atv antibactericida do alecrim

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Atividade antibacteriana do alecrim
(Rosmarinus officinalis L.)
Talita Mara Paulino de Sousa
Graduanda em Medicina Veterinária do
Centro Universitário Anhanguera - Unidade Leme
e-mail: talitamara2003@yahoo.com.br
Douglas Monte Conceição
Mestre em Microbiologia Aplicada pela Universidade Estadual Paulista - UNESP
Professor do Centro Universitário Anhanguera - Unidade Leme
e-mail: douglasmonte@yahoo.com.br
Resumo
Muitos profissionais utilizam plantas com propriedades
medicinais como alternativa no tratamento, cura e prevenção
de importantes enfermidades. Considerando que a atenção
primária em saúde animal pode ser definida pelo uso de
tecnologias práticas, cientificamente seguras, socialmente
aceitáveis e economicamente viáveis ao alcance de toda
comunidade, e a importância farmacológica e agrícola do uso
de plantas na composição de antimicrobianos, esta pesquisa
analisou a atividade antimicrobiana de soluções aquosas e
etanólicas obtidos de folhas do alecrim (Rosmarinus officinalis
L.), em diferentes concentrações. As soluções foram testadas
com Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus
ATCC 6538. Os testes mostraram que as soluções alcoólicas e
aquosas apresentaram um efeito inibitório ao crescimento S.
aureus.
Palavras-chave: Farmacognosia; Plantas Medicinais;
Rosmarinus officinalis; Alecrim.; Atividade antimicrobiana.
Abstract
Many professionals use plants with medicinal properties
as alternative in the treatment, cure and prevention of important
diseases. Considering that the primary attention in animal health
can be defined by the use of practical technologies, scientifically
safe, socially acceptable and economically viable to the reach
of every community, and the pharmacological and agricultural
importance of use of plants to compose antimicrobial agents,
this research analyzed the antimicrobial activity of aqueous
and ethanolic solutions obtained from rosemary (Rosmarinus
officinalis L.) leaves, in different concentrations. The solutions
were tested with Escherichia coli ATCC 25922 and
Staphylococcus aureus ATCC 6538. The tests showed that the
alcoholic and aqueous solutions presented an inhibitory effect
to the growth of S. aureus.
Key-words: Pharmacognosy; Medicinal Plants;
Rosmarinus officinalis; Rosemary.; Antimicrobial Activity.
Introdução
Como alternativa ao tratamento de determinadas
enfermidades muitos recorrem à utilização de plantas com
fins medicinais, esta constitui uma das mais antigas formas
de prática medicinal da humanidade. No início da década
de 90, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou
que 65-80% da população dos países em
desenvolvimento dependiam das plantas medicinais como
única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde
(GARCIA et al., 2005). Entretanto, pesquisas realizadas
para avaliação do uso seguro de plantas medicinais e
fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes, assim como
o controle da comercialização pelos órgãos fiscalizadores
em feiras livres, mercados públicos ou lojas de produtos
naturais (VEIGA et al., 2005).
A seleção etnofarmacológica de plantas para
pesquisa e desenvolvimento, pode ser baseada em
relatos populares, ferramenta valiosa para descoberta
de novos fármacos. Segundo Elisabetsky (2003) a
etnofarmacologia por se basear nos relatos populares
da utilidade terapêutica das espécies é particularmente
útil no reconhecimento de doenças com a patofisiologia
desconhecida. Os relatos dos efeitos e da terapêutica
podem conduzir a identificação de produtos com novos
mecanismos de ação, desta forma, modelos “in vivo”
8
possuem um papel fundamental nos estudos
etnofarmacológicos, destacando-se a busca de
compostos antimicrobianos (ELISABETSKY, 2003;
AVANCINI et al., 2000).
O uso de plantas medicinais ou de substâncias
ativas das plantas na Medicina Veterinária é de grande
importância, principalmente no que diz respeito a
resíduos deixados por medicamentos alopáticos em
produtos de origem animal, fato que tem levado o
mercado a rejeitar tais produtos (BENEZ et al., 2002).
Com a utilização inadequada alguns
antimicrobianos estão perdendo muito rapidamente sua
eficácia, o que torna necessário o desenvolvimento de
novos medicamentos e técnicas eficazes de manejo.
Assim as perspectivas para uso de drogas antimicrobianas
no futuro é incerta. Portanto, devem ser tomadas atitudes
que possam remediar este problema, como o controle
do uso destes compostos potencialmente prejudiciais
(VARGAS et al., 2004).
