06 IA em cadelas pt1

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FISIOPATOLOGIA DA REPRODUÇÃO II
Fisiologia e Inseminação artificial em cadelas
História: Lazaro Spallanzani em 1780 realizou a primeira inseminação em cães. Ele descobriu que o sêmen podia ser resfriado e congelado e depois de aquecido os espermatozoides são reativados. 
Vantagens x desvantagens: diminuição de doenças (como TVT), melhoramento genético, possibilidade de usar sêmen do mundo inteiro. As vantagens e desvantagens de inseminação artificial em cães são bem parecidas com as de outras espécies. A técnica não é tão bem difundida em cães como é em bovinos, pois não é um animal de produção. 
CADELAS: 
 Anatomia é parecida com a de outras fêmeas. Possui 1 útero do tipo bicornual, 2 ovários, 2 tubas uterinas, vagina, vulva, clitoris e cérvix. 
No entanto, nos ovários existe a Bursa do ovário. Pode acumular gordura na Bursa e dificultar a visualização dos ovários no ultrassom. 
A cadela, após o cruzamento, fica agarrada no macho devido ao edema no bulbo do pênis do macho e as contrações do trato reprodutivo feminino que não permitem a soltura, e com isso o macho continua ejaculando. Quando a ejaculação acabar, o bulbo vai desinchando permitindo a soltura do macho. Pode demorar até 30 minutos e o macho continua ejaculando por todo este período. Não pode interferir neste processo (tentar separar os dois), pois pode machucar tanto a fêmea quanto o macho, inclusive pode fraturar o osso peniano. 
Na reprodução, é importante considerar a existência do metaestro citológico, pois neste período não pode inseminar. Neste período, após o estro, a cérvix se fecha e a progesterona sobe (diminuindo imunidade, iniciando o diestro – cadela possui fase progesteronica prolongada). Se inseminar neste período, pode entrar contaminação gerando piometra. Portanto, deve-se fazer a citologia vaginal para acompanhar em qual período do ciclo estral a cadela se encontra. No momento em que identificar metaestro na citologia, é o momento para parar de inseminar. 
Ciclo estral: a puberdade começa com 6 a 12 meses, dependendo da cadela. É monoestrica estacional, ou seja, dá cio uma ou duas vezes por ano. E assim como todas as espécies, possuem uma fase folicular (estrogênica. Dura por volta de 3 semanas) e uma fase luteal (progesterônica. Dura de 2 a 3 meses, algumas cadelas podem ter fase luteal com duração de até 4 meses. Se a cadela ficar gestante, a fase luteal será prolongada pelo tempo da gestação, ou seja, em torno de 60 dias. Se não ficar gestante, a duração da fase luteal gira em torno de 100 a 110 dias, ou seja, a cadela terá uma fase progesterônica muito longa e por isso é tão susceptível ao desenvolvimento de piometra). O intervalo entre estros varia, mas pode ser entre 5 a 12 meses. 
O anestro é uma particularidade do ciclo estral. Em cadelas, após terminar o diestro prolongado, entram em anestro e por isso é também considerado como uma fase do ciclo estral, diferentemente das outras espécies. 
No fim do estro, o estrógeno já está muito baixo. O metaestro é considerado como uma fase importante no ciclo estral das cadelas. No proestro ocorre o sangramento e o inicio da produção de progesterona e por isso os autores afirmam que as cadelas não possuem metaestro (nas outras espécies, é caracterizado pela subida da P4, porém nas cadelas, a P4 começa a subir no proestro). Pelo ponto de vista fisiológico, a cadela não possui metaestro (devido a subida da P4 no proestro e não no metaestro), no entanto, pelo ponto de vista citológico/reprodutivo, a cadela possui metaestro (pois, na citologia vaginal ocorre uma mudança enorme nos tipos celulares do estro para metaestro). 
