Resumos Aulas Práticas RRTE

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AULAS PRÁTICAS REPARAÇÃO E REGENERAÇÃO DE TECIDOS
AULA 1 – Princípios básicos de culturas celulares
Cultura celular
Meio de manter células vivas, em ambiente controlado. Pode-se manter o pH através de uma solução tampão, a temperatura, a pressão osmótica (pela quantidade de água na incubadora, mantida através de um recipiente de água estéril inserido no seu interior), pressão de O2 e CO2 controlados.
Permitem maior reprodutibilidade do que culturas in vivo, visto que estas têm muitas condições que não é possível controlar. Por este motivo, muitos resultados in vitro não são possíveis de extrapolar para in vivo, sendo também necessário recorrer a estes ensaios. 
Culturas primárias 
Utilizam-se células extraídas de tecidos vivos. Pode ser feita por migração de células, desagregação (mecânica ou enzimática) ou suspensões celulares. 
Linha celular
Cada vez que uma célula se replica, o telómero vai encurtando, o que significa que se têm linhas finitas. Com a atuação da telomerase, como em células cancerígenas, as tinhas são infinitas/contínuas. Podem-se utilizar modificações químicas ou alterações genéricas através de vírus para fazer linhas contínuas. Primeiramente utilizam-se estas para realizar experiências, passando-se depois para linhas finitas, visto que são mais semelhantes às condições reais. 
Células aderentes
Precisam de um frasco inerte (para este não ser responsável por alterações), não tóxico, transparente, que permita adesão celular e movimento. Utiliza-se poliestireno carregado negativamente. É feito através de tratamento de plasma. 
Frascos T-25: têm 25 cm2 de área para as células crescerem. 
Células em suspensão
Recipientes hidrofóbicos com agitação por íman. São idênticos aos recipientes utilizados em células aderentes, em termos de formato, mas não têm qualquer tratamento porque não se quer que ocorra adesão. 
Incubadoras de CO2
Mantém-se uma atmosfera de 5 a 10% de CO2, uma vez que o meio tem bicarbonato de sódio, estando em equilíbrio. Os frascos não podem ter a tampa completamente fechada, para permitir trocas gasosas. Abre-se a incubadora pouco tempo, para não perder CO2 e retiram-se as células durante o menor tempo possível. A humidade também deve ser mantida, pelo que contêm água. 
Meio de cultura celular
Fornece o microambiente bioquímico da cultura, isto é, aminoácidos essenciais, vitaminas, sais, hidratos de carbono e outros componentes, em solução aquosa. 
Podem-se criar sub-culturas quando o espaço onde se encontram as células está totalmente preenchido ou quando acabam os nutrientes, caso contrário estas começam a morrer. 
Estes meios são geralmente suplementados com Fetal Bovine Serum/Calf serum: fornecem proteínas e fatores de crescimento. São fornecidos ainda antibióticos (o que pode criar resistência) e fungicidas (tóxico para algumas células). 
Fenol red
Permite ver se o pH das células está dentro da gama pretendida. A cor rosa indica pH básico e amarelo indica ácido. O fenol red é tóxico para células embrionárias - nesses casos, utilizam-se meios transparentes. 
Serum-free media
Tem concentrações definidas. Utilizado para transplantes de tecidos visto que a diferenciação é controlada, reduzindo a variabilidade de batch para batch. É mais caro, mas como o outro tipo de meio é de original animal, pode trazer vírus ou priões. Este meio é mais usado para iPS ou células embrionárias. 
Células do tipo aderente
Estimuladas por:
Poly-D ou Poly-L lisina: muito usadas em culturas de neurónios
Proteínas da matriz extracelular: colagénio, fibronectina, laminina
Quando mudar as células de sítio?
Estas devem ser trocadas ainda na fase exponencial, antes de atingirem a confluência, visto que são menos suscetíveis a alterações de comportamento. Praticamente, corresponde a 60/80% da placa ocupada. 
Destacam-se as células da superfície por ação de protéases, ficando fusiformes quando voltam a aderir. 
Processos de dissociação celular
Proteases
As proteases são enzimas que quebram as ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas. 
A tripsina é uma enzima específica que atua a nível das proteínas na membrana. Cliva entre a lisina e a arginina. Se atuar por muito tempo, pode matar as células. 
A colagenase atua a nível do colagénio. 
A accutase tem origem nos crustáceos e tem a vantagem de não transportar doenças.
EDTA
Trata-se de um agente complexante que se liga ao cálcio. A integrina necessita de cálcio e, desta forma, as células não ligam tão facilmente. 
Outras condições de cultura
Culturas dinâmicas
Spinner flasks: usados para culturas em suspensão. Promove uma melhor perfusão de nutrientes/O2 em culturas 3D (scaffolds, microbeads).
Perfusion chambers: fluxo controlado
Transwells 
São pequenos recipientes constituídos por uma membrana. Permite estudar a migração celular. Usados para ensaios de migração, co-culturas indiretas e gradientes de células. 
Microfluídica 
Engloba aparelhos e técnicas para cultivar, manter, analisar e experimentar, utilizando células, com volumes na microescala. Existem dispositivos apenas com um canal e outros com múltiplos canais. 
Vantagens:
Flexibilidade no desenho do aparelho
Reduzido número de células
Baixo consumo de nutrientes
Co-cultura controlada 
Automação 
Desvantagens:
Protocolos não standardizados 
Superfície não standardizada (usa-se PDMS)
Volumes muito pequenos
 
Boas práticas laboratoriais 
Culturas de células humanas e animais
A utilização de células humanas e animais está a aumentar cada vez mais como base para sistemas de teste simplificados, sistemas estes que têm o potencial para serem mais controláveis e mais reprodutíveis do que os sistemas de teste que empregam animais em laboratório. No entanto, é muito importante que os componentes essenciais desse sistema reduzido sejam rigorosamente definidos e que possam ser reproduzidos. 
Técnicas de assepsia 
Promovem uma barreira entre os microrganismos e o ambiente onde se cultivam as células. Trata-se de uma barreira para bactérias, micoplasma, leveduras e fungos. 
Consegue-se ver quando há uma contaminação porque o meio fica ácido (amarelo), devido à presença do fenol red. Por vezes pode também ocorrer a degradação do biomaterial o que leva à alteração das condições do meio. 
Bactérias: são facilmente detetadas com o fenol red (amarelo). Por vezes a alteração da cor pode ser devida à degradação do biomaterial e, neste caso, a suspensão também fica turva. 
Leveduras: apresentam cerca de 40 de diâmetro. O meio fica turvo com a sua presença e o pH básico (cor rosa forte). Podem também ser identificadas ao microscópio. 
Fungos: fica com aspeto de algodão. Os fungos podem ter esporos latentes que, se não desaparecerem, as células são subcultivadas e permanece a contaminação. 
Micoplasma: apresentam dimensões abaixo de 1 . Se não for uma contaminação muito grande não se consegue saber que esta bactéria está presente, apesar de haver um crescimento inferior ao normal. Têm de ser feitos testes de PCR – análise ao nível do DNA. Pode-se corar os núcleos com DAPI, por exemplo, e vê-se os resíduos do micoplasma. 