Os antimicrobianos químicos sintéticos constituem
a principal opção diante dos agentes bacterianos, cita-
se a mastite bovina e a indução de cepas bacterianas,
esta situação tem estimulado a busca por meios
alternativos que reduzam ou eliminem tais problemas
(PINTO et al., 2001; VARGAS et al., 2004). Assim,
recomenda-se encontrar soluções antimicrobianas de
fácil obtenção que favoreçam os produtores rurais e a
medicina veterinária preventiva. Neste sentido, extratos
e óleos essenciais de plantas mostraram-se eficientes no
controle do crescimento de uma ampla variedade de
microrganismos, incluindo fungos filamentosos, leveduras
e bactérias. Utilizações práticas dessas atividades são
sugeridas em humanos e animais (DUARTE, 2006).
O uso de plantas medicinais busca ampliar os
recursos tecnológicos nacionais no setor de desinfetantes
e anti-sépticos biológicos, contornando possíveis efeitos
negativos que algumas substâncias químicas sintéticas
possam ter sobre o usuário, o hospedeiro, o ambiente, a
resistência de agentes causais, além da redução de custos
das práticas de higiene (AVANCINI et al., 2000).
Considerando ainda que o uso indiscriminado e
prolongado de antimicrobianos determina um processo
de seleção de microrganismos patogênicos mutantes que
apresentem resistência as compostos químicos utilizados
comumente, o que torna o uso de antimicrobianos de
origem natural uma alternativa eficaz e econômica
(VARGAS et al., 2004).
Compostos secundários presentes em plantas
medicinais podem desempenhar funções importantes na
interação planta-patógeno, através da ação
antimicrobiana direta ou ativando mecanismos de defesa
de outras plantas que venham a ser tratadas com esses
compostos (BONALDO et al, 2004). Caule, flor, folha,
fruto, raiz e cascas são partes utilizadas que apresentam
propriedades medicinais, e dentre aquelas propriedades
atribuídas pela medicina popular citam-se as
adstringentes, anti-diarréicas, antiinflamatórias,
depurativas, diuréticas, febrífugas e antimicrobianas
(COELHO et al., 2003; DEGÁSPARI et al., 2005).
Na literatura são descritas diversas plantas com
propriedades medicinais como espécimes pertencentes
à família Lamiaceae, composta por aproximadamente
200 gêneros incluindo Melissa officinalis (erva-cidreira),
Ocimum basilicum L. (alfavaca), Rosmarinus
officinalis L. (alecrim) apresentando propriedades
estimulantes, antiespasmódicas, anti-sépticas, antifúngicas
e antibacterianas (JOLY, 1993; PORTE e GODOY,
2001; SARTORATTO et al., 2004; ADIGÜZEL et al.,
2005).
Rosmarinus officinalis apresenta diversos nomes
populares dentre os quais alecrim-de-cheiro, alecrim-
das-hortas, alecrim-da-casa, alecrim-comum, alecrim-
verdadeiro, rosmaninho. Dentre as principais
características cita-se folhas lineares coriáceas, cores
azulado-claras de forma tubular de aroma forte e
agradável, sendo arbusto perene de porte subarbustivo
(1,5 metros). O alecrim é uma planta oriunda da região
mediterrânea da Europa, e seus principais produtores
são a Itália, Iugoslávia, Espanha, Grécia, Turquia, França,
Portugal, Egito e norte da África. Apesar de ser cultivado
em quase todo o território brasileiro e importado como
condimento para o consumo interno poucos estudos têm
sido realizados sobre esta importante planta medicinal
(JOLY, 1993; PORTE e GODOY, 2001; FUNDAÇÃO
ZOOBOTÂNICA DO RIO GRANDE DO SUL,
2005).
As propriedades antioxidantes do alecrim podem
ser atribuídas à presença rosmanol, diterpenos
rosmaridifenol e rosmariquinona, e as propriedades
antimicrobianas parecem estar relacionadas com a
presença de borneol, pinenos,cineol e cânfora (PORTE
e GODOY, 2001).
Nascimento et al. (2000) relataram a ação
antimicrobiana de extratos alecrim frente a bactérias
sensíveis e resistentes a antibióticos sintéticos, verificando
sinergismo entre antibióticos e os extratos usados,
possibilitando que antibióticos ineficazes apresentassem
ação sobre bactérias resistentes. Packer e Luz (2007)
demostraram atividade bacteriostática e fungiostática do
alecrim empregando a técnica do orifício em ágar.
