citometro de fluxo

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Isabela da S. V. Rodrigues
Imunologia Clínica
GIVALDIR ANTÔNIO
MAYCON CORTÊS
NALDSON LIMA
ROSIMARIO BATISTA
VANNUCI SANTOS
CITOMETRIA DE FLUXO
 
Aracaju – SE
2020
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GIVALDIR ANTÔNIO
MAYCON CORTÊS
NALDSON LIMA
ROSIMARIO BATISTA
VANNUCI SANTOS
CITOMETRIA DE FLUXO
Resumo sobre citometria de fluxo, equivalente a 1ª avaliação do semestre, com orientação da Professora Isabela da S. V. Rodrigues, na disciplina de Imunologia Clínica, no curso de Farmácia 7º período. 
Aracaju – SE
2020
Introdução
A citometria de fluxo é uma metodologia utilizada para o estudo morfológico, capaz de analisar e caracterizar múltiplos aspectos físicos, químicos e biológicos de diferentes elementos, também fenotípico e funcional de células suspensas em um fluido liquido. Devido à sua capacidade ímpar de analisar vários parâmetros simultaneamente numa única célula, a Citometria de Fluxo se tornou a técnica de escolha para análises multiparamétricas em células, sendo utilizada principalmente na imunologia, imunogenética, biologia celular, microbiologia, biologia marinha, fentipagem celular, estudos de avaliação funcional e diferenciação de populações celulares, conteúdo de DNA e RNA, atividades enzimáticas, apoptose, produção de íons, citotoxicidade, expressão e modulação de receptores, distribuição populacional, produção de citocinas, entre outros.
Os citômetros de fluxo são resultado do desenvolvimento de uma variedade de ferramentas e da aplicação de técnicas desenvolvidas na área da computação; da biotecnologia (produção de anticorpos monoclonais e de fluorocromos); da tecnologia da radiação LASER; e da eletrônica, possibilitando a avaliação de características físicas, químicas e biológicas de vários tipos celulares (humano, modelos experimentais, protozoários, fungos, bactérias). Além da definição de características físico-quimicas das células, outra importante aplicação da citometria de fluxo é a separação ou purificação de uma determinada população celular, a partir de uma suspensão heterogênea de células – processo denominado de cell sorting. Assim, dois tipos de citômetros de fluxo são produzidos comercialmente – citômetros de fluxo analisadores (bench-top analyzers) e citômetros de fluxo separadores/purificadores de células (Cell Sorters).
Técnica 
A citometria de fluxo (FC) é uma técnica baseada no emprego de laser óptico amplamente utilizado para triagem, contagem individual de células e detecção de biomarcadores em proteínas. A técnica por meio de um feixe de laser incidente faz a medição da dispersão e da fluorescência do feixe de laser refletido, a partir da amostra celular. 
Empregada em estudos de células em fluxo e por possuir amplas aplicações é denominada como citometria de fluxo multiparamétrica (FCM). A FCM realiza a rápida identificação de células no instante que estas passam através de um aparelho de detecção eletrônica em uma corrente líquida. Após a separação individual celular é feita a análise, contagem, e qualificação das micropartículas suspensas em fluxo, em meio líquido. Desse modo, realiza com rapidez a identificação de inúmeras características biológicas contidas nas células como: os ácidos nucleicos, receptores de superfície, epítopos de proteínas, a síntese de proteínas, de citocinas, e concentração de íons, ao mesmo tempo dentro de uma célula única. 
A realização da FC pelo aperfeiçoado modelo FACS (Separador de Célula Ativado por Fluorescência) tem sido usado por muitos pesquisadores o instrumento de automação mais utilizado para a investigação celular e seleção das amostras celulares previamente coradas com anticorpos fluorescentes.
O princípio de funcionamento do FACS utiliza feixe de laser e um identificador de luz para a contagem individual das células íntegras que se encontram em suspensão. As prováveis medições das propriedades físicas e/ou químicas da célula ocorrem por captação que emprega um sistema ótico-eletrônico que aponta o modo como a célula ou partícula faz a dispersão da luz do laser refletido, irradiando a fluorescência. Assim, as propriedades celulares mais analisadas dentro do sistema de FACS compreendem o complexo mecanismo interno das micropartículas, o tamanho, granulosidade e a intensidade da fluorescência.
Aplicações da citometria de fluxo
Algumas aplicações da citometria de fluxo são atualmente utilizadas para descobrir algumas anormalidades hematológicas, estas aplicações são importantes para comparar as células boas (sadias), das ruins (doentes), com isso evidencia o crescimento da natureza patológica da célula. 