Se se receberem células de outros laboratórios, estas têm de ser inseridas numa incubadora especial, uma vez que não se conhece a origem das células. 
Câmaras de fluxo laminar
Para além disto, é também necessário controlar as partículas que estão no ar. Faz-se este processo através da utilização das câmaras de fluxo laminar, que são muito vantajosas visto que permitem trabalhar em ambiente estéril. O ar é filtrado com um filtro HEPA, feito de uma malha de fibra de vidro que consegue filtrar quase 100% das partículas com dimensões superiores a 0.3 . 
Podem-se ter câmaras horizontais, onde existe um pré-filtro e o ar entra pela base da câmara, sendo que o filtro HEPA torna o ar estéril, estando numa posição perpendicular à área de trabalho. Neste caso, não há uma proteção muito grande do operador, mas sim das amostras. 
Nas câmaras verticais, o filtroHEPA encontra-se no topo da área de trabalho e o ar é recirculante. O operador está mais protegido porque tem um escudo de vidro e o fluxo de ar estéril vem de cima para baixo. 
O ar flui a uma velocidade constante e em fluxos paralelos (fluxo laminar). Na área de trabalho, como este vem de cima para baixo, tem de se ter cuidado para não por os objetos que não estão estéreis por cima dos que estão. A turbulência é um fator que provoca a entrada de ar num espaço, pelo que se devem fazer movimentos lentos dentro da câmara, tendo sempre cuidado ao inserir os materiais que estão a causar turbulência. 
As tampas devem sempre ser colocadas viradas para baixo. Deve-se utilizar sempre luvas e mudá-las com frequência, limpar a superfície da câmara antes e depois de se começar a trabalhar com etanol a 70%, e passar tudo o que não for estéril por álcool. 
Contagem de células – câmara de neubauer
Na maioria dos casos em que se utilizam culturas celulares é necessário contar o número de células que se está a utilizar. O uso de um número de células consistente vai manter um crescimento ótimo e permite também tornar standard certos procedimentos que utilizam estas culturas. 
Têm-se 9 quadrados maiores, sendo que cada lado do quadrado tem 1 mm. Assim, tem-se uma área de 1 mm2. A contagem é feita nos 4 quadrados numerados com A, B, C e D. 
O espaço entre a lamela e a superfície da grelha tem 0.1 mm – é possível calcular o volume e saber o número de células para esse volume. Deste modo, tem-se um volume de 0.1 mm3 ou 10-4 mL. 
Retira-se 10 da suspensão celular e mistura-se com 10 de Trypan Blue, um corante que quando a membrana já não está ativa consegue penetrá-la. Assim, as células mortas tornam-se azuis, permitindo distinguir das restantes. 
Algumas células vão estar situadas nas fronteiras dos quadrados, pelo que quando isso acontece conta-se a célula apenas de um lado. Por exemplo, do lado esquerdo na fronteira não se conta, contando-se apenas à direita. Do mesmo modo, conta-se em cima e em baixo não, ou vice-versa. 
Assim, obtém-se o número de células por mL, que é a média das contagem efetuadas em cada quadrado. Multiplica-se pelo fator de diluição, que corresponde ao quociente entre o volume final que é colocado na câmara e o volume inicial da suspensão celular. 
AULA 2 – EFEITO DA ZIRCÓNIA E HIDROXIAPATITE NA DIFERENCIAÇÃO OSTEOGÉNICA DE MC3T3-E1
Introdução teórica
O osso apresenta uma matriz orgânica (colagénio tipo I e proteínas) e inorgânica (hidroxiapatite – em forma de cristais nanométricos parcialmente substituídos, em que os iões de cálcio estão parcialmente substituídos por magnésio, sódio,…). Este apresenta vascularização e enervação. 
Existem dois tipos de osso:
Osso esponjoso/trabecular: apresenta muitos poros.
Osso compacto/cortical: não possui trabéculas. É constituído por lamelas concêntricas de colagénio e hidroxiapatite que formam os osteón, grupos circulares. Cada um apresenta um canal haversiano por onde passa o sistema de circulação do osso e as lamelas. Cada lamela é constituída por fibras de colagénio e estas, por sua vez, são constituídas por uma fibrila, que tem no seu interior pequenos cristais de hidroxiapatite – dão resistência mecânica ao osso. 
Os osteoclastos provêm da medulla óssea e estão constantemente a degradar a matriz extracelular. São células com grandes dimensões que vão dissolver o osso. São formados a partir de duas ou mais células que fundem, pelo que normalmente têm mais do que um núcleo. 
Os osteoblastos são responsáveis pela síntese dos componentes orgânicos da matriz óssea, podendo ser encontrados na superficie do osso. Sofrem maturação e transformam-se em osteócitos, sendo responsáveis pela manutenção ao longo do tempo. 
Os biomateriais podem ser utilizados como enxertos ósseos, em substituição de autografts, allografts e xenografts. Estes têm a vantagem de estarem disponíveis em grandes quantidades, serem reprodutíveis e fiáveis. 
Os cerâmicos são definidos como materiais inorgânicos, sendo constituído por um metal e um não metal que se ligam entre si por ligações covalentes ou iónicas. Todos os biocerâmicos que são implantados no corpo humano provocam uma resposta no tecido hospedeiro, podendo ambos sofrer modificações físicas e químicas. Assim, os biocerâmicos podem-se dividir em dois tipos diferentes, de acordo com as interações que ocorrem entre o tecido e o implante. 
Os cerâmicos bioinertes são estáveis, quase biologicamente inativos. A zircónia é um biomaterial que apresente osteointegração, por exemplo. Este cerâmico é normalmente utilizado para fins ortopédicos e aplicações dentárias tendo em conta a sua elevada biocompatibilidade, resistência à fratura e cor. 
Por outro lado, os cerâmicos bioativos têm a capacidade de provocar uma resposta biológica que resulta na formação de uma ligação entre o tecido e o material. Todos os implantes bioativos formam uma camada de hidroxiapatite na superfície do material que apresenta uma composição semelhante à parte mineral do osso. A interface entre os ossos, tendões e ligamentos é semelhante à interface entre um implante bioativo e o osso. 
Diferentes fases do grupo dos fosfatos de cálcio podem ser utilizadas para reparar partes danificadas do tecido ósseo, no entanto, a hidroxiapatite é o composto mais utilizado dada a sua bioatividade e similaridade com o osso. Pertence ao grupo das apatites e o rácio Ca/P é 1.67. A hidroxiapatite permite a adesão, proliferação e diferenciação de osteoblastos. Em modelos animais com lesões ósseas, os implantes de HA apresentam uma boa osteointegração e osteocondutividade. 
Nas aulas laboratoriais, os osteoblastos vão estar na presença de zircónia e hidroxiapatite e o seu efeito na diferenciação osteogénica vai ser avaliado. 
Implantes dentários
Para ficarem fixos é necessário haver um equilíbrio entre a osteointegração e o crescimento dos tecidos conectivos epiteliais. Pretende-se que não se desenvolvem respostas alérgicas aos materiais, o que acontece por vezes com o titânio. 
Na área dentária a parte estética é muito importante, pelo que o titânio não é a melhor opção, uma vez que a superfície se degrada e fica cinzenta. A zircónia permite resolver estes dois problemas, fazendo-se modificações na sua superfície e avaliando se promove a osteointegração e a diferenciação celular. 
