RELATORIO_PRATICO_2_MICROBIOLOGIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS E EXATAS 
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL 
 
 
 
JÉSSIKA SILVA 
JOÃO PAULO BORGES RODRIGUES 
JÚLIO GONÇALVES 
PEDRO CARDOZO DE ALMEIDA LARA 
 
 
 
 
TÉCNICA DE POUR PLATE E DE SPREAD PLATE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UBERABA 
2016 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS E EXATAS 
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL 
 
 
 
 
JÉSSIKA SILVA 
JOÃO PAULO BORGES RODRIGUES 
JÚLIO GONÇALVES 
PEDRO CARDOZO DE ALMEIDA LARA 
 
 
 
TÉCNICA DE POUR PLATE E DE SPREAD PLATE 
 
 
 
 
Relatório de experimento prático, elaborado como 
requisito à obtenção de nota parcial da disciplina de 
Microbiologia Básica, sob orientação da Prof.ª Dra. Ana 
Carolina Borella Marfil Anhê. 
 
 
 
 
UBERABA 
2016 
SUMÁRIO 
 
1 RESUMO ........................................................................................................... 3 
2 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 4 
3 OBJETIVO ......................................................................................................... 5 
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 6 
4.1 MATERIAIS .................................................................................................. 6 
4.2 PROCEDIMENTOS........................................................................................ 7 
4.3 TÈCNICA DE POUR PLATE .......................................................................... 7 
4.4 TÉCNICA DE SPREAT PLATE ....................................................................... 8 
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 8 
5.1 POUR PLATE ................................................................................................ 8 
5.2 SPREAT PLATE ............................................................................................. 9 
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 10 
7 BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 11 
 
 
 
3 
 
1 RESUMO 
Os microrganismos estão diretamente relacionados com a fertilidade do solo, eles atuam 
no ciclo do nitrogênio, um dos elementos químicos importantes para o solo, como por exemplo, 
as bactérias fixadoras, convertem substâncias orgânicas em compostos inorgânicos, tornando-
os úteis para os vegetais, e uma forma de quantificar estes microrganismos são através das 
técnicas de Pour Plate e de Spread Plate. Com uma amostra de solo com diluição seriada em 
solução salina fez-se o experimento. 
 
4 
 
2 INTRODUÇÃO 
 
O solo é um recurso natural formado por diversos constituintes, sendo eles uma parte 
sólida constituída por diversos minerais, advindos da decomposição das rochas inicialmente 
formadoras da crosta terrestre, o solo também possui uma fase gasosa e uma fase liquida, 
formando o sistema solo-agua-ar, que é um recurso natural muito importante para a manutenção 
do ecossistema terrestre (PINTO, 2006). 
No solo a atividade microbiana é intensa, estando concentrada na parte superior do solo, 
correspondente as primeiras camadas do solo, ocupando uma parcela de aproximadamente 
0,5% do volume total do solo e representando menos que 10% da matéria orgânica do solo. Os 
microrganismos presentes no solo apresentam funções essenciais para garantir a sua qualidade, 
os microrganismos desempenham diversas funções tais como, decomposição da matéria 
orgânica, liberação de nutrientes em formas disponíveis as plantas e degradação de substancias 
tóxicas, entre outras funções, sendo a sua atividade tão importante a ponto da biomassa 
microbiana ser um indicador de qualidade do solo qualidade do solo (ARAUJO, 2007). 
Para ter uma noção da atividade microbiana de um determinado solo é necessário 
quantificar de alguma maneira a população bacteriana de um solo, esta medida pode ser 
realizada através da contagem do número de células por mililitro ou grama de material, para 
realizar esta medição é necessário coletar amostras menores, devido ao alto número de bactérias 
contidas em uma quantidade relativamente pequena de material (TORTORA, 2010). 
Para tornar mais prático este procedimento, são realizadas diversas diluições e 
realizando essas diluições é possível determinar a quantidade de bactéria presentes nesta 
pequena quantidade de material, e como esta quantidade é proporcional a quantidade presente 
em uma grande amostra, é possível determinar a quantidade de células presentes na quantidade 
de material desejado (TORTORA, 2010). 
O método em que são realizadas estas diluições é chamado de método das diluições 
seriadas, e depois desse método ser realizado, é realizado o procedimento de incorporação em 
placas a espalhamento em placas, neste método, 1 mililitro das diluições da suspensão 
bacteriana é introduzido em uma placa de Petri, e posteriormente o meio nutritivo é despejado 
5 
 
