Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA AGROALIMENTAR UNIDADE ACADÊMICA DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS CAMPUS DE POMBAL - PB. ENRIQUECIMENTO PROTEICO DO MANDACARU (Cereus jamacaru P. DC) POR FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA UTILIZANDO Sacharomyces cerevisiae Tamires dos Santos Pereira Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Soares Co- Orientadora: Profa. Dra. Mônica Tejo Cavalcanti POMBAL-PB 2013 TAMIRES DOS SANTOS PEREIRA ENRIQUECIMENTO PROTEICO DO MANDACARU (Cereus jamacaru P. DC) POR FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA UTILIZANDO Sacharomyces cerevisiae POMBAL-PB 2013 Trabalho de conclusão de curso submetido à Coordenação do curso de Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Campina Grande como requisito parcial para obtenção de Grau de Bacharel em Engenharia de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Soares Co- Orientadora: Profa. Dra. Mônica Tejo Cavalcanti Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Soares Co- Orientadora: Profa. Dra. Mônica Tejo Cavaltani FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UFCG P436e Pereira, Tamires dos Santos. Enriquecimento proteico do mandacaru (cereus jamacaru p. Dc) por fermentação semi-sólida utilizando sacharomyces cerevisiae / Tamires dos Santos Pereira. – Pombal, 2013. 64 f. : il. color. Trabalho de Conclusão (Bacharel em Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Ciências e Tecnologia Agroalimentar, 2013. "Orientação: Prof. Dr. Osvaldo Soares da Silva, Prof.ª Dr.ª. Mônica Tejo Cavalcanti". Referências. 1. Bioconversão. 2. Fontes Alternativas. 3. Proteína Microbiana. I. Silva, Osvaldo Soares da. II. Cavalcanti, Mônica Tejo. III. Título. CDU 631.962(043) Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas no que parecia impossível. (Charles Chaplin) AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus pelo dom da vida e pela força e coragem durante esta longa caminhada. Aos meus orientadores Dr. Osvaldo Soares e Dra. Mônica Tejo, por me aceitarem, pela orientação, disponibilidade, incentivo, generosidade e sobretudo compreensão. Aos meus pais Francisca dos Santos Pereira e Francisco Pereira da Penha por dedicar suas vidas em prol desse grande sonho e me ensinarem valores, e dentre eles, que o amor, caráter e sabedoria são as maiores heranças, além do apoio incondicional e das ideias brilhantes que sempre me serviram de inspiração, e ao meu irmão Ailton Santos. Ao meu namorado Rafael Ferreira de Sousa por todo amor, confiança, dedicação e paciência, não só nesta fase, mas em toda a nossa caminhada. Espero que nossa cumplicidade seja eterna. As minhas irmãs de coração, que adquiri durante estes anos, amizade confirmada ao longo dos semestres, noites em claro de estudos, de gargalhadas, de cumplicidade, enfim, à milha família fora de casa... Ítala Maiara e Flávia Izabely, amo vocês! Aos meus colegas de trabalho Eugênio Marcelo e Khayllys Martins, por terem se tornado mais que bons amigos, pelos conselhos, força e conivência nesta fase tão atribulada que, por coincidência, passamos ao mesmo tempo. A todos os meus amigos e amigas pela compreensão da ausência e pela força. Principalmente a Jerffeson Araujo e Kléa Lourenço, pela ajuda nos momentos finais, notavelmente de bom coração, o que me motivou a seguir em frente em alguns dos piores momentos desta caminhada. Muito obrigada! Agradeço também a todos os professores que me acompanharam durante a graduação. Sem vocês este momento não seria possível. Valeu a pena esperar... Hoje estamos colhendo, juntos, os frutos do nosso empenho! Essa vitória é muito mais de vocês do que minha! V RESUMO O mandacaru é uma espécie nativa da vegetação da caatinga, pertencendo à família das cactáceas, cresce em solos pedregosos e com pouca água disponível. Apresenta grande valor nutritivo, contudo é pouco explorada pela população, sendo usada apenas para alimentação do gado em épocas de estiagem prolongada. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi utilizar os cladódios do mandacaru (Cereus jamacaru P. DC) como fonte de alimento realizando o enriquecimento proteico através da fermentação semi sólida. A fermentação semi-sólida com a levedura Saccharomyces cerevisiae proporciona diversos benefícios devido a seus aspectos físico-químicos, principalmente, sua reduzida atividade de água e o desenvolvimento de gradientes de temperatura, nutrientes e produtos produzindo uma proteína de origem microbiana de boa qualidade. O microrganismo foi adicionado ao substrato nos níveis de 5,10 e 15% em relação ao peso úmido do mesmo, e temperatura de 30, 34 e 38 °C, conforme o planejamento fatorial. Caracterizou-se o mandacaru segundo o seu teor de umidade, massa seca, teor de proteínas, teor de sólidos solúveis e pH durante o processo fermentativo. Ao fim do processo fermentativo, analisou-se a granulometria, densidade real e aparente, além da porosidade do produto obtido. De acordo com os dados obtidos verificou-se que o ensaio E2 incubado a 30°C e 15% de levedura ocasionou um crescimento proteico de 11,22 vezes em ralação ao inicial, sendo o mais eficiente. O