Geralmente o proestro e estro tem duração parecida, entre 9 a 10 dias, no entanto é normal a cadela permanecer nestas duas fases por até 15 dias. O anestro é a fase mais variada, dependendo muito de cadela para cadela. Se a cadela der 2 cios por ano, o anestro será curto. Mas se a cadela der apenas 1 cio por ano, o anestro será longo. 
 As fases de proestro e estro são as fases foliculares. Por conta do E2 alto, a vulva ficará edemaciada, avermelhada e com produção de muco. No proestro ocorre a descarga sanguínea, porém no estro não tem mais, mas algumas cadelas podem ainda apresentar sangramento. 
No inicio do proestro, a cadela está agressiva ao macho. No fim do proestro, a cadela apresenta passividade ao macho (pois, o E2 cai e a P4 sobe. Quem faz a aceitação do macho na cadela é a P4. O E2 atrai machos e libera ferormônios). No estro, a cadela já assume postura de aceitação completa para a copula. No fim do estro, o E2 está quase nos níveis basais, enquanto que a P4 cada vez sobe mais já que a cadela vai ovulando vários folículos (que vão formando vários corpos lúteos que manterão os níveis de P4 altos). 
 
Existem autores que consideram o D0 quando começa o estro, mas existem autores que consideram quando ocorre o pico de LH. Normalmente quando começa o estro, o pico de LH ocorre 48 horas depois. E a cadela vai começar a ovular de 24 a 96h depois do pico de LH. 
No fim do proestro, o E2 começa a cair. Nas outras espécies, o E2 continua alto no proestro e estro. A P4 aumenta no fim do proestro, a partir do momento que o E2 cai. Isso ocorre para que no estro, a P4 esteja em níveis altos o suficiente para fazer com que a cadela aceite o macho. 
Antes do pico de LH, os folículos não ovulam (portanto, ainda não há corpos lúteos formados). Quem aumenta a P4 na ausência de corpo lúteo? O LH é liberado de forma pulsátil e com isso, ocorre uma luteinização das paredes foliculares (dos folículos dominantes) e as células que antes produziam E2, começam a produzir P4. É uma característica somente de cadelas. 
Em cadelas, vários folículos viram dominantes. A quantidade de folículos dominantes depende da cadela (raça, idade, tamanho, genética). 
2 dias depois do começo do estro terá o pico de LH e cerca de 24 a 96h depois ocorrerá as ovulações. Ela vai ovular um de cada vez, alguns serão ovulados 24h depois, outros 36h depois, outros 48h e outros 72h etc. Por isso, a cadela pode ter filhos de pais diferentes. 
Quando ocorre ovulação, o oócito está parado na prófase I da primeira meiose. Quando o folículo sai, o oócito termina a primeira meiose expulsando o primeiro corpúsculo polar e se torna oócito secundário. A cadela precisa ficar um período de 24 a 48h para que termine o processo de maturação (se tornar secundário). Conhecer esta característica da cadela é importante para saber o melhor momento para inseminar. 
Os espermatozoides de cães podem durar de 4 a 6 dias, pensando em monta natural. Em sêmen congelado, a viabilidade é menor, portanto se usar um sêmen congelado e aplicar no dia do pico de LH, vai demorar 2 dias pra ovular e 2 dias pro oócito ficar pronto, logo quando estiver tudo pronto pra fertilizar a cadela, não terá mais espermatozoides viáveis. 
Acompanhamento do ciclo estral: por modificações anatômicas e comportamentais, vaginoscopia, ultrassonografia, dosagem hormonal e citologia vaginal. Cada um encontra aspectos diferentes do período em que a cadela se encontra para definir o melhor momento para inseminar. 
Vaginoscopia: é um método simples e fácil de ser usado. A mucosa vaginal se modifica de acordo com as fases do ciclo estral. No proestro e estro, ocorre um aumento da espessura do epitélio da mucosa vaginal, pois o E2 está alto (é um hormônio mitogênico, ou seja, estimula as células do epitélio vaginal a se multiplicarem). 
