COLORAÇÃO DE GRAM - micro geral

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TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM 
 
1. Para que serve a técnica de coloração de Gram? No que ela se baseia? 
 
A técnica de coloração de Gram é utilizado pois classifica as bactérias em 
dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, diferenciando-as. ​Entre os 
fatores que irão diferenciar esses dois tipos, está a coloração das bactérias, a 
composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares. 
 
2. Antes da aplicação da técnica de coloração de gram é necessário realizar as 
etapas de preparo de esfregaço fixação. Explique no que consiste e como 
são realizados esses procedimentos. Por que a etapa de fixação necessária? 
 
Preparo do esfregaço: Para fazer uma preparação corada é necessário 
preparar o esfregaço na lâmina, o que corresponde às etapas que antecedem uma 
coloração. Deve-se flambar a alça de platina e deixá-la esfriar um pouco próximo ao 
fogo. Com a utilização da mesma, colocar uma gota de solução salina estéril no 
centro de uma lâmina limpa e seca, lembrando que, ao abrir e fechar o recipiente de 
solução salina, deve-se passar a boca de tal nas chamas do Bico de Bunsen, 
evitando contaminação. 
Posteriormente, deve-se novamente flambar a alça de platina, esfria-la, e 
retirar uma colônia de bactérias localizada na placa de petri, lembrando-se de 
sempre mantê-la próximo ao fogo e manuseá-la com cuidado (o risco de 
contaminação deve ser considerado sempre). 
Assim, espalha-se as bactérias na lâmina, homogeneizando a solução 
salina, tentando obter um esfregaço fino, já que um esfregaço muito grosso dificulta 
a observação individual das bactérias no microscópio, por uma grande concentração 
(uma em cima da outra). 
Em sequência, precisa-se flambar a alça e deixá-la secar. Antes de se 
fazer agir os corantes para a diferenciação das bactérias, é necessário fixar o 
esfregaço sobre a lâmina, onde o método mais usado consiste em passar a lâmina 
com o esfregaço a ser fixado sobre a chama do bico de Bunsen várias vezes, de 
forma rápida, onde que a chama entra em contato direto com o lado oposto ao 
esfregaço. 
A fixação pelo calor é muito importante e fundamenta-se na coagulação 
das proteínas da estrutura microbiana, que mata o microrganismo e faz com que 
fique aderido à lâmina, não desprendendo-se facilmente nas etapas da coloração, 
considerando que se possui um grande manuseio com a lâmina em todo o 
processo. 
 
3. Descreva as etapas da técnica de coloração de gram explicando o objetivo 
de de cada etapa e a reação que ocorre na parede celular das bactérias 
gram-positivas e gram-negativas. 
 
Etapa 1: Esfregaço, etapa explicada anteriormente, com o objetivo 
principal de inserir uma colônia de bactérias sobre a lâmina, juntamente com a 
solução salina. 
Etapa 2: Fixação, processo em que se passa a lâmina várias vezes no 
fogo, de maneira rápida, com o intuito de matar e aderir os microrganismos na 
lâmina 
Etapa 3: Adição do corante Cristal Violeta por 2 min, onde que, por sua 
vez, irá colorir a bactéria (tanto a gram- , como a gram +) em violeta/azul 
Etapa 4: ​Adição de Lugol por 2 min, substância constituída por iodo, ao 
qual formará um complexo com o cristal violeta (Complexo CV-I) no interior da 
célula, que será muito grande para passar pela parede celular, deixando tanto a 
gram + com a gram - violetas. O Lugol também é conhecido como o mordente do 
processo, ou seja, substância associada com a função específica de manter a 
durabilidade da cor, conferindo maior resistências nas lavagens. 
Etapa 5: Lavar a lâmina com água, sendo este uma etapa facultativa, 
querendo somente retirar o excesso de produto. Nota: cuidado para não direcionar a 
água direto na colônia, pois pode ocorrer modificações nos resultados. 
Etapa 6:​ Adição de solução álcool acetona por 30 segundos. 
❖ Nas gram +: ocorre a desidratação do peptideoglicano, diminuindo a 
porosidade e a permeabilidade, se contraindo e mantendo o complexo 
CV-I dentro da célula, permanecendo violeta 
❖ Nas gram -: a solução dissolve a membrana externa, aumentando a 
porosidade da parede celular, onde o complexo CV-I é removido da 
célula, deixando-a incolor. 
Etapa 7: ​Lavar a lâmina com água, para a retirada de excesso de 
produto. 
Etapa 8:​ Adição do corante Safranina por 30 segundos. 
❖ Gram +: ainda possuindo o complexo CV-I, a cor violeta mascara a 
coloração vermelha, fazendo com que a bactéria permaneça com sua 
cor arroxeada 
❖ Gram -: estando incolor, a célula adquire a cor avermelhada do 
corante. 
Etapa 9:​ Lavar com água, retirando o excesso de corante 
Etapa 10: Observar no microscópio com a objetiva de imersão (x100), e 
observar a cor da bactéria, fazendo assim, sua distinção. 
 
4. Qual a classificação da bactéria observada na aula prática? Como você 
chegou a essa conclusão? 
 
A Bactéria a qual observamos, era uma Gram +, considerando que, ao 
observá-la no microscópio, vemos uma coloração azulada/arroxeada, ou seja, na 
adição do álcool acetona, sua camada de peptidoglicano diminuiu a permeabilidade 
e se contraiu, fazendo com que o complexo CV-I, ao qual era responsável pela 
coloração roxa, ficasse preso na célula, e mascarando o corante avermelhado 
adicionado nas etapas posteriores. 
E assim, caso fosse uma gram -, não assumiria tais características, 
considerando que a mesma iria ter adquirido a cor vermelha. 
 
 
 
 
 
Referências 
 
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 10. ed., Porto 
Alegre: Artmed, 2010.