principal objetivo deste trabalho foi alcançado, pois verificou-se a viabilidade da utilização dos cladódios do mandacaru (Cereus jamacaru P. DC) como fonte de alimento para animais ou mesmo humanos, realizando o enriquecimento proteico através da fermentação semi-sólida. Contudo, faz-se necessário o estudo da toxicidade e adequação do tipo e características da proteína ao enriquecimento de alimentos. Palavras-chave: Bioconversão. Fontes Alternativas. Proteína Microbiana. VI ABSTRACT The mandacaru is a native species of the caatinga vegetation, belonging to the family of cacti, growing in rocky soils and with little water available. It has high nutritional value, but is little explored by the population and is used only for animal feed in prolonged drought periods. Thus, the objective of this work was used the cladodes of mandacaru (Cereus jamacaru P. DC) as a food source by performing the protein enrichment through solid semi fermentation. The solid state fermentation with Saccharomyces cerevisiae provides many benefits because of their physico-chemical aspects, mainly their low water activity and the development of temperature gradients, nutrients and producing a protein product of microbial origin good quality. The microorganism was added to the substrate at levels of 5.10 to 15% compared to the wet weight thereof, and temperature 30, 34 and 38 ° C, according to the factorial design. Characterized the mandacaru according to its moisture content, dry matter, protein, soluble solids and pH during the fermentation process. At the end of the fermentation process, the particle size was analyzed, true density and apparent porosity of the addition product. According to the data obtained showed that the E2 assay incubated at 30 ° C and 15% yeast protein caused an increase of 11.22 times the original grating and is the most efficient. The main objective was achieved because there was the feasibility of use of cladodes of mandacaru (Cereus jamacaru P. DC) as a food source for animals or even humans,making the protein enrichment by solid state fermentation. However, it is necessary to study the toxicity and suitability of the type and characteristics of the protein for food fortification. Keywords: bioconversion. Alternative Sources. Microbial protein. VII SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................ v ABSTRACT............................................................................................................. vi LISTA DE FIGURAS............................................................................................... ix LISTA DE TABELAS.............................................................................................. xi 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 01 2 OBJETIVOS......................................................................................................... 03 2.1 Objetivo Geral................................................................................................... 03 2.2 Objetivos Específicos....................................................................................... 03 3 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................................. 04 3.1 O mandacaru.................................................................................................... 04 3.2 Microrganismos na produção de alimentos...................................................... 06 3.3 Proteína de origem microbiana......................................................................... 08 3.4 Levedura........................................................................................................... 08 3.5 Características fisiológicas e morfológicas da levedura................................... 11 3.6 Valor nutricional e composição química............................................................ 11 3.7 Enriquecimento proteico de substrato por Saccharomyses cereviseae........... 13 3.8 Fermentação semi-sólida (FSS)....................................................................... 14 3.9 Vantagens e desvantagens............................................................................... 17 3.10 Tipos de biorreatores...................................................................................... 19 3.11 Controle do processo...................................................................................... 21 3.12 Aplicabilidade da FSS.................................................................................... 24 3.13 Aplicação da FSS na alimentação humana.................................................... 27 4 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 29 4.1 Matéria prima.................................................................................................... 29 4.2 Beneficiamento do resíduo.............................................................................. 29 4.3 Caracterização da matéria prima...................................................................... 30 4.4 Processo fermentativo..................................................................................... 