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Revista Odontológica de Araçatuba, v.26, n.2, p. 34-39, Julho/Dezembro, 2005
ISSN 1677-6704
TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE
EM CADEIA NA ÁREA ODONTOLÓGICA
TECHNIQUE AND APPLICATION OF POLYMERASE
CHAIN REACTION IN DENTISTRY.
Patricia Ramos CURY1
Cristiane FURUSE2
Ney Soares ARAÚJO3
RESUMO
A Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) mudou o curso da ciência e, hoje, esta
técnica é tão importante que é difícil pensar em Biologia Molecular sem ela. Seu
conceito básico, de amplificação de seqüências específicas dos ácidos nucléicos,
tem hoje aplicações em diversos campos na odontologia, tal como, ciência forense,
histopatologia, diagnóstico microbiológico, entre outras. O objetivo desta revisão é
apresentar a essência da técnica de PCR, os procedimentos para a preparação das
amostras e otimização da reação, e relacionar sua aplicabilidade em odontologia.
UNITERMOS: Reação em cadeia da polimerase.
INTRODUÇÃO
A reação da polimerase em cadeia, do inglês
PCR, possibilita a amplificação de pequenas amostras
de DNA até um nível grande o suficiente para permitir
a identificação. Embora criada por Mullis12, e descrita
por Saiki et al.14, o princípio da reação da polimerase
em cadeia (PCR) foi descrito uma década
anteriormente, em 1971, por Kleppe et al.7. O conceito
da amplificação do DNA por essa técnica é simples,
entretanto, seu impacto nas ciências biológicas foi
extraordinário, tanto que, em 1993, KARY MULLIS
recebeu o prêmio Nobel de Química.
Para a PCR, um par de iniciadores ou
“primers” (uma única fita curta de DNA, específica
para o gene que se quer estudar) que
complementam a fita oposta da seqüência de DNA
a ser amplificada (uma amostra de DNA a ser
identificada) são empregados. Depois da
desnaturação do molde de DNA mediada pelo calor,
os iniciadores ligam-se a sua seqüência respectiva
no molde de DNA, o que é denominado de
anelamento, e então uma enzima, DNA-polimerase,
sintetiza uma fita complementar em direção à
extensão 5’ e 3’. Os ciclos de desnaturação,
anelamento e extensão são repetidos várias vezes.
Teoricamente, em cada ciclo a quantidade de
moldes de DNA dobra, pois os produtos de um ciclo
servem de molde para o ciclo seguinte e, portanto,
depois de 10 ciclos a seqüência alvo dentro do
molde de DNA é multiplicada por 1.000 e, após 20
ciclos, é multiplicada por 1.000.000. Entretanto,
existe um platô acima do qual, ciclos adicionais
não resultaram em amplificação adicional, devido
à exaustão dos reagentes.
A temperatura na qual cada um dos passos
(desnaturação, anelamento e extensão) ocorre é
diferente e, portanto, um aparelho termociclador é
necessário para que as temperaturas sejam
reguladas automaticamente, assim como seus
ciclos sejam padronizados.
O objetivo deste trabalho é apresentar a
essência da técnica de PCR, os procedimentos para
a preparação das amostras e otimização da reação,
e relacionar sua aplicabilidade em odontologia.
1 PREPARO DA AMOSTRA
O primeiro fator a determinar o sucesso da PCR
é a preparação do ácido nucléico que contém a
seqüência de DNA alvo da amplificação. Diversos
protocolos têm sido desenvolvidos para extração de
DNA, entretanto, enquanto a PCR é rápida e prática,
os protocolos de extração são trabalhosos,
requerem grande quantidade de solventes e materiais
tóxicos e nenhum deles é aplicável universalmente
para qualquer amostra. Alguns kits de extração
estão disponíveis no mercado, mas o custo destes
kits pode ser um fator limitante para seu uso.
A amostra de DNA pode ser extraída, por
exemplo, de tecidos frescos, biofilme dental, saliva
e também de tecidos incluídos em parafina ou
secções coradas em hematoxilina e eosina. Em
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1 - Doutora em Periodontia, Professora de Microbiologia/Imunologia e Periodontia, Centro de Pesquisas Odontológicas São
Leopoldo Mandic, SP.
2 - Doutora em Patologia Bucal, Professora de Patologia Bucal, Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic, SP.
3 - Professor Titular, Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da USP, SP.