Diferentes plantas medicinais foram estudadas para
aplicação em medicina veterinária, cita-se o trabalho de
9
Souza et al. (2000) com Tagetes minuta L. (Chinchilho)
revelou atividade antimicrobiana com marcada
seletividade sobre as bactérias Gram-positivas como
Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium.
Schmitt et al. (2003) com o intuito de validar o seu uso
no estado de Mato Grosso, avaliaram a atividade
antimicrobiana da planta Bryophyllum pinnatum Kurz.
(“Folha-da-fortuna”) frente a três bactérias isoladas de
cães com lesões de pele e uma de fezes de suínos,
encontrando atividade contra bactérias Gram-positivas.
Loguercio et al. (2005) testando o extrato hidro-
alcoólico a 10% (m/v) de folhas de jambolão (Syzygium
cumini L. Skells) encontraram atividade antibacteriana
frente a 17 isolados bacterianos, Gram positivos e Gram
negativos, de importância patogênica para animais e
humanos.
As substâncias antimicrobianas nas plantas são
detectadas pela observação do crescimento de
microrganismos colocados em contato com tecidos e
ou extratos, e para detectar estas substâncias são
utilizados diversos métodos, diferenciados pela
sensibilidade ou princípios. Os resultados obtidos serão
influenciados pelo método escolhido, assim como pelos
microrganismos usados nos testes. A região ou estrutura
da planta e suas características fisiológicas são
determinantes para a medição da atividade antibiótica,
bem como a forma de uso: suco, óleo essencial e extração
por água ou outros solventes (SOUZA et al., 2000).
Considerando que a atenção primária em saúde
animal é definida pela utilização de tecnologias práticas,
cientificamente seguras, socialmente aceitáveis e
economicamente viáveis ao alcance de toda comunidade,
e a importância farmacológica e agropecuária da
utilização de plantas na composição de antimicrobianos,
o presente trabalho teve o intuito detectar a presença de
atividade antibacteriana no alecrim (Rosmarinus
officinals L.) para contribuir com estudos aplicáveis às
ciências veterinárias e agropecuária familiar.
Material e métodos
As atividades iniciaram-se a partir do plantio das
mudas do alecrim (Rosmarinus officinalis) (FIGURA
1) obtidas em viveiros de mudas da região do município
de Rio Claro - SP. As plantas selecionadas foram
transferidas para vasos de concreto suspensos contendo
terra enriquecida com húmus e adubo vegetal, protegidas
de sol direto e chuva, localizados no herbário da Unidade
Leme do Centro Universitário Anhanguera. As atividades
laboratoriais começaram a partir dos vinte e oito dias
após o acondicionamento das mudas.
No preparo das soluções foram colhidas folhas
da parte superior das plantas no início da tarde, e em
seguida as folhas foram fracionadas utilizando-se uma
tesoura e pesadas em balança. O decocto foi obtido a
partir de uma modificação da técnica referenciada na
Farmacopéia Brasileira, da mistura do material vegetal
grosseiramente picado, em água destilada, levando-os à
cocção pelo período de 15 minutos, com a água em
ebulição, utilizando como recipiente um Erlenmeyer
coberto com placa de Petri (SOUZA et al., 2000),
considerou-se esta solução aquosa 1% (m/v). As
soluções aquosas foram estocadas em frascos de vidro
de B.O.D., sem material vegetal, armazenados em local
seco e sem exposição à luz.
Para o preparo das soluções alcoólicas 1% as
folhas foram fracionadas e pesadas em balança analítica,
em seguida foram misturadas com álcool absoluto
99,3°GL (Santa Cruz®) em frascos de vidro B.O.D,
resultando em uma solução alcoólica de concentração
1%. Estas soluções foram armazenadas em lugar sem
luminosidade, durante um período de cinco dias, os
frascos foram agitados durante um minuto diariamente.
No preparo das soluções alcoólicas 3% as folhas
fracionadas foram acrescidas a uma solução contendo
álcool absoluto 99,3ºGL (Santa Cruz®) e água destilada
a 1:1 (v/v), resultando em 3 gramas de folhas para 100
mL de solução alcoólica. As soluções foram armazenadas
em lugar sem luminosidade, agitadas durante um minuto
diariamente durante um período de cinco dias.
Nas análises foram utilizadas as cepas Escherichia
coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC
6538, sendo que os inóculos foram preparados a partir
do cultivo das cepas selecionadas por 24 horas em meio
BHI a 37ºC, e transferência de colônias com alça de
inoculação até a turvação comparativa a 0,5 da escala
10
nefelométrica de McFarland, técnica adaptada de Bauer
et al. 1966.