30 4.5 Caracterização do produto fermentado............................................................. 31 4.6 Análise estatística............................................................................................. 32 VIII 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 33 5.1 Caracterização da matéria prima...................................................................... 33 5.2 Processo fermentativo...................................................................................... 33 5.2.1 Umidade......................................................................................................... 33 5.2.2 Resíduo Seco................................................................................................. 42 5.2.3 pH................................................................................................................... 48 5.2.4 Teor de Sólidos Solúveis Totais..................................................................... 51 5.2.5 Teor de Proteína ........................................................................................... 52 5.2.6 Distribuição Granulométrica........................................................................... 55 5.2.7 Porosidade..................................................................................................... 56 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................ 57 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 58 IX LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Fluxograma do processo................................................................ 30 Figura 2 - Comportamento do teor de umidade durante o processo fermentativo..................................................................................................... 35 Figura 3 – Diagrama de Pareto para o teor umidade após 8 h de fermentação..................................................................................................... 37 Figura 4 – Superfície de resposta para o teor de umidade após 8 horas de fermentação...................................................................................................... 37 Figura 5 – Diagrama de Pareto para o teor umidade após 16 h de fermentação...................................................................................................... 39 Figura 6 – Superfície de resposta para o teor de umidade após 16 horas de fermentação...................................................................................................... 39 Figura 7 – Diagrama de Pareto para o teor umidade após 32 h de fermentação...................................................................................................... 41 Figura 8 – Superfície de resposta para o teor de umidade após 32 horas de fermentação...................................................................................................... 41 Figura 9: Teor de resíduo seco durante o processo fermentativo..................................................................................................... 43 Figura 10 – Diagrama de Pareto para o teor de resíduo seco em 8 horas de experimento..................................................................................................... 45 Figura 11 – Superfície de resposta para o teor de resíduo seco após 8 horas de fermentação....................................................................................... 45 Figura 12 – Diagrama de Pareto para o teor de resíduo seco em 32 horas de experimento................................................................................................. 47 Figura 13 – Superfície de resposta para o teor de resíduo seco após 32 horas de fermentação....................................................................................... 47 Figura 14 - Comportamento do pH durante o processo fermentativo.............. 49 Figura 15 – Diagrama de Pareto para o pH em 24 horas de experimento..... 50 Figura 16 – Superfície de resposta para o pH após 24 horas de fermentação...................................................................................................... 51 X Figura 17 - Comportamento do teor de sólidos solúveis durante o processo fermentativo...................................................................................................... 52 Figura 18 - Crescimentodo teor proteico durante o processo fermentativo...................................................................................................... 53 Figura 19 - Distribuição granulométrica da biomassa de mandacaru após o processo fermentativo...................................................................................... 55 XI LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Valores reais e codificados das variáveis independentes.................... 31 Tabela 2 - Matriz do planejamento fatorial 22 + 2 ponto central............................. 31 Tabela 3 – Características físico-químicas da biomassa do mandacaru............... 33 Tabela 4 – Teor de umidade para os experimentos durante o processo fermentativo............................................................................................................ 