É possível observar a mucosa no proestro e estro aumentada de tamanho. No estro, a mucosa fica mais pálida. No diestro, ocorre a queda do E2, e a mucosa não fica pregueada como nas fases anteriores. O momento para inseminar seria quando observa a parede vaginal branca e com pregas, característico de estro. O momento em que não deve inseminar seria quando a parede não está pregueada, característico de diestro. 
A maioria dos lugares usam mais citologia vaginal, então nem todos usam vaginoscopia. 
Ultrassonografia: por conta da deposição de gordura na Bursa ovárica, o médico veterinário precisa ter experienciaao tentar visualizar os ovários. 
 Se o animal começa a ovular de 24 a 48h depois, insemina em 48h (deve levar em consideração a maturação do oócito que pode demorar até 2 dias), pois o sêmen dura muito tempo (4 a 6 dias). Portanto, se fizer o ultrassom hoje e observar folículos luteinizados, fará a inseminação de 24 a 48h após o ultrassom. Por mais que tenha cerca de 2 dias de maturação oocitária, o sêmen terá viabilidade até lá. 
Com os níveis basais de P4, os folículos estão com parede normal. Com a luteinização feita pelo LH, as paredes foliculares ficam maiores e produzindo P4. 
Ao observar folículos luteinizados, a ovulação será de 24 a 48h depois. 
 
Basicamente, o ultrassom serve para descobrir quando está próximo do pico de LH. 
Dosagem hormonal: pode fazer pra definir o melhor momento para inseminar. Sendo que o melhor momento para inseminar com sêmen congelado seria 2 dias depois de quando o E2 e P4 estiverem na mesma concentração, pois já ovulou e esperou a maturação oocitária. A dosagem de P4 sobe e quando chega até 2ng significa que terá pico de LH, e depois continua subindo. De 4 a 8ng, até mesmo 10ng, já está ovulando (melhor momento pra inseminar, principalmente com sêmen congelado, que tem uma viabilidade um pouco pior). 
Quando a concentração de P4 estiver entre 1,0 a 1,9ng/mL, o dia estimado para ovulação seria em 3 dias, enquanto que o melhor dia para o acasalamento (ou inseminação) seria 5 dias depois (cerca de 2 dias depois da ovulação, para dar tempo de ter a maturação oocitária, ou seja, em 3 dias vai ovular + 2 dias de maturação oocitária = em 5 dias faz a inseminação). 
Quando a concentração de P4 estiver entre 2,0 a 2,9ng/mL, o dia estimado para ovulação seria em 2 dias e o melhor dia para a inseminação seria 4 dias depois. Com 2,0ng terá o pico de LH, ocorrerá a ovulação de 24 a 28h após, e além disso deve-se esperar os 2 dias de maturação oocitária. 
Quando a concentração de P4 estiver entre 3,0 a 3,9ng/mL, o pico de LH já passou, portanto, o dia estimado para ovulação seria em 1 dia e o melhor dia para acasalamento ou inseminação seria em 3 dias, sempre respeitando os 2 dias de maturação oocitária. 
Quando a concentração de P4 estiver entre 4,0 a 8,0ng/mL (até 10,0ng/mL), seria quando E2 e P4 se igualam, ou seja, está ovulando e deve ser inseminada 2 dias depois. 
Quando estiver com a concentração acima de 10,0ng/mL, já ovulou e deve ser inseminada imediatamente. Provavelmente alguns oocitos já foram perdidos. 
Geralmente quando usa sêmen congelado realiza-se dosagem hormonal para definir o melhor momento para inseminação, já que o sêmen perde muita viabilidade. A técnica normal de inseminação em cadelas é a colocação de sêmen intravaginal, no entanto quando utiliza-se sêmen congelado, deve-se colocar intrauterino. 