Utilizando as soluções aquosas 1% fram realizadas
diluição, sendo 100%, 50%, 25% e 10% a partir da
solução mãe. O mesmo procedimento foi aplicado a
solução alcoólica, excluindo-se a diluição a 10%. Os
inóculos foram semeados na superfície do meio Müller
Hinton (duplicata) com o auxílio de “swab” estéril,
cobrindo a superfície da placa com inóculo, em seguida
foram feitos 4 poços (“hole plate”) em diferentes placas
com o auxílio de uma pipeta Pasteur plástica cortada
(diâmetro de 6 mm). Em cada poço foi adicionado com
uma pipeta automática 20 µL das soluções
(FERNANDES et al, 2005; PACKER e LUZ, 2007)
em diferentes concentrações (100%, 50%, 25% e 10%).
As placas foram incubadas à 37ºC por 24 - 48 horas.
Utilizando as soluções alcoólicas 1% foram
realizadas diluições, sendo 50%, 25% e 10% a partir da
solução mãe. Em seguida foram depositados três discos
estéreis de papel para teste de antibiograma em cada
tubo (100%, 50%, 25% e 10%) para as plantas
selecionadas, onde ficaram imersos por duas horas. Após
o período de imersão estes foram secos em estufa (50ºC)
por 5 minutos. A partir da secagem os discos de papel
impregnados pelas soluções teste foram depositados na
superfície de placas de Petri contendo Agar Müller Hinton
inoculado com Escherichia coli ATCC 25922 e
Staphylococcus aureus ATCC 6538, segundo a técnica
de Bauer et al (1966) para testes de antibiograma. Estas
placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas para
mediação do halo de inibição dos microrganismos.
Realizaram-se testes de contato para bactéria S.
aureus ATCC 6538 com as soluções alcoólicas a 1%,
onde foi realizada diluição em série a partir da solução
alcoólica 1%, sendo 0,1%, 0,01% e 0,001% em tubos
contendo solução salina 0,9%, estes foram inoculado
com 0,1 mL de inóculo S. aureus. Após 15 minutos e
30 minutos de exposição foram transferidos 1 mL para
placas contendo agar para contagem em placas (PCA,
Merck®) pela técnica de “pour plate”. As placas foram
incubadas durante 24-48h a 37º.C para posterior
contagem das unidades formadoras de colônias. No
controle foram utilizados 0,1 mL do inóculo em 10 mL
de solução salina e 1 mL do álcool a 99,3º.GL em 9 mL
de solução salina, acrescido da mesma alíquota de
inóculo S. aureus na escala 0,5 de MacFarland.
Resultados e discussão
Os resultados da formação de halo de inibição
em meio Müller-Hinton para técnica de perfuração do
agar (“hole plate”) para soluções aquosas 1% (solução
mãe) de alecrim durante 24 e 48 horas estão dispostos
na TABELA 1. As soluções testadas não apresentaram
atividade inibitória para bactéria Gram-negativa E. coli.
O alecrim demonstrou atividade inibitória contra
o S. aureus nas concentrações 100%, 50% e 25% a
partir da solução aquosa a 1%, mas não apresentou
atividade na solução de concentração 10%, não houve
variações nos resultados na comparação entre os tempos
24 e 48 horas de incubação. Em relação às diluições da
solução alcoólica 3% somente foi visualizado halo de
inibição na concentração 100% (TABELA 2).
A utilização de discos de antibiograma imersos por
duas horas nas diferentes concentrações da solução
alcoólica1% de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) em
meio Müller-Hinton após as 24 horas, não demonstrou
formação de halo de inibição para bactéria S. aureus e
E. coli. Observou-se formação de inibição irregular e
não mensurável, sendo assim considerou-se a
metodologia não eficaz para comprovação de atividade
antimicrobiana, o que sugere a realização de testes com
maiores concentrações ou maior tempo de exposição
dos discos em relação às soluções teste.
Os resultados obtidos para as soluções aquosas
e alcoólicas do Rosmarinus officinalis concordam com
as citações realizadas por Porte e Godoy (2001) para
óleos essenciais, estas relatam alta sensibilidade de
bactérias Gram positivas aos óleos essenciais de alecrim,
incluindo Sthaphylococcus aureus, Micrococcus sp. e
Sarcina sp., bem como a levedura Saccharomyces
cerevisiae. Entretanto, nenhum ou muito pouco efeito
foi verificado contra as bactérias Gram negativas
Pseudomonas fluorences, Escherichia coli e Serratia
11
marcescens (PORTE e
GODOY, 2001). Este fato
também foi observado nos
experimentos realizados com
soluções aquosas e etanólicas
utilizando técnicas de difusão
em placa E. coli, desta forma
não foram realizados teste de
contato para esta bactéria nas
concentrações propostas.