34 Tabela 5 - Análise de variância em relação ao teor umidade após 8 h de fermentação............................................................................................................ 36 Tabela 6 - Análise de variância em relação ao teor umidade após 16 h de fermentação............................................................................................................ 38 Tabela 7 - Análise de variância em relação ao teor umidade após 32 h de fermentação............................................................................................................ 40 Tabela 8 – Resíduo Seco para os experimentos durante o processo fermentativo............................................................................................................ 42 Tabela 9 - Análise de variância em relação ao teor de resíduo seco após 8 h de fermentação............................................................................................................ 44 Tabela 10 - Análise de variância em relação ao teor de resíduo seco após 32 h de fermentação....................................................................................................... 46 Tabela 11 – pH dos experimentos durante o processo fermentativo..................... 48 Tabela 12 - Análise de variância em relação ao pH após 24 h de fermentação.... 49 Tabela 13 – Teor de sólidos solúveis totais para os experimentos durante o processo fermentativo............................................................................................ 52 Tabela 14 – Teor de proteína para os experimentos durante o processo fermentativo............................................................................................................ 53 Tabela 15 - Aumento Proteico do Resíduo de mandacaru..................................... 54 1 1 INTRODUÇÃO A Caatinga é uma formação florestal que engloba 70% do Nordeste brasileiro, representando 11% do território nacional (CORTEZ et. al., 2007). Esse bioma caracteriza-se por apresentar arbustos e árvores espontâneas, de forma adensada, porte baixo e, no período menos chuvoso, aspecto seco com folhas pequenas e caducas. Entre as espécies existentes na Caatinga, estão alguns representantes da família Cactaceae, os quais desenvolveram adaptações para sobreviver em ambientes áridos, onde o fator limitante é a água. A maioria dessas plantas pertence aos gêneros Cereus, Pilosocereus e Melocactus, representados principalmente por Cereus jamacaru (mandacaru), Pilosocereus gounellei (xique-xique) e várias espécies de coroa-de-frade, como, por exemplo, o Melocactus zehntneri e o Melocactus bahiensis (TAYLOR; ZAPPI, 2004; SILVA et. al., 2011). As constantes variações climáticas no Nordeste, com longos períodos de estiagem tornam as cactáceas uma alternativa alimentar e uma fonte de água, dentre essa diversidade destaca-se cactáceas como o mandacaru (Cereus jamacaru). O mandacaru é um cacto colunar fartamente ramificado, apresentando flores brancas. Seus frutos são grandes, avermelhados e de polpa branca provida de muitas sementes, não comumente utilizada na alimentação humana, porém, comestíveis (GOMES, 1973). A família das cactáceas moldou-se às condições de intenso xerofitismo e individualizam o cenário vegetal das regiões mais secas da América Intertropical. São plantas suculentas com talos carnosos, roliços ou aplanados, de folhas caducas ou completamente ausentes (GOLA, 1965). A utilização de matérias primas vegetais regionalmente adaptadas é de suma importância para a melhoria da oferta e qualidade de alimentos que possam substituir, inteira ou parcialmente, alguns componentes básicos na composição da dieta, seja ela animal ou humana. A utilização de microrganismos tem por meta principal suprir a carência de proteínas, embora em alguns casos os lipídeos e as vitaminas sejam complementos valiosos do valor nutritivo. Microrganismos significam algas, bactérias, fungos e leveduras. Estas estão compreendidas entre os fungos, porém, em tecnologia são tratadas separadamente dos fungos filamentosos (LIMA; SATO, 2001). 2 A fermentação em estado semi-sólido (FSS) pode ser definida como o processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz semi-sólida (substrato ou inerte), onde o conteúdo líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e , por outro, não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida ( DEL BIANCHI et. al., 2001). A FSS proporciona diversos benefícios devido a seus aspectos físico- químicos, principalmente sua reduzida atividade de água e o desenvolvimento de gradientes de temperatura, nutrientes e produtos. A heterogeneidade microscópica do substrato, outrora considerado o ponto fraco da FSS, é hoje considerado como sua principal força para o acréscimo de rendimento de produtos e por causar adequadas alterações na fisiologia microbiana. É um processo que se favorece do reduzido teor de água, gerando um processo industrial limpo, com baixos níveis de água residual, o que incide também em economia energética, no processo de recuperação (“downstream”) (VINIEGRA-GONZALEZ, 1997). 