Métodos de litografia
Pode-se modificar a superfície de um material através da litografia. 
Utiliza-se uma pastilha de silício e uma fotomáscara (deixa passar seletivamente radiação UV, de acordo com a radiação pretendida), que permite polimerizar a resina. 
A pastilha é lixiviada com reagentes, ficando-se com a geometria pretendida impressa. 
Insere-se PDMS (funciona como carimbo) sobre esta geometria e obtém-se o seu negativo. 
Com a zircónia, utiliza-se sílica para modificar a sua superfície, um material líquido bioativo. 
Pressiona-se o carimbo sobre a sílica, deixa-se durante 2 horas e obtém-se a geometria pretendida. 
FabrÍCO de micropadrões de superfícies revestidas por sílica em substratos de zircónia
Podem-se ter pilares de sílica com 5 um de diâmetro e espaço entre eles, e sulcos de 5 um de diâmetro e 10 um de espaço entre eles. Colocam-se as células nestas geometrias finais e verifica-se o que acontece.
Verificou-se que o comportamento das células foi totalmente afetado pela geometria do material, isto é, células estaminais da polpa dentária cresceram de acordo com os padrões, alinhados com os sulcos. 
Nos pilares, as células crescem desorganizadamente, ao contrário do que acontece com as linhas, em que as células comunicam entre si e crescem alinhadas. Na zona onde se têm linhas e ausência de linhas, consegue-se ver que as células comunicam entre si, crescendo alinhadas em todas as zonas. 
Usando matrigel, que estimula as células endoteliais em arranjos tipo vaso, estas também se alinham de acordo com a superfície. Deste modo, conclui-se que se pode guiar o crescimento dos tecidos com a superfície.Posteriormente, cora-se o citoesqueleto e o núcleo das células. Pode-se realizar este processo com um corante que tem um fluorocromo (alexa fluor 488) que liga à faloidina, um péptido que tem afinidade com a actina. Cada unidade de faloidina liga-se a uma subunidade de actina, constituinte da matriz. Faz-se incidir laser sobre a faloidina para se ter excitação do fluorocromo, que emite luz na zona do verde. Para corar o núcleo utiliza-se iodeto de propídio. 
Para verificar a diferenciação das células utiliza-se ALP (alkaline phosphatase). Os marcadores para averiguar se as células se estão a diferenciar mostram que na fase final há mineralização – produção de osteopontina e osteiocalcina. Vai havendo sempre produção de ALP, e esta vai aumentado, sendo por este motivo utilizada como biomarcador. 
Diferenciação celular
Existem fatores que induzem a diferenciação celular, como soro bovino, antibióticos e dexametazona. 
Para verificar a diferenciação celular, marcam-se as células com ALP. Há mais atividade de ALP na zircónia com micropadrões de pilares. O alongamento celular para superar a forma dos pilares adiciona uma ação mecânica na diferenciação celular. 
Usando marcadores apropriados, é possível seguir a concentração de determinados produtos. Pode-se ver isto através do gráfico:
Na fase final ocorre mineralização – produção de osteopontina e osteocalcina
Há um aumento constante da concentração de ALP (usado como biomarcador)
Dexametazona
Um glucocorticoide sintético que atua na osteogénese, promovendo indiretamente a expressão do gene Runx2, sendo produzida a proteína Runx2. Esta proteína está envolvida na produção e manutenção do osso, dentes e cartilagem, sendo uma proteína de transcrição/fator de transcrição que se liga ao DNA, permitindo que haja transcrição diferencial de uns genes em detrimento de outros. 
A dexametazona, introduzida no meio, atua aumentando a expressão da proteína FHL2, que se vai ligar à -catenina, potenciando o transporte da -catenina para o núcleo, onde se encontra o DNA. Este composto liga-se ao complexo LEF-1/TCF, que leva à transcrição da Runx2. 
Por outro lado, a dexametazona promove a formação de TAZ e MPK1. A MPK1 desfosforila e atua sobre a proteína Runx2, permitindo que esta se ligue ao TAZ. Este é um co-ativador do gene Runx2. A via de sinalização ERK fosforila o complexo TAZ-Runx2, permitindo a sua ligação ao DNA. Este aumenta a transcrição de fatores relacionados com a diferenciação celular. 
Deste modo, a dexametazona atua sobre a transcrição do gene da Runx2 e também sobre a proteína Runx2. 
-Glicerofosfato
Atua na parte final da diferenciação, sendo uma fonte de fosfato para produzir hidroxiapatite. 
Ácido ascórbico
Provoca a hidroxilação da prolina, um aminoácido existente no colagénio que promove a estabilidade da tripla hélice do colagénio tipo I no organismo. 
Assim, este composto aumenta a secreção de colagénio tipo I, que sai da célula, atua a nível da integrina e estimula uma via de sinalização celular que tem ligação com o Runx2 (ERK), que é a mesma que fosforila o complexo TAZ+Runx2. 
Quanto mais ácido ascórbico, maior é a produção de colagénio, sendo maior a hidroxilação e maior é a estimulação de transcrição de genes relacionados com a diferenciação celular. 
PROTOCOLO 
Transferir zircónia e hidroxiapatite para uma placa de 24 poços (tissue culture polystyrene (TCPS) plate). 
Adicionar MEM Alpha Medium (anexo 1) a cada amostra
Preparar uma suspensão celular de MC3T3-E1 no meio preparado previamente (anexo 1) 
Aspirar o meio de cultura dos biomateriais 
Adicionar suspensão celular aos discos de acordo com o esquema 
Adicionar o mesmo volume de suspensão celular aos poços de TCPS indicados no esquema, previamente preenchidos com 450 uL de meio de cultura suplementado com indutores osteogénicos (anexo 2)
Incubar
Adicionar 450 uL de meio de cultura celular suplementado com indutores osteogénicos aos discos de zircónia e hidroxiapatite
Incubar
Anexo 1 – cultura de células osteoblásticas mc3t3-E1 
Introdução teórica
A linha celular osteoblástica MC3T3-E1 foi selecionada com base na sua elevada atividade da ALP no estado de repouso. As células têm a capacidade de se diferenciar em osteoblastos e osteócitos e já foi demonstrado que formam tecido ósseo calcificado in vitro. Os depósitos minerais foram identificados como sendo hidroxiapatite. 
A maioria das células dos tecidos sólidos crescem como monocamadas aderentes e, a não ser que se transformem e se tornem células não aderentes, estas têm de se ligar e espalhar no substrato antes de começarem a proliferar. 
As linhas celulares aderentes vão crescer in vitro até cobrirem toda a superfície da área existente ou até o meio ficar sem nutrientes. Neste ponto, tem de ser realizada uma subcultura, de modo a prevenir a sua morte. Para realizar a subcultura de células numa monocamada, estas têm de estar em suspensão de modo a passar de um recipiente para outro. Na maioria dos casos, proteases, como a tripsina, são utilizadas para quebrar as ligações peptídicas e libertar as células do frasco. 