A detecção da célula patológica é uma das aplicações mais avançadas, para perceber algum tipo de conteúdo anormal ou até mesmo célula tumoral. 	Na imunidade a detecção e identificação de células assim como seu avanço patológico. 
A citometria oferece uma aplicação bem mais rápida e simples quando colocada em obra para analisar o ciclo celular. Ela permite acompanhar a distribuição das células nas diferentes fases de crescimento, com isso reagindo as diferentes fases e estímulos e adição de algumas drogas. 
Se trata de um exame rápido, possibilitando melhor visualização e maiores detalhes. Tem sido um dos exames mais requisitados na observação das pesquisas sobre a cura do câncer. 
Nenhum outro exame é capaz de detalhar com total precisão a morfologia de qualquer outro tipo de célula. 
A análise é uma das mais complexas para examinar a agressividade de células tumorais, pois possui um dos melhores métodos com a maior sensibilidade e precisão sobre a taxa de proliferação de células e assim fornecer a histologia tradicional. 
Essa tecnologia permite fornecer a quantificação em tamanhos físicos e químicos. O cultivo celular são poderosos para auxiliar o pesquisador a controlar e identificar o fenômeno observado em condições distintas. 
Interpretação dos Resultados
Dados detectados pelo citômetro serão aferidos pelo sistema informatizado segundo os parâmetros FSC, SSC, FLUORESCENCIA. A análise é feita pela detecção óptico-eletrônica, na qual as partículas suspensas atravessam individualmente por um fluxo fuido de solução salina tamponada na qual serão interceptadas por um conjunto de lasers. Através deste contato é produzido um índice de refração, passível de ser interpretado de 3 formas: a refração frontal(forward scatter ou FSC),que avalia o tamanho e o volume celular ; a refração lateral (side scatter ou SSC),relacionado á complexidade interna de uma célula, ou seja, o conteúdo interna de uma célula(SHAPIRO,2003;WEISS e WILKERSON,2010);o citômetro pode ainda identificar a emissão de determinado fluorescência,isto é ,as células são marcadas por corantes ou flourocromos ligados a anticorpos especifico e ,quando excitados pelos conjuntos ópticos do aparelho, colaboram com a identificação e caracterização de uma população de interesse(DAVIS et al.2002).
Estes poderão ser analisados através de gráfico de pontos (dot plots) de contorno ou histogramas. Adicionalmente pode ser feito analise tridimensional e com programas que possibilitam a analise de múltiplas populações em um mesmo gráfico (paint –a – gate infinicity, etc), isso será de acordo com a morfologia, ou suspeita clinica de uma população celular especifica poder ser selecionada para analise separadamente, para isso a região a ser estudada é traçada dando origem a o que se chama de ``gate`. Hà diversidade de programas de computação, chamados software, são exclusivos para o armazenamento e análise dos dados obtidos por citometria de fluxo, os quais são apresentados na forma de gráficos mono e bi paramétricos. Deste modo, todo citômetro de fluxo possui determinado software no qual a análise concomitante a aquisição será realizada. Atualmente já existem alguns destes programas que proporcionam que a análise seja realizada offline, isto é, os dados são armazenados em arquivos e analisados após a aquisição.
Conclusão
Em virtude do que foi mencionado a citometria de fluxo é uma importante ferramenta que auxilia a separar de forma individual ascélulas, além de ajudar na detecção de biomarcadores proteicos, permitindo analisar de forma rápida e eficiente a quantidade de células em suspensão.
A sua aplicação clínica ajuda no diagnóstico de leucemias e linfomas, fenotipagem de células tumorais e fenotipagem de leucócitos.
Uma das suas vantagens é distinguir em pouco tempo, uma maior quantidade de células com grande sensibilidade e especificidade, colaborando assim para que os diagnósticos sejam mais precisos sem ter necessidade da realização de outros exames. Esta inovação permite quantificar os parâmetros celulares físicos (granulometria) e químicos (agrupamentos de proteínas expressa), deixando que as células de interesse sejam testadas diante de diversas situações. 
A citometria de fluxo mostra-se como uma metodologia rápida, eficaz e não subjetiva, capaz de realizar análises com altos índices de confiabilidade baseando-se em uma grande quantidade de aquisições celulares, sem invalidar as características individuais (tamanho e complexibilidade). Em contrapartida, o auto custo do equipamento pode ser visto como empecilho.
Bibliografia
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Braga, Karla & Pimenta, Vanessa & Rodrigues, Fernanda & Santos, Thais & Araújo, Eugênio. (2016). CITOMETRIA DE FLUXO: HISTÓRICO, PRINCÍPIOS BÁSICOS E APLICAÇÕES EM PESQUISA. Enciclopédia Biosfera. 13. 304-319. 10.18677/Enciclopedia_Biosfera_2016_027. 
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