3 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Objetivou-se com esta pesquisa a utilização dos cladódios do mandacaru com espinhos (Cereus jamacaru P. DC) como fonte de proteica realizando o enriquecimento por fermentação semi-sólida. 2.2 Objetivos Específicos Os objetivos específicos da presente pesquisa foram: Testar metodologia de FSS em cladódios do mandacaru com espinhos (Cereus jamacaru P. DC) destacando as possibilidades e limitações da utilização como fonte proteica; Verificar viabilidade econômica do produto a partir da disponibilidade da matéria prima, assim como da resposta ao enriquecimento proteico; Caracterizar a matéria prima in natura, bem como, após o processo fermentativo verificando e efetividade do processo utilizado. 4 3 REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 O Mandacaru No sertão nordestino a vegetação predominante é a caatinga hiperxerófila, que se apresenta normalmente densa, com porte arbóreo e, com menos frequência, arbóreo-arbustiva. Devido à ação antrópica, essa vegetação encontra-se muito devastada, sendo a utilização agrícola da região bastante intensa, com culturas de subsistência. As espécies mais encontradas são: catingueira (Caesalpinia pyramidalis), umbuzeiro (Spondias tuberosa), baraúna (Schinopsis brasiliensis), juazeiro (Zizyphus joazeiro), marmeleiro (Cróton sonderianus), facheiro (Cereus squamosus) e mandacaru (Cereus jamacaru). O mandacaru é uma espécie nativa da vegetação da caatinga, pertencendo à família das cactáceas. Cresce em solos pedregosos e, junto a outras espécies de cactáceas, formaa paisagem típica da região semiárida do Nordeste. É encontrado nos Estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e norte de Minas Gerais (SILVA; ALVES, 2009). As espécies pertencentes ao gênero Cereus possuem hastes eretas, altas e colunares. As hastes geralmente são ramificadas e apresentam de 4 a 6 “costelas” salientes. As aréolas presentes no caule possuem espinhos eretos. As flores são alongadas, com formato de funil e com abertura noturna (BRITTON; ROSE, 1963). Várias espécies do gênero são popularmente conhecidas como mandacaru. O mandacaru é um imponente cacto colunar, que se destaca pelo seu potencial como planta ornamental e também como planta forrageira (CAVALCANTI; RESENDE, 2006). Possui espinhos de coloração branca ou marrom-amarelada, flores grandes, brancas e com abertura noturna, surgindo em grandes quantidades (GOMES, 1972). Os frutos são grandes, de coloração vermelha e polpa branca, com muitas sementes. Eles servem para alimentação humana ou de animais, sendo, assim, de extrema importância para a sustentabilidade e conservação da biodiversidade da região (GOMES, 1972). As plantas de mandacaru se desenvolvem nas áreas mais secas do semiárido nordestino, em solos rasos e/ou em cima de rochas, multiplicando-se regularmente e cobrindo extensas áreas. 5 A exploração comercial dos cactos e de outras plantas consideradas suculentas representa uma alternativa viável, pois dispensa o uso excessivo de água, e, como podem ser multiplicadas tanto por sementes quanto via vegetativa, possuem baixo custo de produção (REYES, 1994). Segundo Rocha e Agra (2002) esta planta alcança de 3 a 7 m de altura, apresentando caule rico em espinhos rígidos, onde retém grande quantidade de água. É comumente utilizada como planta ornamental e ainda é empregada, em época de estiagem, para alimentação de bovinos, caprinos e ovinos. De acordo com Braga (1960) os artículos jovens do mandacaru servem, depois de queimados, de alimento para o gado. O fruto é uma baga, ovóide, com aproximadamente 12 cm de comprimento, vermelho, carnoso, de polpa branca, com inúmeras sementes pretas e bem pequenas, e suas flores noturnas são visitadas por mariposas e morcegos. O mandacaru apresenta elevada quantidade de fibras que são formadas por polímeros de elevada massa molar, como o amido, hemicelulose, pectina e lignina. É uma matéria rica em açúcares simples como glicose, frutose e sacarose, além de outros mono e dissacarídeos que são utilizados pelos microrganismos para síntese de proteínas. Todavia, os teores de proteínas e vitaminas são baixos. Portanto, com o cultivo de microrganismos adequados é possível aumentar o valor nutricional da cactácea, pois será acrescida de proteína microbiana, sais como: fosfato, potássio e cálcio, além das vitaminas do complexo B, importantes fatores de crescimento dos animais e seres humanos (VILLAS BOAS; ESPOSITO, 2000). Uma das conveniências do mandacaru é a reduzida perda de água para a atmosfera devido à forma do seu caule desprovido de folhas, o que minimiza a superfície de evaporação do vegetal e devido a presença de uma densa cutícula que reveste os folículos, existindo ainda tecidos mucilaginosos, que absorvem e armazenam grande quantidade de água. Por isso, na estiagem, quando todas as plantas secam e perdem suas folhas, o mandacaru e outras cactáceas mantêm-se verdes, contrastando com a paisagem. Daí a importância de utilizar o mandacaru como substrato para a bioconversão de proteína microbiana, uma vez que esta cactácea apresenta condições favoráveis para o desenvolvimento da levedura Saccharomyces cerevisiae (ARAÚJO, 2004). 