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geral, os protocolos para extração de tecidos frescos
envolvem incubação da amostra com proteinase K
ou simples fervura em água11. A incubação com
proteinase K consome tempo, de minutos a 24 horas
ou mais, mas fornece DNA em alta concentração e
boa qualidade. Depois da extração a proteinase k é
inativada a 950 C por 10 minutos e o DNA é purificado
em fenol/clorofôrmio. O DNA purificado é então
ressuspenso em um meio para armazenamento,
como o tampão Tris-EDTA (ácido acético
diaminotetraetileno) ou água destilada estéril.
Armazenamento em tampões de fosfato e ou
tampões contendo alta concentração de EDTA deve
ser evitado devido ao seu efeito na concentração
do íon magnésio.
A extração de DNA é mais rápida pela fervura
da amostra em água estéril destilada por
aproximadamente 15 minutos. A qualidade do DNA
obtido é boa, mas a concentração e a quantidade
são inferiores as obtidas pelo uso da proteinase K16.
Técnicas para extração de RNA para PCR
também estão disponíveis, sendo a “técnica do
TRIZOL®” a mais empregada. Após a obtenção do
RNA, é realizada a síntese de DNA complementar
empregando-se uma enzima e a reação de PCR é
realizada da mesma forma que a amplificação de DNA6.
2 COMPONENTES DA REAÇÃO
Após a extração do DNA, na PCR padrão, o
molde de DNA é adicionado ao desoxinucleotídio
trifosfato (dNTPs), o qual fornece energia e
nucleotídeos necessários para a síntese de DNA,
a um par de iniciadores, a Taq polimerase (a DNA
polimerase que catalisa a reação), além de sais,
proteínas e detergentes que ajudam estabilizar os
outros componentes (Tabela 1). Volumes de 25, 50
ou 100 µl são utilizados. A reação é normalmente
conduzida em tubos de microcentrífuga ou tubos
de PCR que contém os reagentes acima2.
TABELA 1- Reagentes e concentrações
empregados na reação de PCR.
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2.1 TAQDNA POLIMERASE
TaqDNA polimerase é a catalisadora da
extensão dos “primers”. Ela é uma DNA polimerase,
termoestável, isolada do eubacterium termofílico
Thermus aquaticus. Para muitos ensaios a
quantidade ótima é de 0,5 e 2,5 unidades. Aumento
da concentração pode resultar em redução da
especificidade.
2.2 SOLUÇÃO TAMPÃO
O tampão mais freqüentemente utilizado em
PCR é o Tris 10mM, com pH variando entre 8,5 e
9,0 a 250C. Com o aumento da temperatura pelo
termociclador o pH diminui para 7,4, que é um valor
ótimo para atividade da Taq polimerase na
temperatura de 720C. A concentração de íons de
magnésio também é importante para a máxima
atividade da polimerase e, como os dNTPs se ligam
aos íons de magnésio, ele deve estar presente em
excesso2. A concentração de íons de magnésio
também influencia a eficiência do “primer”. Portanto,
é possível modificar a concentração dos íons de
magnésio, ao invés de aumentar a temperatura de
anelamento, para regular a especificidade do
“primer”. Uma concentração ótima pode variar de
aproximadamente 0,5 mM a 5 mM.
Detergentes, tais como Tween 20, Triton X-
100 ou Nonider P-40 podem ser adicionados à
solução tampão para ajudar a prevenir a
precipitação de Taq polimerase hidrofóbica em
soluções aquosas2.
2.3 TRIFOSFATO DESOXINUCLEOTÍDEO (DNTP)
O dNTP pode ser obtido como soluções
secas congeladas ou soluções aquosas. Eles
também estão disponíveis com marcadores,
radioativos ou não-radioativos, que podem ser úteis
para subseqüente hibridização ou sequenciamento
dos produtos de PCR. Eles são resistentes ao calor
e têm uma meia vida de mais de 40 ciclos de PCR5.
Usualmente, o dNTP é usado numa concentração
entre 20 µM e 200 µM. Desequilíbrio da misturas de
dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg2+
livre, interferindo assim com a atividade da polimerase
e diminuindo o anelamento do“primer”.
2.4 INICIADOR
Na maioria das aplicações de PCR, é a
seqüência do iniciador que determina o sucesso
geral do ensaio. Geralmente, os iniciadores são
desenhados para serem exatamente
complementares as seqüências alvo. Ao se iniciar
um estudo, o desenho do iniciador pode ser obtido
na literatura ou realizado pelo pesquisador através
de programas específicos disponíveis no mercado.
Entretanto, quando a seqüência alvo não é
conhecida precisamente e, portanto, nesses casos
utilizam-se iniciadores que não se combinam
exatamente com o DNA do molde. Em outros casosCada um reagentes acima será descrito à seguir.
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ainda, vários iniciadores são utilizados, levando-se em
conta mudanças potenciais ou conhecidas de base2.