Citologia vaginal: é rotina de clínica veterinária de cães e gatos. É feita quando a cadela demonstra sangramento vaginal, seja por cio, vaginite etc. 
 
É feita com swab na parede superior da vagina. Depois rola o swab na lâmina, cora com HE ou panótico simples e observa no microscópio. 
No inicio da mucosa vaginal, tem muitas células basais e parabasais. São as células basais que darão origem a todos os outros tipos celulares. O animal em anestro terá células parabasais e intermediarias pequenas. A medida que o E2 for subindo, a camada maior vai sendo formada e o tipo celular vai mudando. As células intermediarias podem ser detalhadas em pequenas, medias e grandes. As células superficiais possuem núcleo picnotico e com maior citoplasma, sendo maiores. 
Também existe a presença de bactérias e neutrófilos. Quase em todas as fases do ciclo estral, os neutrófilos estão presentes. Em algumas fases existem hemácias. 
Anestro = células parabasais e intermediarias pequenas. Ausência de hemácias. Nesta fase terá poucas células, pois a parede está fina. Terá neutrófilos e bactérias. 
Células vermelhas em vermelho e neutrófilos em azul. 
Estro = ausência de neutrófilos (atravessam por diapedese, mas a camada celular é muito espessa e queratinizada que não permite a travessia de neutrófilos). E mais de 70% de células superficiais (anucleadas cornificadas – escamas ou escamosas – ou células grandes com núcleos picnoticos). Pode não chegar a 70% de células superficiais, mas ainda assim será estro.
 Proestro = células parabasais (em menor número), intermediarias (de todos os tipos), superficiais (muitas no fim do proestro), muitas hemácias e neutrófilos. 
 
Com células parabasais e intermediarias pequenas. Com hemácias, neutrófilos e bactérias. 
 Com células superficiais anucleadas. Ausência de neutrófilos. A maioria das células são escamosas, queratinizadas. 
A cadela pode passar do estro para o metaestro de um dia pro outro. 
Ocorre o rush de neutrófilos, pois a camada celular diminui e os neutrófilos conseguem passar. 
Foam cells: são células com vacúolos em seu citoplasma. É um tipo celular característico do metaestro, sendo extremamente indicativo de que a fêmea saiu do cio. 
 
Pode encontrar todos os tipos celulares. 
CÃES: o macho também é parte importante do processo. A anatomia do cão inclui escroto, 2 testículos, 2 epidídimos, 2 cordões espermáticos, 2 ductos deferentes, próstata, uretra, pênis e prepúcio. A próstata é a única glândula anexa que o cão possui. 
 
Cães mais velhos que não foram castrados podem desenvolver hiperplasia prostática benigna. A castração é o tratamento se o animal apresentar condição clínica para a cirurgia, mas caso isso não seja possível, deve ser administrado finasterida (bloqueador de testosterona) para o resto da vida. 
O bulbo do pênis do cão é onde a musculatura feminina pressiona no momento da cópula. A pressão atrás do bulbo predispõe à ejaculação em jatos. Na técnica de inseminação artificial, onde faz o estimulo digital no macho, o ideal é que pressione atrás do bulbo do pênis para que estimule a ejacular. Os cães que passam pela coleta de sêmen frequentemente já são condicionados e já ejaculam sem estimulo digital. 
Espermatogênese: é o processo de produção de gametas masculinos – espermatozoides. Se inicia no cão com 4 meses. E os espermatozoides já estão presentes no ejaculado do cão de 10 a 12 meses. O ciclo espermático possui 54 dias. 
Coleta de sêmen: pode coletar 1 a 2 vezes semanalmente, mas o ideal é que tenha um intervalo entre coleta de 3 dias. Um trabalho demonstrou que as coletas feitas de 24h em 24h, na 3ª coleta a qualidade do sêmen cai. Mas as coletas feitas de 48h em 48h, a qualidade do sêmen cai a partir da 4ª coleta. Com 72h, a qualidade do sêmen não diminuiu. Uma dose de sêmen pode ser dividida entre 2 ou até 3 fêmeas, pois a quantidade coletada é muito grande. 