Soluções
Preparação de alíquotas de penicilina e estreptomicina
Penicilina – as penicilinas contêm um anel ativo, o anel -lactâmico, que partilham com as cefalosporinas. Todos os antibióticos -lactâmicos (penicilinas e cefalosporinas) interferem na síntese da parede celular bacteriana, através da sua ligação com as enzimas PBP. 
Estreptomicina – é uma proteína inibidora da síntese. Liga-se à pequena subunidade 16S do rRNA da subunidade 30S do ribossoma bacteriano, interferindo com a ligação da formil-metionil-tRNA à subunidade 30S. Isto leva à leitura incorreta dos codões, inibição da síntese de proteínas e morte de células microbianas. 
Preparação de alíquotas de FBS inativadas pelo calor 
Fetal bovine serum (FBS) corresponde à fração do sangue remanescente depois da sua natural coagulação, seguido de centrifugação de modo a remover quaisquer glóbulos vermelhos ainda existentes. Esta solução provém do sangue extraído de um feto de bovino através de um sistema de colheita no matadouro, sendo um dos suplementos mais utilizados na cultura celular in vitro de células eucarióticas. A sua utilização deve-se ao facto de conter um baixo nível de anticorpos e muitos fatores de crescimento, sendo versátil para muitas aplicações. 
A proteína globular, BSA, é o maior componente do FBS. A maioria das proteínas existentes no FBS mantem as células num meio em que conseguem sobreviver, crescer e dividir-se. 
Preparação do MEM Alpha Medium 
O meio essencial mínimo de Eagle é um meio de cultura celular desenvolvido pelo Harry Eagle que pode ser utilizado para manter células num tecido. 
Este meio contém:
Aminoácidos
Sais (cloreto de cálcio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sólio, … )
Glucose
Vitaminas
O MEM Alpha é uma modificação do MEM que contém aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio, ácido tioctico, vitamina B12, biotina e ácido ascórbico. Este pode ser utilizado numa grande variedade de suspensões como células aderentes de mamífero, incluindo queratininos, ratos e células de melanoma humano. 
Tripsinização
Tripsina – protease que quebra as ligações peptídicas das proteínas. Pretende-se quebrar as ligações das proteínas envolvidas no processo de adesão celular. Esta não é específica, sendo que ataca qualquer tipo de célula. Para a bloquear de forma a que não ataque mais proteínas das células para além das de adesão coloca-se meio de cultura (rico em proteínas). O tempo da tripsina nas células depende também da linha celular. 
1 – Ver as culturas ao microscópio de forma a avaliar o grau de confluência e confirmar a ausência de contaminações bacterianas ou fúngicas
2 – Aspirar o meio de cultura – este está à mesma temperatura das células, pelo que está em banho maria
3 – Lavar a monocamada de células com PBS estéril – limpar restos do meio e células mortas, que pode ser um motivo par a tripsina não ser tãoativa
4 – Adicionar tripsina à monocamada de células
5 – Incubar 3-5 minutos e observar as células ao microscópio para assegurar que estas estão soltas e a flutuar. A tripsina tem que estar baça e, caso exista ainda uma camada de células imóveis, pode-se dar pancadas porque estas têm de estar a flutuar
6 – Adicionar meio de cultura para parar a reação – up and down várias vezes e movimentar o frasco para lavar a superfície onde estavam as células. Adiciona-se o triplo do valor da tripsina usada (meio base, cor-de-rosa, com aminoácidos e sais + soro. O soro é que bloqueia a tripsina. 
7 – Transferir a suspensão celular para outro tubo e centrifugar durante 7 minutos para ficar com o pellet de células. Identificar frasco. 
8 – Re-suspender novamente no volume pretendido 
9 – Observa-se na câmara de Neauber e conta-se as células 
Cálculos 
Para obter um volume final de 3 mL é necessário adicionar 1,9 mL de meio e 1,1 mL de solução celular. 
AULA 3 – Coloração histoquímica da atividade da ALP
Introdução Teórica
Através do método Sigma-Aldrich, a fosfatase alcalina é detetada depois da fixação de uma camada de células. As células fixadas são depois encubadas numa solução contendo “naphthol AS-MX phospate”. Como resultado da atividade da fosfatase, o naphtol AS-MX é libertado e junta-se imediatamente a um sal de diazónio (Fast Violet B salt), formando um pigmento solúvel e visível (de cor vermelha) em locais da atividade da fosfatase. 
Um dos reagentes utilizados é o paraformaldeído, que serve para fixar as células de modo a permitir a coloração. 
Reagentes
Paraformaldeído e PBS
São utilizados para fixar as células. O paraformaldeído não é um fixador, tem de ser despolimerizado para formaldeído em solução. Na cultura celular, uma fixação típica de paraformaldeído envolve usar 4% de formaldeído em PBS.
Porque é que é necessário fixar as células antes de as tingir? 
É necessário permeabilizar as células para permitir que a tinta aceda às estruturas intracelulares. Sem fixação, as estruturas nas células iriam difundir durante os processos de lavagem. 
Fast Violet B Salt Grade III
Usado para coloração de fosfatase alcalina em células
Napthyol AS-MX Phosphate alkaline
Substrato para a demonstração histoquímica da fosfatase alcalina. Substrato seletivo de fosfatase alcalina.
Soluções
Preparação de 200 mL de solução de paraformadeído a 3.7%
Transferir 7.4 g de paraformaldeído em pó para um frasco de vidro de 250 mL.
Adicionar 160 mL de água desionizada
Adicionar 100 uL de NaOH 1M
Fechar o frasco e aquecer até 70ºC. Misturar até ocorrer solubilização completa (~10 min).
Colocar em gelo e deixar a solução arrefecer até à temperatura da sala.
Ajustar até ao volume de 180 mL com água
Adicionar 20 mL de PBS 10X e misturar.
Filtrar a solução utilizando um filtro de 0.2 uL e preparar 5/10 mL de alíquotas em falcons de 15 mL.
Guardar a -20ºC.
Preparação da solução Fast Violet
Adicionar 12 mg de Fast Violet B salt (uma cápsula) a 48 mL de DDW (glass destilled deionized water). Misturar e preparar alíquotas de 2 mL. 
Preparação da solução de Naphtol AS-MX Phospate alkaline 
Adicionar 120 uL de Naphthol AS-MX Phosphate alkaline a 3 mL de Fast Violet e misturar. 
Filtrar utilizando um filtro de seringa (0.80 um).
Métodos
Remover o meio de cultura dos poços.
Lavar 2 vezes com PBS à temperatura da sala.
Adicionar 400 uL de paraformaldeído ao PBS e deixar 15 minutos à temperatura da sala. 
Lavar com DDW. 
Feito na aula:
Adicionar 400 mL de solução de Naphthol AS-MX Phosphate alkaline. 
Incubar 30-45 minutos a 18-26ºC. 
Lavar 2 vezes com água DDW. 
Observar através de luz transmissiva ou através do estereomicroscópio. 
Resultados
Como resultado da atividade da fosfatase alcalina, o naphthol AS-MX é libertado e liga-se ao sal diazónio, formando um pigmento visível e insolúvel de cor vermelha nos sítios onde há atividade da fosfatase. 
Na observação ao microscópio, concluiu-se que nos materiais no dia 1 de incubação quase não ocorrer diferenciação celular, no dia 7 já se viu sinais de diferenciação e, por fim, no dia 14, as células já se encontravam bastante diferenciadas. 