Sua seqüência geral deveria ter as seguintes
características4:
1. Entre 15 e 30 bases;
2. Nenhuma estrutura secundária;
3. Estrutura balanceada de sítios ricos em 40-
60% G/C e A/T;
4. Ausência de complementaridade entre as
extensões 3’, para que não ocorra formação de dímeros;
5. Seqüências palindrômicas devem ser
evitadas;
6. Temperatura de “melting” (Tm) entre 55 e 900 C;7. Na confecção dos iniciadores devem-se
manter as Tms do “foward” e “reverse” próximas e
não muito baixas, para evitar ligações inespecíficas.
8. T na extremidade 3´ deve ser evitado;
9. Três ou mais Gs e Cs devem ser evitados.
Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5 µM
são geralmente ótimas. Concentrações mais altas
podem resultar em acúmulo de produtos não
específicos, reduzindo a concentração do produto
desejado. Concentrações mais baixas podem ser
esgotadas previamente ao final da reação, resultando
em baixa concentração do produto desejado4.
A temperatura de anelamento depende do
comprimento e composição dos “primers”.
Idealmente, a temperatura de anelamento deve ser
1 a 50 C abaixo da Tm. Uma temperatura deanelamento baixa demais resulta em anelamento
não-específico e, portanto amplificação não-
específica. Enquanto, que uma temperatura muito
alta resulta em reduzida concentração do produto2.
2.5 CAMADA DE ÓLEO MINERAL
No passado, uma camada de óleo mineral era
empregada sobre a mistura final para prevenir a
evaporação do produto durante a PCR.
Alternativamente, uma camada de parafina era
usada no lugar do óleo mineral. Como a parafina é
sólida em temperaturas abaixo de 550C, ela pode
ser utilizada não apenas para prevenir evaporação,
mas para manter os componentes da reação,
“primer” e molde, separados até que a mistura da
reação seja aquecida. Essa separação dos
componentes da reação com parafina, denominado
PCR de início quente, evita ligações não-específicas
durante a desnaturação inicial dos moldes de DNA.
Os termocicladores modernos ajustam a
temperatura entre os ciclos rapidamente e essa
camada de óleo não é mais necessária, além de
manterem a temperatura da tampa à 100oC evitando
a perda de produto.
4.6 MOLDE ALVO DE DNA
Para o sucesso da PCR, a seqüência
gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma
qualidade pobre de DNA, tal como a obtida de peças
incluídas em parafina, irá freqüentemente conter
fragmentos curtos de DNA. Em tais casos, os
iniciadores deveriam ser desenhados para amplificar
regiões curtas dentro do molde.
A proporção iniciador/molde influencia
significantemente a PCR e deveria ser otimizada
empiricamente. Baixa concentração de DNA é
necessária para uma PCR ótima. Excesso de molde
pode favorecer o anelamento das duas fitas do
molde, mais do que seu anelamento com o par de
iniciadores e irá também aumentar a chance de
formação de produtos não-específicos; entretanto,
quando há muito pouco molde, pode acontecer das
seqüências complementares não se encontrarem.
Tipicamente, menos de 0,2µg de DNA pode ser
suficientemente amplificado em 30 ciclos2.
A pureza do molde também influencia no
resultado da reação.
3 EQUIPAMENTO
Teoricamente, a PCR pode ser realizada
manualmente através de banhos ajustados, mas
as múltiplas temperaturas e ciclos repetitivos
demandam automação. Portanto, um equipamento
específico foi desenvolvido, o termociclador.
Um termociclador adequado deve manter as três
temperaturas de incubação precisas e
reprodutivelmente. A seleção dos tubos de reação
também é crítica, pois afeta a taxa de transferência de
calor do termociclador para a mistura da reação. Assim,
devem-se empregar tubos que são desenvolvidos para
PCR e que se encaixem perfeitamente aos poços do
termociclador a ser utilizado.
3.1 CICLOS TÉRMICOS
3.1.1 DESNATURAÇÃO INICIAL
É muito importante para a reação, que as fitas
de DNA molde alvo se separem completamente.
Um aquecimento inicial da mistura a 950C é
suficiente para desnaturar o DNA genômico e
permitir o anelamento do iniciador, conforme a
temperatura da reação começa a diminuir. Se o
molde é apenas parcialmente desnaturado, haverá
uma tendência das fitas se juntarem novamente
muito rapidamente, evitando a eficiência do
anelamento e extensão ou conduzindo a um “self-
priming” com resultados falso-positivos.
Usualmente, 20 a 30 segundos são suficientes,
mas o tempo deve ser adaptado para o
termociclador e tubos utilizados. A reação é então
ciclada 20-45 vezes.