6 3.2 Microrganismos na produção de alimentos Como as fontes de alimentação humana são de origem vegetal ou animal, é importante entender os princípios biológicos e as funções da biota microbiana associada com as plantas e os animais. Embora algumas vezes pareça que os microrganismos estão tentando arruinar nossas fontes de alimentação ao infectarem e destruírem plantas, animais e humanos, isso não demonstra suas funções principais na natureza. Na visão atual da vida no planeta, o principal objetivo dos microrganismos na natureza é a sua própria perpetuação (JAY, 2005). Segundo Pinheiro et. al. (1979) dentre as principais vantagens do uso de microrganismos na produção de alimentos são: o acelerado desenvolvimento do microrganismo, a exemplo de algumas espécies de leveduras e bactérias que podem se multiplicar em menos de 20 minutos; a probabilidade de uso de vários tipos de substratos, realizando a reciclagem e contribuindo com a preservação do meio ambiente; o efeito do clima é praticamente suprimido; além de o processo de produção poder ser contínuo. De acordo com Franco e Landgraf, (2008), atualmente se tem conhecimento de que os microrganismos podem desempenhar papeis muito importantes nos alimentos, sendo possível classificá-los em três grupos distintos, dependendo do tipo de interação existente entre microrganismo e alimento. Existem os microrganismos nos alimentos são causadores de alterações químicas prejudiciais, resultando no que chamamos de deterioração microbiana. A deterioração resulta em alterações de cor, odor, sabor, textura e aspecto do alimento. Essas alterações são consequências da atividade metabólica natural dos microrganismos, que estão apenas tentando perpetuar a espécie, utilizando o alimento como fonte de energia. A deterioração provocada é apenas uma consequência desse processo. Há também os microrganismos presentes nos alimentos que podem representar riscos à saúde. Esses microrganismos são genericamente denominados patogênicos, podendo afetar tanto o homem como animais. As características das doenças que esses microrganismos causam dependem de uma série de fatores inerentes ao alimento, ao microrganismo patogênico em questão e ao indivíduo a ser afetado. Os microrganismos patogênicos podem chegar ao alimento por inúmeras 7 vias, sempre refletindo condições precárias de higiene durante a produção, armazenamento, distribuição ou manuseio em nível doméstico. Outro grupo importante é o dos microrganismos presentes nos alimentos que causam alterações benéficas em um alimento, modificando suas características originais de forma a transformá-lo em um novo alimento. Essa forma de interação microrganismo - alimento é conhecida do homem há muito tempo. A esse grupo pertencem aqueles microrganismos que são intencionalmente adicionados aos alimentos para que determinadas reações químicas sejam realizadas. Muitos destes microrganismos já estão naturalmente presentes, não sendo necessário adicioná-los ao alimento, mas sim estimular seletivamente a sua atividade biológica. Neste grupo estão todos os microrganismos utilizados na fabricação de alimentos fermentados: queijos, vinhos, cervejas, pães, vegetais e muitos outros. Pelczar e Caan (1996) referem-se a utilização de microrganismos como alimentos e fontes atrativas de alimento, considerando que podem ser cultivados em resíduos ou subprodutos industriais, com produção de grandes quantidades de células ricas em proteína. Relacionam as seguintes vantagens em utilizar a proteína de célula única como suplemento ou substituto alimentar: os microrganismos crescem muito rapidamente e são produzidos em grandes quantidades; o conteúdo de proteína das células microbianas é muito alto, a porcentagem nas células leveduriformes varia de 40 a 50%, enquanto a carne e a soja apresentam 20 a 35% de proteína, respectivamente; as proteínas de microrganismos selecionados apresentam todos os aminoácidos essenciais; alguns microrganismos, em particular as leveduras, têm alto conteúdo de vitaminas; o meio de cultivo dos microrganismos é bastante diversificado, entre eles os dejetos ou subprodutos industriais, tais como:hidrocarbonetos de refinaria de óleo, líquidos com enxofre, hidrolisados de madeira. Muitos alimentos devem sua produção e suas características às atividades fermentativas dos microrganismos. Vários produtos, como queijos maturados, conservas, chucrute e linguiças fermentadas, são produtos que possuem uma vida de prateleira consideravelmente maior do que a matéria-prima a partir da qual formam elaborados. Além de serem mais estáveis, todos os alimentos fermentados possuem aroma e sabor característicos que resultam direta ou indiretamente dos microrganismos fermentadores. Em alguns casos, o conteúdo de vitaminas dos alimentos cresce juntamente com o aumento da digestibilidade da sua matéria- 8 prima. Nenhum outro grupo ou categoria de alimentos é tão importante ou tem sido tão relacionado ao bem-estar nutricional em todo o mundo quanto os produtos fermentados (JAY, 2005). 