	
	Dia 1
	dia 7
	dia 14
	TCPS
	Não há diferenciação
	Diferenciação
	Mais diferenciação uniformemente distribuída
	HydroXIAPATITE
	Não há diferenciação
	Diferenciação
	Mais diferenciação uniformemente distribuída
	Zirconia
	Não há diferenciação
	Diferenciação
	Mais diferenciação uniformemente distribuída
Conclui-se que o tipo de material (TCPS, hidroxiapatite e zircónia) não têm influência na diferenciação celular, apesar de poder ter noutros fatores como na proliferação e adesão.
Quantificação de proteínas utilizando o método de bca
Introdução
O método de BCA para quantificação total de proteínas baseia-se na redução de Cu2+ a Cu+ em meio alcalino, mediada por proteínas (biuret reaction). A presença de um catião é detetada com alta sensibilidade e seletividade através de uma deteção colorimétrica, utilizando um reagente contendo BCA (bicinchoninic acid). O produto de reação, de cor roxa, é formado pela quelação de duas moléculas de BCA com um catião Cu2+. Este complexo solúvel em água tem uma absorvância forte a 562 nm, sendo praticamente linear com o aumento da concentração de proteínas entre 20-2000 ug/mL. 
NOTA – A quelação é uma interação química formada por ligações covalentes coordenadas ou dativas.
A estrutura macromolecular de proteínas, o nº de ligações peptídicas e a presença de 4 aminoácidos (cisteína, cistina, triptofano e tirosina) são responsáveis pela formação de cores com BCA. Alguns estudos sugerem que a extensão da formação de cor é causada por mais do que apenas a soma de cores individuais produzindo grupos funcionais. A concentração de proteínas é normalmente determinada e calculada em referência a proteínas comuns como a BSA. 
O complexo BCA + Cu+ é influenciado pela presença de cadeias laterais de cisteína, cistina, triptofano e tirosina. A temperaturas elevadas, ligações peptídicas ajudam na formação do complexo de reação. A reação consiste na formação de um complexo colorida entre ligações peptídicas e átomos de cobre, num meio com Cu2+. 
Objetivos
Quantificação total de proteínas. 
Reagentes
PBS
Phosphate-buffered saline, usado para processos de lavagem
Triton X-100
Usado para a lise celular, para extrair as proteínas. Neste passo é importante rodar o biomaterial para que todas as células entrem em contacto com o Triton. A solução vai também sofrer sonicação para destruir mecanicamente qualquer célula que ainda permaneça viável. 
Preparação de soluções 
As soluções de BCA e albumina são preparadas no próprio dia. 
Reagente BCA/CuSO4
Timepoints: 1, 7 e 14 dias
Materiais: TCPs, HA e zircónia
Total para as amostras da experiência: 27 + 9 = 36 poços
Visto que cada grupo (1 replica por grupo) vai fazer uma curva de calibração, são necessárias:
Total: 36 + 36 poços
Preparar o reagente BCA/CuSO4 numa proporção de 50 partes de reagente A para 1 parte de reagente B.
Volume de reagente A necessário: 200 uL/poço * (36 poços + 36 poços de BSA) = 14400 uL. Adicionar 3000 uL para ter reagente em excesso, o que dá um total de 17400 uL. 
Volume de reagente B necessário: 17400 uL/50 = 348 uL
Reagente BCA/CuSO4: 17400 uL de reagente A + 348 mL de reagente B. 
BSA Padrão
Para preparar a solução de BSA, adicionam-se 25 ug de BSA a 2.5 mL de H2O (Cf = 10 mg/mL). 
Partindo de 100 uL da solução de BSA, preparar 6 duplas diluições com água:
Diluição de 5 mg/mL: 100 uL de água + 100 uL de BSA
Diluição de 2.5 mg/mL: 100 uL da solução anterior + 100 uL de água
Diluição de 1.25 mg/mL: 100 uL da solução anterior + 100 uL de água
Diluição de 0.625 mg/mL: 100 uL da solução anterior + 100 uL de água
Diluição de 0.3135 mg/mL: 100 uL da solução anterior + 100 uL de água
Diluição de 0.1563 mg/mL: 100 uL da solução anterior + 100 uL de água
Diluição de 0.0782 mg/mL: 100 uL da soluçãoanterior + 100 uL de água
1% Triton
Adicionar 1 mL de triton a 99 mL de água. 
Protocolo
Semear as células nos diferentes materiais. 
Aspirar o meio de cultura dos poços e passar a camada de células por PBS duas vezes. 
Aspirar o PBS e congelar as células a -20ºC.
Descongelar. 
Adicionar 100 uL de Triton X-100 a cada poço, para provocar a lise celular. 
Incubar as amostras durante 30 minutos a 4ºC.
Realização a sonicação em gelo por 2 minutos (a sonicação corresponde a um recipiente de água através do qual se transmitem ondas sonoras, com o objetivo de acelerar as reações). A sonicação permite quebrar as membranas mecanicamente que ainda não foram quebradas.
Homogeneizar a solução e transferir 20 uL de cada poço. 
Adicionar 200 uL de reagente BCA/CuSO4 a cada poço. 
Incubar durante 30 segundos. 
Ler a absorvância a 562 nm. 
BSA padrão
Transferir 20 uL de cada solução padrão, em triplicado, para cada poço. Utilizar água como branco. Utilizaram-se as 5 últimas diluições do mais pequeno para o maior.
Adicionar 200 uL de reagente BCA/CuSO4 a cada poço. 
Incubar 30 segundos.
Ler a absorvância a 562 nm. 
Análise de resultados 
Para construir a curva de calibração, utilizam-se valores de absorvância do branco vs quantidade de proteína por poço. 
Através da curva de calibração pode-se extrapolar os valores das proteínas para valores desconhecidos. Para analisar os dados, subtrai-se a média da absorvância do branco aos valores de absorvância das amostras. 
Reta de calibração a partir da atividade metabólica das células – MTT Assay 
Este ensaio fornece informação acerca da atividade metabólica das células e da sua toxicidade. 
MMT é um sal solúvel/amarelo que permite medir a atividade metabólica das células e quantificar a sua toxicidade. É clivado pelas desidrogenases mitocondriais, que existem quando as células estão vivas e transformam o sal solúvel num sal insolúvel de cor púrpura, que depois é misturado com DMSO/isopropanol de modo a poder ser lido no leitor de placas de absorvância. Quanto mais enzimas a desidrogenase tiver, maior será a conversão para a cor púrpura e maior será a absorvância. 
Semeiam-se as células numa placa de TCPS (poliestireno com carboxilos à superfície), sendo que um polo vai ser o branco, sem células. Preenchem-se 5 poços, com células em concentrações crescentes, numa placa coberta com fibronectina e noutra placa usada para células não ancoráveis (suspensão), sem qualquer tipo de tratamento, para permitir a adesão celular. 
Ao traçar as retas de calibração, no fim observa-se que a fibronectina é a que promove mais o crescimento celular, seguida do TCPS e, por fim, do PS plate (que é utilizado para células que não aderem e estão em suspensão). 