3.1.2 ANELAMENTO DO INICIADOR
Para a maioria dos objetivos a temperatura de
anelamento tem sido otimizada empiricamente. A
escolha desta temperatura é talvez o fator mais
crítico para a obtenção de uma alta especificidade.
Se a temperatura for muito alta, nenhum anelamento
ocorrerá, mas se for muito baixa, o anelamento
inespecífico aumentará dramaticamente. Em geral,
FIGURA 3 - Grupo I (Controle) 24 dias. Terço cervical comtrabéculas ósseas espessas evidenciando algumas áreasocupadas por tecido conjuntivo sem diferenciação óssea.HE, original, 63x.
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uma temperatura de aproximadamente 55-65o C é
mantida por 30-60 segundos.
3.1.3 EXTENSÃO DO “PRIMER”
A extensão do “primer” é normalmente
conduzida a 720 C, temperatura ótima para a ação
da TaqDNA Polimerase (explicada adiante).
Usualmente, de 20 a 40 segundos de extensão são
suficientes (1 minuto para cada Kilobase).
Entretanto, esses tempos podem variar e também
são alvos de otimização.
EXTENSÃO FINAL
Usualmente, depois do último ciclo, os tubos
de reação são mantidos a 720C por 5-10 minutos
para promover completa extensão e anelamento, e
complementar de fitas únicas de DNA.
3.2 NÚMERO DE CICLOS
Para uma reação ótima, menos de 10 moldes-
alvo de DNA podem ser amplificados em menos
que 40 ciclos para uma quantidade de produto
facilmente detectável em gel corado com brometo
etídeo. A maioria das PCRs deveria então incluir
apenas 25 a 35 ciclos. Com o aumento do número
de ciclos, aumentam também as reações
inespecíficas.
No protocolo acima, cada ciclo tem duração
de 1 a 3 minutos; entretanto, tempo extra é
necessário para o aquecimento e resfriamento entre
os passos. Portanto, 25-35 ciclos de PCR estende-
se por 2 ou 3 horas
4 ESTRATÉGIAS GERAIS DE TRABALHO PARA
EVITAR CONTAMINAÇÃO
A amplificação apenas de molécula DNA de
interesse pela PCR significa que quantidade mínima
de contaminação ocorreu e esse contaminante não
foi amplificado, o que resultaria em resultados falso-
positivos. Como a PCR é muito sensível,
contaminação com pequenas quantidades de
material exógeno pode resultar na sua amplificação9.
A contaminação pode ser de origem laboratorial,
por exemplo, seqüências previamente amplificadas,
ou de origem externa, por exemplo, DNA do
operador.
Para minimizar o problema de contaminação,
os seguintes cuidados são indicados:
1. Laboratório: local de trabalho separado paraas fases antes, durante e após o PCR; proteção da
sala do equipamento de PCR contra luz ultravioleta;
uso de pipetas com pontas contendo filtro estéril e
de uso exclusivo para PCR.
2. Manipulação da amostra: técnica estéril e
luvas; ponteiras de pipetas e demais materiais
estéreis; autoclavagem de todas as soluções e
reagentes que podem ser autoclavadas sem perder
suas propriedades (iniciadores, dNTP e Taq não
podem ser autoclavados); kit de reagentes somente
para PCR, estocados em pequenas porções e
individualizado; quando pipetando DNA evitar criar
aerosol; incluir sempre um controle negativo, isto
é, amostra sem DNA com todos os componentes
da reação.
5 DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR
Finalizada a PCR, o próximo passo é detectar
a presença de produtos amplificados. Em geral,
isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose
ou acrilamida, que pode ser seguida por Southern-
blotting e hibridização.
5.1 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
O produto de PCR tem um tamanho definido
e, quando é necessário apenas checar esse
tamanho, o método mais simples é carregar uma
alíquota do produto em um gel de agarose,
(tipicamente 1% w/v de agarose), contendo
brometo de etídio e então submetê-lo a
eletroforese. As bandas formadas no gel,
correspondentes a diferentes tamanhos de
fragmentos de DNA, serão visíveis sob um
transiluminador de luz ultravioleta. O tamanho do
produto é então estimado comparando as bandas
do produto com marcadores de peso molecular
apropriados. Os marcadores são misturados com
fragmentos de DNA e carregados próximos aos
produtos de PCR no gel de agarose. Eles podem
ser obtidos de fragmentos de DNA igualmente
espaçados com incrementos variando entre 10
pares de base e 1.000 pares de base, ou eles
podem ser produzidos pela digestão de um pedaço
de DNA com uma ou mais enzimas de restrição.