Na leitura da placas
PCA preparadas a partir da
exposição da bactéria S.
aureus após 15 minutos de
exposição nas soluções com
diferentes concentrações de
alecrim mostraram a formação
9 UFC/ mL (unidades
formadoras de colônias por
mililitro) para solução 0,1 %, 30 UFC/ mL para a solução
0,01 % e 195 UFC/ mL na solução 0,001% e na placa
controle foram acima de 300 UFC/ mL, mostrando que
o aumento de concentração da solução teste, melhorou
a atividade inibitória do alecrim frente à bactéria S.
aureus. A TABELA 3 mostra a contagem das unidades
formadoras de colônias para Staphylococcus aureus
ATCC 6538 submetidas ao contado com diferentes
concentrações de solução alcoólica de alecrim
(Rosmarinus officinalis L.).
As placas preparadas após sessenta minutos de
exposição do S. aureus nas soluções com diferentes
concentrações de alecrim apresentaram ausência de
crescimento para as soluções 0,1% e 0,01%. Na solução
0,001% observou-se 83 UFC / mL demonstrando que
o maior tempo de exposição do S. aureus às soluções
contendo alecrim aumentou a efetividade do tratamento.
Valores acima de 300 UFC /mL foram observados nas
placas controle que continhan somente inócilo, e valores
maiores que 300 UFC / mL para controle contendo
álcool após 30 minutos de exposição.
Os experimentos demonstraram positiva atividade
antibacteriana do alecrim (Rosmarinus officinalis) frente
a S. aureus, pelo fato de terem sido testadas soluções
com baixas concentrações comparadas com as
propostas na literatura para plantas antimicrobianas, como
citado no trabalho realizado por Pereira et al. (2006)
que observam efeito antimicrobiano para alecrim em
concentrações de 1500 mg/ mL, desta forma o aumento
da concentração poderá melhorar os resultados obtidos
inicialmente.
Considerações finais
Os resultados sugerem que o decocto e soluções
aquosas e alcoólicas de Rosmarinus officinales têm
potencial para composição de anti-sépticos ou
desinfetantes frente aos agentes Gram positivos utilizados
neste estudo. Considerando que cepas ATCC são
recomendadas para este tipo de avaliação por
apresentarem estabilidade genética e são recomendadas
para monitorização de diversos parâmetros de qualidade
em microbiologia (SEJAS et al., 2003).
A atividade antibacteriana das soluções testadas
apontam perspectivas, no sentido de desenvolver um
agente antimicrobiano eficaz e de baixo custo, podendo
12
futuramente ser componente de formulações que ajam
no controle de microrganismos presentes no ambiente e
superfícies corpóreas. Outros estudos devem ser
realizados para melhor compreender-se e quantificar a
ação antimicrobiana do alecrim, considerando que não
existe um consenso sobre o nível de inibição aceitável
para produtos naturais quando comparados com
antimicrobianos padrões, alguns autores consideram
somente resultados similares aos de antibióticos e
antimicrobianos padrão, enquanto outros consideram
com bom potencial mesmo aqueles com níveis de
inibições superiores ou ainda que atuem em sinergismo
com outros agentes comuns (ECHEVARRIA, 2002;
DUARTE, 2006).
A metodologia apresentou-se eficaz na detecção
da atividade inibitória do alecrim, e poderá ser aplicada
na triagem de plantas com potencial para compor agentes
antimicrobianos, considerando o efeito observado nas
baixas concentrações propostas.
Nas últimas décadas as mudanças culturais, o
fenômeno de degradação das florestas e extinção das
espécies vegetais tem determinado o desaparecimento
de um considerável número de plantas com propriedades
medicinais, o que torna urgente a intensificação nos
investimentos para o reconhecimento dos diferentes
compostos químicos e suas atividades farmacêuticas, não
somente pela preservação das espécies vegetais, bem
como, o enriquecimento científico aplicado ao bem estar
humano e animal (GARCIA et al, 2005; ELISABETSKY,
2003).
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Recebido em 29 de junho de 2006 e aprovado em
16 de julho de 2007.