Curva de calibração
Têm-se 3 replicas com 5 concentrações diferentes cada e valores de célula/poço associados. A absorvância foi medida para 540 nm e 690 nm.
: Remover o erro 
Fazer a média de todos os valores para a mesma concentração
Obter a absorvância vs concentração
Tratamento dos dados
Absorvância (540 nm) – absorvância (590 nm) – remover o erro
Absorvância (540 nm) = 0.1059 * nº de células + 0.0111 – tem-se a absorvância e obtém-se o nº de células (*104)
Calcula-se a média das células para cada material
Como esperado, o poliestireno revestido com fibronectina foi o que apresentou o maior número de células aderentes, uma vez que esta proteína se liga às integrinas da membrana celular e desempenha um papel importante na adesão celular.
AULA 4 – IN VITRO VASCULARIZATION OF A TISSUE-ENGINEERED CONSTRUCT
Introdução Teórica
Importância e requisitos das matrizes de suporte em Engenharia de Tecidos 
O uso de scaffolds de polímeros como um suporto para as células é uma das estratégias que tem sido adotada no desenvolvimento de novos tecidos para a medicina regenerativa. As scaffolds devem atuar como um substrato para promover a adesão celular, migração, proliferação, formação de matriz extracelular, assim como manter a função diferenciada. Com este propósito, as scaffolds devem cumprir um número de requisitos e características:
Interconectividade entre os poros e formas tridimensionais específicas.
Biocompatibilidade e reabsorvíveis com uma degradação controlada
Superfície química que promove a adesão celular, migração, proliferação, diferenciação e formação de matriz 
Resistência estrutural
No laboratório será realizada uma scaffold porosa de quitosano que será utilizada como suporte para uma cultura de células osteoblásticas. 
Quitosano 
O quitosano é um polímero biocompatível e reabsorvível obtido por N-desacetilação da quitina sob condições alcalinas, que atualmente está sob investigação para muitas aplicações biomédicas, incluindo suturas absorvíveis, engenharia de tecidos e libertação de moléculas bioativas.
No seu estado nativo, a quitina ocorre como microfilas cristalinas ordenadas que formam componentes estruturais no exoesqueleto de artrópodes ou nas paredes celulares de fungos e leveduras. Até ao momento, as principais fontes comerciais de quitina são cascas de caranguejo e camarão. 
É biodegradável, não tóxico, apresenta um versátil processamento sem serem usados solventes tóxicos e uma funcionalização fácil. 
Fibrina
Uma rede de fibrina é a primeira scaffold que uma célula encontra quando desempenha o seu papel na cicatrização. 
Os géis de fibrina unem-se rapidamente por uma reação de polimerização do fibrinogénio, um constituinte abundante do plasma sanguíneo, assim que a protease trombina é ativada na cascata de coagulação e começa a remover parte dos polipeptídeos do fibrinogénio que impedem a sua polimerização espontânea. 
A fibrina é muito utilizada como matriz para desenvolver modelos in vitro da microvasculatura. Esta é naturalmente angiogénica e os fatores de crescimento incluídos no gel são libertados ao longo de alguns dias. Os recetores de superfície celular endotelial microvasculares específicos para a matriz extracelular provisória rica em fibrina são importantes para mediar a angiogénese que ocorre durante a reparação da lesão e o crescimento do tumor. 
Vascularização para construção de tecidos
Um desafio importante na engenharia de tecidos é estabelecer uma eficiente vascularização para os tecidos que estão a ser formados de modo a garantir uma longa sobrevivência e função. As questões de perfusão de nutrientes e limitações no transporte de massa, especialmente a difusão de oxigênio, restringem o desenvolvimento de tecidos de dimensões menores do que os clinicamente relevantes e limitam a capacidade de integração in vivo. Durante os últimos anos, duas estratégias principais de vascularização surgiram no campo da engenharia de tecidos: 
A primeira estratégia foca-se no crescimento de pequenos vasos através dos vasos que se encontram ao redor, através da estimulação da angiogénese. Por outro lado, uma rede sanguínea completa e construída rapidamente por ser conseguida por inosculation. Neste caso, redes microvasculares pré-formadas são geradas dentro dos tecidos em construção antes da sua implantação. Esta abordagem tem a vantagem de que os micro-vasos pré-formados apenas têm de formar ligações com os vasos que existem ao redor da scaffold para terem uma rede vascularizada completa num curto período de tempo.
Angiogénese 
No seu estado normal, o estado de repouso (quiescent), as células endoteliais têm uma taxa de rotatividade muito lenta. No entanto, no seu estado ativo como na recuperação, inflamação, isquemia e órgãos reprodutivos femininos, as células endoteliais mudam o seu fenótipo para iniciar a angiogénese. As ECs ativas libertam várias proteínas para o meio envolvente para degradar a membrana basal. Os brotos vasculares crescem deste o vaso existente até ao espaço intersticial. Durante este processo, as células endoteliais situadas nas pontas destes brotos estendem-se através de longos filamentos, guiados pelo gradiente de concentração de fatores quimiostáticos, como o favor de crescimento endotelialvascular (VEGF). As ECS situadas nos caules vasculares proliferam em resposta ao VEGF. As ECs sofrem formação de vacúolos por pinocitose e fagocitose, e esses vacúolos formam lúmen na longa extensão dos capilares. 
Na fase de resolução subsequente, o capilar é estabilizado pelo término da proliferação de ECs e da síntese de nova membrana basal. Os vasos recém-formados amadurecem com o recrutamento de células murais, pericitos (célula tipo mesenquimal, associada com as paredes de vasos sanguíneos pequenos) e células musculares lisas, em capilares e em vasos maiores, respetivamente. Neste ponto, as ECs recuperam o seu estado de repouso normal. 
Resumindo:
1 – As células endoteliais ativas libertam várias proteases na área circundante para degradar a membrana 
2 – Durante o processo de saída dos vasos, ECs situadas na ponta dos vasos que estão a migrar estendem longos filamentos, guiados pelo gradiente de concentração de fatores quimiostáticos como o VEFG
3 - As ECs sofrem formação de vacúolos por pinocitose e fagocitose, e esses vacúolos formam lúmen na longa extensão dos capilares.
Hidrogel de fibrina 
A fibrina é um polímero natural formado durante a cascata de coagulação do sangue a partir da sua forma zimogénica (zimogenia corresponde à fermentação química), o fibrinogénio, que atua como uma matriz provisória durante a cicatrização. A molécula de fibrinogénio é composta por dois conjuntos de três cadeias de polipéptidos, que se unem através de seis pontes de dissulfeto. A fibrina é formada depois da clivagem mediada pela trombina no fibrinopéptido A nas cadeias A e do fibrinopéptido B nas cadeias B, com subsequentes alterações conformacionais e exposição dos locais de polimerização. Isto forma o monómero de fibrina que tem uma grande tendência a se auto-associar e formar fibrina insolúvel. Para além disso, o fator de coagulação sanguíneo XIIIa é uma transglutaminase que rapidamente promove o cross-linking das cadeias Y do polímero de fibrina. Assim, a fibrina é um hidrogel aprovado pela FDA, muito utilizado clinicamente, surgindo como uma matriz promissora para a aplicação tanto de enxertos ou como veículo de entrega de células e medicamentos. 