sobre a diluição, sendo esta solução posteriormente misturada por meio de agitação lenta da 
placa, quando a temperatura do meio diminui, a placa pode ser encubada(TORTORA, 2010). 
Após a incubação é possível perceber que as colônias de microrganismos crescem tanto 
dentro do nutriente quanto na superfície da placa de ágar. Apesar desta técnica ser uma técnica 
muito utilizada, ela apresenta algumas desvantagens, como o fato de o meio de cultura estar a 
uma alta temperatura, pode causar alguns danos aos microrganismos mais sensíveis e impedir 
estes de formarem colônias, outro problema é o fato de algumas colônias se formarem no meio 
do Agar, o que não é desejável para alguns testes (TORTORA, 2010). 
Para fazer uma aferição da quantidade de microrganismos em uma determinada amostra 
de solo, é feita a contagem do número de viáveis, fazendo a contagem em placas do número de 
colônias, pressupondo que cada viável seja capaz de formar uma colônia. Embora este método 
seja um método bastante utilizado, podem haver alguns erros relacionados principalmente ao 
tempo de incubação, ao tamanho das colônias, sendo que os erros relacionados a estes fatores 
podem levar a uma omissão de algumas colônias e uma contagem incorreta das mesmas 
(MADIGAN, 2004). 
Com a técnica citada anteriormente é possível obter uma estimativa da atividade 
microbiana de um solo, apesar da possibilidade de erros este é um método simples, que pode 
ser utilizado para estimar este indicador de qualidade do solo, sendo ele muito importante para 
as atividades humanas utilizadoras do solo de alguma forma, tais como a agricultura, a pecuária, 
a geotécnica entre outras atividades humanas realizadas através do solo. 
 
3 OBJETIVO 
A prática teve como objetivo quantificar o número de microrganismos presentes na 
amostra de solo por meio dos métodos de contagem em placa. 
 
 
6 
 
4 MATERIAIS E MÉTODOS 
4.1 MATERIAIS 
 Balança; 
 Micro-ondas; 
 Erlenmeyer contendo meio de cultura PCA; 
 Micropipeta; 
 10 placas de Petri; 
 Alça de Drigalsky; 
 Luvas de couro; 
 Bico de Bunsen; 
 Béquer; 
 Colher de aço inox; 
 Estante para tubos de ensaio; 
 3 tubos tipo falcon com 9,9 mL de solução salina; 
 4 tubos tipo falcon com 9 mL de solução salina; 
 Amostra de solo; 
 EPIs; 
 BOD. 
7 
 
4.2 PROCEDIMENTOS 
Foi coletada uma amostra de solo próximo às mudas de árvores plantadas no campus 
Univerdecidade – ICTE II, alguns dias antes da realização do experimento. A amostra foi 
conservada em um recipiente onde havia ventilação para acabar com qualquer umidade 
presente. Para a realização do experimento, foi pesado 0,1 grama da amostra de solo que, 
posteriormente, foi diluida em 9,9 mL de solução salina, tendo como resultado a diluiçãode 
ordem 10-2. Depois, utilizando a micropipeta, foi coletado 0,1 mL da diluição 10-2, para realizar 
uma diluição seriada em outro tubo de ensaio contendo 9,9 mL de solução salina, obtendo uma 
nova diluição de ordem 10-4. Logo após, foi coletado 0,1 mL da diluição 10-4, sendo esta amostra 
colocada em outro tubo de ensaio contendo 9,9 mL de solução salina, originando a diluição de 
ordem 10-6. A partir da solução 10-6, a amostra coletada foi de 1 mL, sendo diluída em 9 mL de 
solução salina, obtendo-se a solução de ordem 10-7. Para as seguintes amostras, foi coletado 1 
mL da amostra diluída de ordem inferior para ser dissolvida em 9 mL de solução salina, 
originando uma solução de ordem superior, como demonstrado na tabela abaixo: 
Ordem da diluição Diluição 
10-2 0,1 g de solo / 9,9 mL solução salina 
10-4 0,1 mL 10-2 / 9,9 mL solução salina 
10-6 0,1 mL 10-4 / 9,9 mL solução salina 
10-7 1 mL 10-6 / 9 mL solução salina 
10-8 1 mL 10-7 / 9 mL solução salina 
10-9 1 mL 10-8 / 9 mL solução salina 
10-10 1 mL 10-9 / 9 mL solução salina 
Tabela 1 Diluição Seriada 
 