3.3 Proteína de Origem Microbiana A terminologia proteína de origem microbiana, ou proteína unicelular, faz referência a células secas, não viáveis de microrganismos, como leveduras, bactérias, bolores e algas desenvolvidas em diversas fontes de carbono. Durante a década de 60, a descoberta de que a proteína de origem microbiana poderia ser favorável para países em desenvolvimento em futura insuficiência de alimentos, estimulou o empenho em pesquisas nos institutos, universidades e indústrias (MENEZES, 2001). O acelerado crescimento, com elevada eficácia de conversão em proteína do microrganismo, que pode ser geneticamente modificado, é uma das vantagens do emprego da proteína microbiana (MENEZES, 2001). Quanto ao uso da proteína microbiana, as vantagens são inúmeras, como a possibilidade de utilizar alimentos não consumidos pelo homem como substrato para produzir proteína microbiana; apresenta alto teor de proteína proveniente de microrganismos, que podem chegar 60 a 70% do conteúdo microbiano dissecado; rápido aumento do número de células, como consequência da extraordinária capacidade de reprodução em curto espaço de tempo; continuidade do processo de produção de proteína microbiana independentemente de fatores climáticos; aproveitamento de resíduos agroindustriais como palhas, cascas, grãos, frutas, tubérculos, além do soro lácteo utilizado como substrato para a produção de proteína unicelular (FRAZIER; WESTHOFF, 1993). 3.4 Levedura Do ponto de vista taxonômico, as leveduras são homogêneas e sua classificação não é estável. Definem-se leveduras como fungos cuja forma 9 predominante é unicelular. Podem ser esféricas, ovoides, cilíndricas ou triangulares. Algumas são bastante alongadas formando filamentos semelhantes às hifas dos bolores. Em alguns casos, pode haver formação de um micélio verdadeiro, quando, após a divisão celular, as células permanecem unidas. Leveduras formadoras de pseudomicélios ou de micélios verdadeiros constituem a fase de transição entre as leveduras unicelulares e os fungos filamentosos (FRANCO; LANDGRAF, 2008). As leveduras são fungos como os bolores, mas se diferenciam deles por se apresentarem predominantemente sob forma unicelular. Por serem células mais simples, elas crescem e se reproduzem mais rapidamente do que os bolores. Uma levedura típica consta de células ovais, que se multiplicam assexuadamente comumente por brotamento ou emulação. A maioria das leveduras, não vive no solo, mas adaptou-se a ambientes com alto teor de açúcares, tal como néctar das flores e a superfície de frutas (MESSIAS, 2013). De acordo com sua reprodução, as leveduras de interesse em alimentos podem ser subdivididas em dois grupos: as leveduras verdadeiras, nas quais há formação de ascos contendo esporos sexuados (ascósporos) e leveduras falsas, que não produzem ascósporos ou qualquer outro tipo de esporo sexuado. Todas as leveduras podem reproduzir-se assexuadamente, sendo este o único processo em 50% delas. A reprodução assexuada ocorre por brotamento ou por fissão celular (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Pelczar e Caan (1996) citam um exemplo que permite comparar a produção de proteína das leveduras: "Enquanto um boi de 450 kg ganha em média 0,45 kg de proteína por dia; em contraste, 450 kg de levedura produzirão diversas toneladas de proteínas em apenas um dia". Vale ressaltar que conteúdo de proteína das células microbianas é muito alto e essas proteínas, na maioria das vezes, contêm todos os aminoácidos essenciais. Embora as leveduras possam diferir bastante em suas características fisiológicas, aquelas de importância em alimentos têm algumas características em comum. De modo geral, as leveduras requerem menos umidade que a maioria das bactérias e mais umidade que a maioria dos bolores. A temperatura ideal para o seu crescimento varia entre 25°C e 30°C, com algumas exceções importantes. O crescimento é favorecido pelo pH ácido. As leveduras multiplicam-se melhor quando estão em aerobiose, mas os tipos fermentativos multiplicam-se bem também em 10 anaerobiose. Açúcares são a melhor fonte de energia, embora leveduras oxidativas sejam capazes de oxidar ácidos orgânicos e álcool (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A eficácia da conversão proteica por leveduras esta sujeito a fatores como: temperatura, disponibilidade de oxigênio e suprimento de nutrientes. O tempo médio para duplicar o conteúdo de proteína é de aproximadamente 5 horas em sistemas de fermentação por batelada (BURROWS, 1970). Contudo, de modo geral, o micélio contém aproximadamente 38% de proteínas, gorduras e alto teor de vitaminas principalmente complexo B (LIMA; SATO, 2001). As leveduras são os microrganismos fundamentais usados como alimento em todo o mundo. As leveduras alimentares são leveduras secas, fragmentadas e mortas, sendo as espécies mais estudadas pertencem aos gêneros Candida e Saccharomyces (LIMA; SATO, 2001). As leveduras fermentativas vêm sendo exploradas pelo homem há milhares de anos, na produção de cerveja e do vinho e na fermentação do pão, embora, somente no século XIX tenha sido reconhecida a natureza biológica dos agentes responsáveis por estes processos, onde o principal agente da fermentação alcoólica, Saccharomyces cerevisae, é uma levedura ascomicética (MESSIAS, 2013). Messias (2013), ainda cita algumas leveduras