Quando são cultivadas por cima ou dentro de um gel de fibrina, as células endoteliais rapidamente se alinham e formam redes interligadas. 
Tipos de células utilizados
MC3T3-E1 
Linhagem de células osteoblásticas retiradas da calvária de ratinho e selecionada com base na atividade da fosfatase alcalina (ALP) no estado de repouso
As células têm a capacidade de se diferenciar em osteoblastos e osteócitos formando tecido ósseo calcificado. Os depósitos minerais tratam-se de hidroxiapatite. 
Humam pulmonar mircovascular endotelial cells line
Células imortalizadas
Apresentam os principais marcadores fenotípicos endoteliais, incluindo a molécula de adesão endotelial de plaquetas, o fator de von Willebrand e moléculas de adesão intercelular e vascular. 
Uma resposta angiogénica foi demonstrada através da formação de brotos numa matriz biológica extracelular.
São uma ferramenta valiosa no estudo da fisiologia e patologia da microvasculatura endotelial incluindo expressão génica, angiogénese e tumorigénese.
Objetivos
Nesta aula laboratorial serão inseridas células pré-osteoblásticas (MC3T3) em matrizes 3D de quitosano, e cultivadas em condições osteogénicas durante 3 dias. Seguidamente, células endoteliais pulmonares humanas (HPMEC-ST1.6R) serão adicionadas à matriz e co-cultivadas com as células MC3T3 durante 5 dias. De modo a promover a formação de uma rede vascular dentro da matriz porosa, o hidrogel de fibrina será sobreposto às scaffolds, inserindo-se também células cultivadas na presença de VEGF. O desenvolvimento das estruturas capilares vai ser avaliado através de microscopia confocal em amostras processadas com F-actina e coloração de DNA.
Reagentes
Human plasma fibronectin 
É uma proteína que se liga às integrinas da membrana celular e desempenha um papel muito importante na adesão celular. Vai ser utilizada para revestir as scaffolds. 
Complete M199 Medium 
Meio usado para as células HPMEC (células humanas). 
Fibrinogen stock solution 
Percursor da fibrina.
Tris-Buffered Saline (TBS) 
Vai manter o pH numa gama constante, aproximadamente 7.4.
Thrombin stock solution in TBS 
É uma serina protease que converte o fibrinogénio solúvel em fibras insolúveis de fibrina, e catalisa muitas outras reações relacionadas à coagulação.
CaCl2 solution in TBS 
Relacionada com a ação da trombina, é necessária para esta atuar.
Aprotinin stock solution in PBS 
É um inibidor competitivo da serina protease, tipicamente adicionado à fibrinólise lenta (impede que os coágulos sanguíneos cresçam e se tornem problemáticos, através da quebra do coágulo de fibrina), bloqueando os locais ativos das enzimas.
VEGF stock solution in basal M199 medium 
É um fator pré-angiogénico que desempenha um papel fundamental na formação fisiológica de vasos sanguíneos. O VEGF estimula o crescimento das células endoteliais, a angiogénese e a permeabilidade dos capilares. 
Procedimento experimental 
1 – CÉLULAS PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS
As matrizes 3D de quitosano são semeadas com células pré-osteoblásticas (células MC3T3) e cultivadas sob condições osteogénicas durante 3 dias.
A scaffold tem dimensões: 2 x 2 x 3 mm = 18 mm3
As matrizes de quitosano foram esterilizadas e hidratadas na câmara de fluxo (L.F.C.) através de imersões sequenciais numa série de soluções de etanol diluídas a 70, 50 e 25%, esterilizadas previamente por filtração, durante 30, 10 e 10 minutos, respetivamente. 
As células não reconhecem a superfície da scaffold pelo que se tem de adicionar fibronectina, que promove a adesão celular. 
2 – Human pulmonar microvascular endotelial cells
Human pulmonar microvascular endotelial cells (HPMEC) foram adicionadas à matriz em construção e co-cultivadas com MC3T3 por um período adicional de 5 dias.
Envisaged cell seeding density = 3 * 106 células/mL
Quantos uL são necessários?
	
As scaffolds conseguem absorver 20 L de líquido:
	
Têm-se 14 scaffolds, pelo que são necessários:
	
Contando as células na suspensão celular:
O volume final a utilizer deveria ser 3500 uL. Como não temos esta quantidade, utilizam-se todas as células. 
3 – formação de uma rede vascularizada
Para promover a formação de uma rede vascularizada no interior da matriz, a matriz de quitosano vai ser embebida num hidrogel de fibrina e seguidamente cultivada na presença de um indutor da angiogénese (VEGF
1 – Transferir 10 uL de fibrinogénio para um Eppendorf
2 – Adicionar 10 uL de solução de trombina à solução de fibrinogénio e homegenizar através da técnica de up and down
3 – Transferir imediatamente o volume total da solução de fibrina polimerizada – 10 uL para o centro da cultura de tecido
4 – Transferir a scaffold de quitosano colonizada com ambos os tipos de células para o topo da camada de fibrina polimerizada 
5- Adicionar meio de cultura que contém aprotinina (inibidora do efeito das proteases; bloqueia a fibrinólise, bloqueando os centros ativos das enzimas) e VEFG (fator de crescimento dos vasos). 
NOTA – Este processo deve ser realizado rapidamente visto que se se demorar muito começa a haver crosslinking, formando-se um gel que torna difícil o processo de transferência. 
AULA 5 – F-action/DNA fluorescence staining (2D samples and 3D samples)
Introdução Teórica
As falotoxinas são isoladas do cogumelo Amanita phalloides. As falotoxinas fluorescentes coram a F-actina em concentrações nanomolares e são extremamente solúveis em água, fornecendo sondas ideais para a marcação, identificação e quantificação da F-actina em secções de tecido, culturas de células ou mesmo no caso de não haver células. 
As falotoxinas marcadas têm uma afinidade semelhante para filamentos grandes e pequenos, ligando-se numa relação estequiométrica de cerca de uma molécula de falotoxinapor subunidade de actina em células musculares e não musculares de muitas espécies diferentes de plantas e animais. Ao contrário dos anticorpos, a afinidade de ligação não muda sensivelmente com a actina de diferentes espécies ou fontes. 
A coloração não específica é insignificante e o contraste entre áreas coradas e não coradas é extremamente grande. Foi descoberto que as falotoxinas são incapazes de se ligar à G-actina monomérica.
Reagentes
Paraformaldeído
De modo a este ser usado para fixação necessita de ser despolimerizado para formaldeído em solução. Em cultura celular, um típico procedimento de fixação de formaldeído iria envolver 4% de formaldeído em solução tamponada com fosfato (PBS) em gelo durante 10 minutos. O paraformaldeído provoca a formação de ligações cruzadas covalentes entre as moléculas, colando-as de maneira eficaz numa rede insolúvel.
Fixações à base de álcool desidratam as células/tecidos, causando desnaturação e precipitação das proteínas in situ. As células devem ser fixadas antes da imunomarcação, porque é necessário permeabilizar as células para permitir que os anticorpos tenham acesso às estruturas intracelulares. Sem fixação, as estruturas das células iriam ser destruídas antes de se realizar os passos de incubação e lavagem. 