4.3 TÈCNICA DE POUR PLATE 
Para a realização da técnica de Pour Plate, foram utilizadas cinco placas de Petri. Em 
cada placa, previamente marcada, foi adicionado 1 mL das diluições 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 e 10-
10. O meio de cultura foi levado ao micro-ondas em intervalos de 30 segundos até que estivesse 
em estado líquido. Após o meio de cultura atingir a temperatura ideal, foi adicionado nas placas 
de Petri já contendo as amostras, uma a uma, onde foi realizado o movimento em “8”, 
8 
 
totalizando 20 repetições do movimento em cada placa. Após ficar em repouso até que o meio 
se solidificasse, as placas foram incubadas na BOD por 48 horas, à 28° C. 
 
4.4 TÉCNICA DE SPREAT PLATE 
Na realização da técnica de Spread Plate, foram utilizadas outras cinco placas de Petri 
devidamente identificadas. Primeiramente o meio de cultura foi aquecido em intervalos de 30 
segundos até que estivesse no estado líquido e foi colocado em todas as placas. Após o meio se 
solidificar, foi coletado 0,1 mL das diluições 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 e 10-10 sendo colocadas nas 
placas contendo o meio de cultura, uma amostra em cada placa, sendo posteriormente 
espalhadas com o auxílio da alça de Drigalsky. As placas foram incubadas na BOD por 48 
horas, à 28° C. 
 
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 
5.1 POUR PLATE 
 A Tabela 2, apresentada a seguir, mostra os resultados obtidos quanto ao crescimento de 
UFC’s em placa de petri contendo 1 ml de solução salina com a amostra do solo analisado pelo 
método de Pour Plate para determinação do número de microrganismos. 
Concentração N° de UFC’s na placa UFC por grama de solo 
𝟏𝟎−𝟔 0 - 
𝟏𝟎−𝟕 0 - 
𝟏𝟎−𝟖 0 - 
𝟏𝟎−𝟗 0 - 
𝟏𝟎−𝟏𝟎 0 - 
Tabela 2 – Resultados obtidos pelo método de Pour Plate. 
 
 A partir da técnica de pour plate não foi identificado o crescimento de UFC’s nas 
concentrações de 10−6 a 10−10, o que não quer dizer a ausência de microrganismos no solo e 
sim que ocorreu falhas humanas. Durante o experimento houve dificuldade em utilizar a 
micropipeta, podendo ter sido acrescentado um volume pouco significante da amostra no meio 
9 
 
de cultura. Outra falha humana que pode ter interferido no crescimento de UFC’s foi a 
temperatura do meio, durante o experimento o meio sempre se solidificava antes mesmo de 
assumir temperaturas brandas, sendo utilizado consideravelmente aquecido. 
 Como mostrado pela Tabela 2 não foi possível determinar a quantidade de UFC’s 
presentes em 1 (um) grama da amostra de solo. Porém não se deve considerar que no solo da 
amostra não havia a presença de microrganismos uma vez que “As bactérias, constituem o 
grupo mais numeroso, quiçá o mais importante dentre os componentes microbianos do solo. 
Num solo normal, seu número aproximado, obtido por métodos comuns de análise, podem ser 
avaliados ao redor de vinte milhões de talos bacterianos por grama de solo. Essa quantidade 
corresponde a aproximadamente 0,01% do volume do solo na sua camada superior, ou, ainda, 
a cerca de trezentos quilogramas de talos bacterianos por hectare.” (GALLI, 1964) 
 