O local da coleta deve ser em piso seguro e lugar tranquilo. Pisos escorregadios não são bons, pois os animais ficam muito agitados. O ideal é piso de borracha.
O método de coleta é massagem digital, vagina artificial e eletroejaculador (por estimulo elétrico estimula a próstata a ejacular. É muito usado em bovinos. Nunca deve ser usado em equinos, pois são muito sensíveis. É usado em gatos).
 Material de coleta: placa aquecedora para avaliar o sêmen (se colocar os espermatozoides na lâmina fria, pode matar alguns), pipeta, funil com tubo falcon etc. 
Se tiver cadela no cio, estimula o macho a ejacular. Cães que não são acostumados podem ter dificuldade, mas se tiver alguma cadela no cio por perto ajuda bastante. Cães acostumados que já trabalham na reprodução, só do coletador se aproximar já começam a ejacular. 
Quando tiver cadela no cio faz swab vaginal. Pode passar o swab, colocar em uma sacola e congelar. Quando não tiver cadela no cio, pode usar o swab que preservará o cheiro da cadela e será suficiente para estimular o macho na coleta de sêmen. 
 Cão cheirando um swab vaginal de cadela no cio. Serve para estimular a ejaculação para a coleta do sêmen. 
Ex: sêmen da Alemanha com 2 doses. Não pode perder nenhuma dose, então tem que fazer acompanhamento melhor da fêmea. 
Ex: proprietário com macho efêmea. Faz a lâmina citológica, se estiver no cio, insemina a fêmea. Pede pra voltar 2 dias depois, faz uma nova lâmina citológica, se continuar no cio, insemina de novo. Depois de 2 dias, faz uma nova lâmina, se continuar no cio, insemina de novo. Volta 2 dias depois, faz uma nova lâmina, se não estiver mais no cio, para de inseminar. 
 Injeta soro fisiológico no prepúcio para lavar a região e retirar o esmegma, pois influencia demais na qualidade do sêmen. 
Expõe o prepúcio e pênis. Faz o movimento da manipulação digital, o bulbo começa a inchar e deve-se pressionar atrás do bulbo para estimular a ejaculação. Naturalmente, o cão gira e fica agarrado de costas pra fêmea, e durante a técnica ele tentará fazer a mesma coisa, então deve girar a mão. 
O bulbo aumenta muito de tamanho e por isso fica preso na fêmea. 
Características seminais: os fatores que afetam as características seminais são tamanhos de testículos, estresse do animal e método de coleta. A temperatura do animal afeta muito a qualidade do sêmen. 
O ejaculado é dividido em 3 frações com volumes diferentes. A primeira fração possui 0,5mL, a segunda fração terá de 0,5 a 1mL (pode até 3mL, dependendo do tamanho do cão) e a terceira fração terá 3 a 30mL (média de 8 a 10mL).
A primeira fração (pré-espermática) e a terceira fração (pós-espermática) são de origem prostática e possuem características aquosa. A segunda fração (espermática) tem aspecto turvo e leitoso e é que a realmente possui espermatozoides. A pós-espermatica não tem espermatozoides. A pré-espermatica pode ter espermatozoides. 
A maior concentração é na segunda fração. A quantidade e tempo variam muito. No momento da coleta observa-se que o primeiro liquido é mais aquoso e claro, depois deve-se trocar o tubo falcon, pois começará a fração espermática que será leitosa e turva. O ideal é que colete pelo menos 6 a 8mL, pode deixar que fique no tubo um pouco da fração pós-espermática para dar volume. 
 Imagem que demonstra as 3 frações do sêmen canino. A primeira é a fração pré-espermática, a segunda é a fração espermatica e a terceira é a pós-espermatica.