
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Fig. 1: Placas com meio suplementado com amido e culturas inoculadas 
 
Hidrólise da caseína 
Nas placas contendo leite, o teste de hidrólise de caseína apresentou 
resultados positivos para os microorganismos 1 e 3. Essas culturas 
apresentaram zonas transparentes, indicando a presença de proteases, que 
realizaram hidrólise da caseína. Os amostras 2 e 4 tiveram resultado 
negativo, pois o meio permaneceu turvo, de coloração esbranquiçada. 
 
Fig. 2: Placas com meio contendo leite, onde observa-se degradação da caseína nos 
microorganismos 1 e 3. 
 
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Fermentação de glícidos 
A capacidade de realizar fermentação a partir de diferentes açucares como 
substrato também serve como um marcador bioquímico para identificação 
de bactérias, e a presença ou ausência de reação pode ser observada a 
partir da formação de gases e da alteração da coloração do meio como 
indicativo de produção de compostos orgânicos que alteram o pH. Os 
microrganismos 1 e 3 tiveram resultados positivos na variação de cor tanto 
para a glucose quanto para a lactose, mas não para a sacarose, como indica 
a tabela contendo todos os resultados observado. Os microrganismos 2 e 4 
não puderam ser analisados. 
 
Meio Microrganismo 1 Microrganismo 3 
Glucose Amarelo (positivo); Sem 
formação de gás (positivo) 
Amarelo (positivo); Formação de 
gás (negativo) 
Lactose Amarelo (positivo); 
Formaçãode gás (negativo) 
Laranja (positivo); Sem formação 
de gás (positivo) 
Sacarose Vermelho (negativo); Sem 
formação de gás (positivo) 
Vermelho (negativo); Formação de 
gás (negativo) 
Tabela 1: Resultados obtidos nos tubos de teste de fermentação de glícidos 
 
Produção de indol 
A detecção da capacidade de degradação da peptona com formação de indol é 
observada a partir do surgimento de um anel vermelho no topo do tubo, após a 
adição de reagente de Kovacs. O microorganismo 3 apresentou resultado 
positivo, sendo indicativo do género Escherichia Coli. 
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Fig. 3: Resultado do teste de produção 
 de indol para o microrganismo 3. 
 
Utilização do citrato 
A presença da enzima citrato permease na membrana plasmática permite que 
alguns microrganismos utilizem o citrato disponível no meio, quando não há 
glícidos disponíveis. O corante azul de bromofenol muda a cor do meio para 
azul quando a utilização do citrato gera carbonato de sódio, que é um produto 
alcalino. Os meios com as amostras testadas permaneceram verdes, o que 
indica ausência da enzima citrato permease. 
Produção de sulfureto de hidrogénio 
Para testar a capacidade de respiração anaeróbica, o meio é semi-sólido 
(devido à concentração suficiente de ágar). A combinação de sulfato de ámonio 
ferroso com o sulfureto de hidrogénio produzido pela respiração sem oxigénio 
resulta em um precipitado negro de sulfureto ferroso. O microorganismo 1 foi 
único dentre os testados a apresentar este indicativo de respiração anaeróbica. 
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Fig. 4: Resultado do microrganismo 1 indicando 
 capacidade de respiração anaeróbia 
 
Teste da catalase 
Ao testar a presença da enzima catalase em bactérias, é possível classificá-las 
em aeróbias obrigatórias, anaeróbias facultativas ou obrigatórias. Todos os 
microrganismos testados tiveram resultado positivo, com a formação de bolhas 
de oxigénio quando em contato com água oxigenada; tratam-se então de 
bactérias aeróbias obrigatórias ou anaeróbias facultativas. 
 
Fig. 5 : Resultado do teste da catalase, 
 apresentado por todos as amostras. 
 
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Teste da citocromo-oxidase 
Quando o reagente di-hidrocloreto de tetrametil-p-fenilalanina é oxidado pela 
citocromo oxidase, é observada uma coloração violeta, que indica resultado 
positivo para a presença de citocromos, ajudando a identificar bactérias dos 
géneros Neisseria e Pseudomonas . Todas as bactérias analisadas 
apresentaram coloração cor-de-rosa claro, indicando que o reagente 
permaneceu na forma reduzida, pela ausência de citocromos. Todas as 
amostras são, por tanto, Enterobacteriaceae. 
 
ConclusãoA partir deste trabalho conseguimos ver que diferentes espécies podem 
apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Após a análise morfológica 
sumária conseguimos observar, no teste do citrato, que não houve nem 
mudança de cor nem formação de gás em nenhum dos 4 tubos mostrando 
então a ausência de glícidos fermentáveis. No teste IMViC, nos dois tubos, 
houve a alteração da cor dos reagentes para rosa (resultado negativo), ou seja, 
não houve produção de indol. Na fermentação de glícidos, na glucose 
obtivemos resultados positivos (alteração da cor para amarelo e formação de 
gás no microorganismo 1), na lactose os resultados também deram positivo ao 
contrário da sacarose que a cor não se alterou. Na produção de sulfureto de 
hidrogénio apenas um de entre os outros apresentou respiração anaeróbia. No 
teste da catalase todos os resultados deram positivos (bactérias aeróbias 
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obrigatórias ou anaeróbias facultativas). No teste da citrocromo-oxidase, 
obteve-se o género Enterobacteriaceae, pois o resultado deu negativo. Na 
hidrólise do amido apenas uma das 4 apresenta um resultado positivo da 
atividade hidrolítica (presença de uma zona clara em torno da cultura). No teste 
da hidrólise de caseína obtivemos dois resultados positivos (presença de uma 
zona transparente em redor) proveniente do crescimento da hidrólise da 
caseína. Conclui-se então que cada bactéria tem características específicas e 
únicas que possibilitam a sua identificação. 
 
Referências: 
[1]. JANDA, M e ABBOTT, S.L. Bacterial Identification for Publication: 
When Is Enough Enough? Journal of clinical microbiology. Vol. 40, No. 
6 June 2002, p. 1887–1891. Disponível em: 
https://jcm.asm.org/content/jcm/40/6/1887.full.pdf 
[2]. JANDA, M e ABBOTT, S.L. Bacterial Identification for Publication: 
When Is Enough Enough? Journal of clinical microbiology. Vol. 40, No. 
6 June 2002, p. 1887–1891. Disponível em: 
https://jcm.asm.org/content/jcm/40/6/1887.full.pdf 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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