5.2 SPREAT PLATE 
 A Tabela 3, apresentada a seguir, mostra os resultados obtidos quanto ao crescimento de 
UFC’s em placa de pétri contendo 0,1 ml de solução salina com a amostra do solo analisado 
pelo método de Spread Plate para determinação do número de microrganismos. 
Concentração N° de UFC’s na placa UFC por grama de solo 
𝟏𝟎−𝟔 INCONTÁVEL - 
𝟏𝟎−𝟕 0 - 
𝟏𝟎−𝟖 0 - 
𝟏𝟎−𝟗 0 - 
𝟏𝟎−𝟏𝟎 2 2x1011 
Tabela 3 – Resultados obtidos pelo método de Pour Plate. 
 A partir da técnica de Spread Plate foi possível identificar crescimento microbiano 
apenas nas placas com diluição de ordem 6 e ordem 10 (10−6 e 10−10, respectivamente), sendo 
que na primeira o número de UFC’s foi indeterminado e na segunda o número obtido foi de 2 
(duas) UFC’s. Na placa de concentração 10−6 houve uma possível contaminação do meio, 
impedindo que fosse estimado um número de UFC’s por grama da amostra. De acordo com a 
placa de concentração 10−10 é estimado um número 2x1011UFC’s por grama da amostra de 
solo. As placas de concentração 10−7, 10−8, 10−9 contradizem as duas amostras onde foi 
identificados UFC’s, uma vez que nas placas contende estas amostras deveria conter um número 
de UFC’s maior que na placa de concentração 10−10. 
10 
 
 Assim como nos resultados obtidos pela técnica de Pour Plate, os obtidos pela técnica 
de Spread Plate não são satisfatórios devidos às incertezas ocasionadas pela placa onde o 
número de UFC’s foi indeterminado e pelas demais onde não houve crescimento microbiano. 
Novamente ocorreram falhas humanas na condução do experimento, dentre as possíveis falhas 
está o uso da alça de Drigalsky em alta temperatura devido ao processo de esterilização da 
mesma, ou também pela não homogeneização correta da amostra. 
 
6 CONCLUSÃO 
O objetivo do experimento não foi satisfatório, pois não foi possível determinar o 
número de UFCs por grama de solo a partir do plaqueamento de profundidade (pour plate) e 
para o plaqueamento de superfície (spread plate). Possíveis falhas no experimento como citadas 
anteriormente provavelmente influenciaram no resultado do experimento, tais como a não 
homogeneização correta da amostra durante as diluições, o uso do meio de cultura em elevada 
temperatura e a utilização da alça de Drigalsky para o espalhamento da amostra sem o seu 
devido resfriamento adequado. 
 Na literatura é possível concluir que o método de spread plate é mais eficiente na 
determinação de microrganismos. Como concluído por Cardoso Filho (2013) em seu estudo na 
contagem de fungos filamentosos e leveduras em camarões salgados secos: “O método spread 
plate é mais eficiente que o método pour plate para contagens de fungos filamentosos e de 
leveduras em camarões salgados-secos.” (DAS CHAGAS CARDOSO FILHO et al, 2013) 
 
 
 
 
 
 
11 
 
7 BIBLIOGRAFIA 
ARAUJO. Ademir Sergio Ferreira de.; MONTEIRO. Regina Tereza Rosim. 
Indicadores de qualidade do solo. Uberlândia: Biosci. J, 2007. 66-75 p. 
DAS CHAGAS CARDOSO FILHO, Francisco et al. Contagem de fungos 
filamentosos e leveduras em camarões salgados secos comercializados em Tereisina-
PI. Acta Veterinaria Brasilica, v. 7, n. 2, p. 171-175, 2013. 
GALLI, Ferdinando. Microrganismos do solo. Anais da Escola Superior de 
Agricultura Luiz de Queiroz 21 (1964): 247-252. 
MADIGAN, T. M.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10a 
edição, São Paulo: Prentice Hall, 2004 
PELCZAR JR, Michael J. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2 ed.Makron Books, 
2012. 
PINTO, Carlos de Sousa. Curso básico de mecânica dos solos em 16 aulas 3. Ed, 
.2006 
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 10. ed., Porto Alegre: 
Artmed, 2010. 
 
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