DAPI 
É um corante azul utilizado em fluorescência que intercala a dupla camada de DNA. Liga-se aos pares AT da camada de DNA com uma molécula corante para cada 3 pares de bases. A ligação do DAPI ao DNA provoca um aumento de fluorescência de aproximadamente 20 vezes. A fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de DNA presente, tendo emissão máxima a aproximadamente 460 nm. A fluorescência de cor azul pode ser realizada de forma eficaz com uma lâmpada de xenônio ou de mercúrio, ou com um laser UV. Também pode ser detetado utilizando um filtro DAPI comum. 
ALEXA FLUOR 449 PHALLOIDIN
É uma sonda de actina filamentosa de elevada afinidade (F-actina) (faloidina) conjugada com um corante Alexa Fluor Plus 750 brilhante, fotoestável e próximo da gama IV. Vai corar a F-actina de cor verde. 
Alexa Fluor 488 maximum excitation: 495 nm.
Alexa Fluor 488 maximum emission: 519 nm
Fluoromont aqueos mounting medium
Meio de montagem à base de água para cobertura de tecidos corados com vários corantes fluorescentes.
Protocolo
Remover o prato da incubadora e transferir para o LFH.
Aspirar o meio de cultura dos poços e lavar a camada de células com PBS à temperatura da sala.
Fixar a solução de paraformaldeído.
Lavar com PBS três vezes. 
Permeabilizar as células com a Triton X-100 em PBS durante 10 minutos.
Aspirar a solução de Triton e lavar 3 vezes com PBS.
Incubar as amostras com solução de BSA em PBS durante 30 minutos.
Incubar as células com Alexa Fluor 488 phalloidin diluída (1:100) na solução de BSA/PBS, durante 20 minutos. A concentração final de DAPI é 0.1 ug/mL. 
Lavar 3 vezes com PBS.
Incubar as amostras com DAPI (para colorir os núcleos). 
Lavar 3 vezes com PBS.
Adicionar 2 gotas de Fluoromount.
O citoplasma será corado de verde, pelo que se utiliza faloidina, que tem acoplado um fluorocromo (alexa fluor 488). Esta faloidina tem alta afinidade com os filamentos de actina e, como a zona de emissão de fluorescência é o verde, faz-se incidir um laser de 488 nm. Os núcleos vão ser intercalados com DAPI, que tem a característica de se intercalar na dupla cadeia de DAPI. Partes azuis visíveis no microscópio trata-se de núcleos. 
qUANTIFICAÇÃO da proteína total
Este método não é específico para ALP.
1 – Constrói-se uma curva de calibração com valores de absorvância obtidos através de um ensaio de BSA.
2 – Obter vários valores de absorvância para os dias 1, 7 e 14 dos diferentes materiais (zircónia, hidroxiapatite, TCPS)
3 – Fazer a média das absorvâncias para cada um 
4 – Subtrair o branco à média 
5 – Utilizar a reta obtida através da reta de calibração para determinar o x para uma dada absorvância
6 – Multiplica-se o resultado obtido por 5 visto que só se utilizou 20 uL dos 100 uL existentes
7 – Constrói-se um gráfico de barras para se observar a distribuição dos materiais nos diversos dias
Conclusões
O TCPS no dia 14 apresenta células menos ativas da produção de proteína
A zircónia e a hidroxiapatite são muito semelhantes – a sua presença não é o suficiente para estimular a diferenciação 
AULA 6 – Visita ao i3s (microscopia confocal)
A CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) combina imagem ótica de alta resolução com seletividade espacial, o que permite fazer seccionamento ótico, isto é, divisão em vários planos de profundidade. Um raio laser é passado por um pinhole, que ilumina a amostra ponto a ponto, visto que é focado por uma lente objetiva numa pequena área na superfície da amostra. A imagem é construída pixel a pixel, sendo que os fotões emitidos dos fluoróforos na amostra são captados. 
Fluorescência 
Recolhe-se a fluorescência de determinados compostos. Quando são excitadas, as moléculas sobem a um nível energético superior, onde permanecem por nanossegundos, e vibram. Quando descem de nível energético, emitem um comprimento de onda de energia em excesso. Num estado muito energético, há perda de energia, pelo que a energia emitida é menor. 
Deslocamento de Stokes 
O espetro de emissão está sempre à direita do espetro de excitação (E=h*f). Assim, a um comprimento de onda maior corresponde uma energia menor. Consegue-se ver diferentes aspetos numa célula quando se utilizam comprimentos de onda diferentes. 
Na microscopia confocal, a fonte de excitação não é uma lâmpada de halogéneo, mas sim um ou vários lasers, em que cada laser excita num comprimento de onda específico. Tem-se uma câmara de fotomultiplicadores que transforma fotões em eletrões, o que permite a deteção e amplificação de qualquer sinal de luz emergente do sistema ótico do microscópio. 
Pinhole 
Corresponde a um diafragma que pode abrir ou fechar para controlar a secção ótica. A um pequeno pinhole correspondem resoluções do eixo z maiores, um sinal de baixa intensidade e uma secção ótica pequena. Pode-se ver objetos que estão afastados como estando juntos, se a resolução for insuficiente. 
A capacidade de captação de luz por parte da lente, medida pela abertura numérica, é um determinante da resolução e da espessura da secção ótica. Quanto maior a abertura numérica da objetiva for, mais pequena a secção ótica é. 
em que é uma medida da objetiva. 
A NA é uma medida do ângulo da lente que capta luz. Numa objetiva com maior abertura numérica, entra mais luz. 
Ganho 
Amplifica o sinal por multiplicação. O brilho glocal da imagem é aumentado. Pretende-se adquirir a imagem com menor potência possível para não danificar a amostra. Se o ganho for muito alto, pode-se ter saturação, o que pode culminar em danos na amostra. 
Offset 
Através do fotomultiplicador consegue-se ajustar o offset. Pretende-se obter o menor ruído de fundo possível (fundo preto). Tendo muito background, diminui-se o offset. 
A imagem é a preto e branco e a cor é dada pelo utilizador. O preto corresponde ao verde e o branco corresponde ao azul. Quer-se usar um grande range (escala completa) para não faltar nenhuma informação. 
A microscopia confocal permite reduzir a informação fora de foco, isto é, escolher os planos que contribuem para o sinal. Há também um aumento da resolução (tira-se informação fora de foco) e um aumento do rácio sinal/ruído. Pode-se fazer imagens na escala temporal, no eixo dos zz ou ainda aquisições espetrais. 
O microscópio de fluorescência usa todos os planos, enquanto que no confocal é possível escolher os planos, o que se torna vantajoso em alguns casos. 
Na experiência realizada em laboratório, o quitosano é autofluorescente, pelo que se tem um sinal com muito background. Utilizou-se um cell tracker para distinguir osteoblastos de células endoteliais (Texas Red – excitado nos 561 nm, verde, e emiteno vermelho). Para corar o núcleo usou-se DAPI e, para marcar o citoesqueleto, foi usado Alexa Fluor 688, excitado a 488 nm. 
Para observação a microscópio faz-se o processo da esquerda para a direta (DAPI, Alexa e Texas). Se se tentar adquirir tudo em simultâneo, a imagem não é tão boa porque há sobreposição de espetros.