Os “primers” e outros produtos pequenos podem
também aparecer como bandas difusas próximas
à borda do gel. Outras bandas adicionais no gel
podem ser resultado de reações inespecíficas ou
presença de fitas únicas de DNA.
A PCR APLICADA À ODONTOLOGIA
A aplicação da técnica de PCR na pesquisa
odontológica permite uma grande aproximação
entre os profissionais envolvidos na clínica e na
pesquisa científica, podendo, num futuro próximo
ampliar, de um lado a qualidade do diagnóstico e
tratamento, e de outro, as chances de investigação
efetiva em doenças bucais através da expressão
gênica de populações e indivíduos.
Na odontologia, a PCR tem aplicação direta
nas áreas de Patologia, Periodontia, Endodontia,
Odontologia Social e forense. Desde sua
introdução, a tecnologia da PCR tem sido
reconhecida como uma ferramenta de diagnóstico
rápida, sensível e específica e pode ser aplicada a
qualquer situação que exija amplificação de DNA
para que ele possa ser detectado, principalmente,
quando a quantidade de DNA é limitada.
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São especialmente importantes os testes
diagnósticos para análise microbiológica, através
da identificação de patógenos relacionados às
doenças periodontais, pulpares, periapicais e à
cárie. Bactérias encontradas clinicamente em
pequena quantidade e que dificilmente seriam
detectadas por um cultivo bacteriano, podem ser
detectadas com alta sensibilidade através desta
técnica13. No caso de diagnóstico de doenças
virais, se o material genético do vírus for RNA, este
é extraído, transcrito em cDNA e amplificado pela
PCR10,15.
A PCR pode ser empregada para se estudar
alterações genéticas correlacionadas com
determinadas patologias. Nestes casos, o DNA do
paciente é extraído do sangue ou das células do
paciente e, por exemplos, polimorfismos genéticos
podem ser investigados.
Um diagnóstico individualizado da
susceptibilidade a doenças específicas, como, por
exemplo, da periodontite e câncer, pode vir a ser
uma das aplicações clínicas desta técnica.
Recentemente, estudos têm sugerido que uma
significante parte da predisposição ou resistência
individual a periodontite pode estar relacionada a
fatores genéticos. Polimorfismos no gene da
Interleucina-1, além de outros genes, foram
associados com a severidade da periodontite
crônica3,8.
A PCR pode também ser empregada para
análise de material histológico, por exemplo, para
se detectar alterações genéticas associadas a
neoplasias. Em oncologia, a PCR tem sido
empregada para elucidar mecanismos
fundamentais da transformação maligna, tipagem
de tecido e estudo da expressão gênica1.
Ainda, a expressão gênica de proteínas tem
pode ser estudada através da PCR. Após extração
do RNA de biópsias de tecidos periodontais, de origem
endodôntica, ou tumorais, este RNA é transcrito em
cDNA e, em seguida, amplificado por PCR.
Um dos grandes desafios da pesquisa básica
é tornar as técnicas e conhecimentos adquiridos
aplicáveis à melhoria do tratamento de pacientes.
A PCR tem potencial para se transformar em uma
ferramenta adicional para o diagnóstico de várias
doenças, permitindo o estabelecimento de um
diagnóstico e prognóstico mais precisos e
tratamento individualizado.
CONCLUSÃO
A PCR é uma técnica relativamente
simples, exigindo cuidados de otimização da reação
para cada situação. A aplicabilidade clínica da
técnica é bastante extensa em Odontologia,
entretanto, um custo adicional é incorporado.
AGRADECIMENTOS
À aluna de mestrado Fernanda Almeida e à técnica
Dra. Maria das Graças Silva Valenzuela por lerem
criticamente o trabalho.
ABSTRACT
The Polymerase Chain Reaction (PCR) has changed
the science. The PCR technique is now so important
that is difficult to think of molecular biology without
it. The technique is based on the amplification of
specific sequences of nucleic acids, and has
received widespread application in many diverse
fields such as forensic science, histopathology,
microbiologic etc. The aim of this paper is to explain
the essentials of the basic PCR technique and
optimization of the procedure, approaches to
sample preparation, and show its application.
UNITERMS: Polymerase chain reaction
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Endereço para correspondência:
Patricia Ramos Cury
R. Abolição 1827, Campinas, SP,
CEP:13045-610, Brasil
Telefone/Fax: 55-19-3237-3611, e-mail:
patriciacury@slmandic.com.br
Recebido para publicação em 01/04/2005
Enviado para análise em 29/04/2005
Aprovado para publicação em 19/10/2005
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