de interesse industrial como a Saccharomyces cerevisae, S. calrsbergensis usadas na panificação, cerveja, vinhos, etc; S. fragilis, S. lactis fermentam lactose (tratamento de resíduos); S. roufii, S. mellis utilizadas no preparo de frutas secas, xaropes, geléias; S. baillie em fermentação de sucos (cítricos); Torulopsis osmofílica no leite condensado; Candida produz grande quantidade de proteínas, ataca leite e derivados; Rodutorula atua na deterioração de picles, chucrutes e carnes (cor vermelha ou amarelo) Picchia, Hansenula, Debarymocyces, Thricosporum também atuam na deterioração de picles com produção de película, oxida o ácido acético e altera o sabor; Debaryomyces utilizada na maturação de carnes, queijo e salsichas. As leveduras de panificação Saccharomyces cerevisiae apresentam-se como organismos atrativos para a produção comercial de proteína considerando que é de fácil propagação e de não ter relação patogênica com o homem (PARK; RAMIREZ, 1989). 11 3.5 Características Fisiológicas e Morfológicas da Levedura Os microrganismos diferem entre si morfologicamente e pelo comportamento. Embora sendo classificadas como fungos, as leveduras são tecnologicamente estudadas e utilizadas como um grupo à parte (LIMA e SATO, 2001). As leveduras são fungos unicelulares, ao contrário dos mofos, que são multicelulares; contudo, esta não é uma definição precisa. Muitos fungos, na verdade considerados leveduras, podem produzir diferentes graus de micélio (JAY, 2005). Leveduras apresentam membrana celular definida, pouco espessa em células jovens e rígidasem células adultas. Sua constituição é variável, sendo em sua maioria hidratos de carbono e em menor quantidade de proteínas e gorduras. Internamente demarcando o citoplasma, encontra-se a membrana citoplasmática muito evidente nas células adultas. O núcleo é pequeno, com aproximadamente 0,5 à 0,15 μm, sendo de formato esférico e bem definido, contudo em localização variável (COPYRIGTH, 2005). As leveduras são diferenciadas das bactérias pela maior dimensão da sua célula e pelo formato celular oval, alongado, elíptico ou esférico. As células de leveduras típicas variam entre 5 e 8 mm de diâmetro, sendo algumas ainda maiores. Culturas velhas de leveduras tendem a possuir células menores. A maior parte das leveduras importantes em alimentos se multiplica por fissão ou por brotamento (JAY, 2005). Jay (2005) acrescenta que as leveduras podem crescer numa ampla faixa de pH ácido, em até 18% de etanol e em presença de 55 a 60% de sacarose. Podem apresentar diferentes cores, do marfim ao rosa e até o vermelho. Alguns de seus ascósporos e artrósporos possuem alta resistência térmica (Os artrósporos são produzidos por alguns fungos tipo levedura). 3.6 Valor Nutricional e Composição Química Lima e Sato (2001) fazem referencia ao valor nutricional e composição química das leveduras de origem microbiana. 12 Os tecidos animais são constituídos de proteínas, que são elementos básicos do citoplasma e do núcleo das células, onde desempenham funções de elevada relevância para o organismo. As proteínas são formadas de aminoácidos, dos quais alguns podem ser sintetizados pelo organismo e outros que, por não serem sintetizados, devem ser oferecidos pelas dietas. Esses são conhecidos por aminoácidos essenciais. O valor nutricional de uma proteína depende dos aminoácidos presentes e da distribuição adequada em sua composição. A eficiência nutricional é evidenciada pelo teor de aminoácidos essenciais. A falta ou a deficiência de um deles compromete o metabolismo dos demais, pois durante a síntese proteica todos são solicitados ao mesmo tempo. A disponibilidade dos aminoácidos depende da digestibilidade das proteínas, ou seja, de sua capacidade de liberá-los. Nas proteínas animais 90% dos aminoácidos são prontamente absorvíveis, enquanto que nas proteínas vegetais nesse nível é bem inferior. O teor em fibra, o sistema de processamento de alimento e a presença de inibidores influem na digestibilidade. Quando em uma proteína vegetal o teor de inibidores é elevado, tratamentos diversos podem eliminar sua interferência, porém, um processamento muito enérgico pode afetar alguns aminoácidos presentes. Os isolados proteicos de vegetais, isentos de fibras e inibidores, têm maior eficiência e maior valor nutricional. Quando um alimento é deficiente em determinado aminoácido, pode ser suplementado pela associação com outros mais ricos naqueles elementos. Os concentrados proteicos obtidos de células de microrganismos são considerados como uma opção na busca de suprimentos alimentares nitrogenados. As proteínas unicelulares, assim chamados os concentrados proteicos obtidos de leveduras, fungos filamentosos, bactérias e microalgas, contam a seu favor algumas vantagens sobre os vegetais superiores, tais como: curto período de geração, possibilidade de modificação genética para alterar sua composição proteica, alto teor de proteínas, possibilidade de uso de material de recuperação de outros processos industriais, com baixo custo. O valor nutricional das proteínas unicelulares é de, aproximadamente, 50% da albumina de ovos. Sua deficiência mais importante é a de aminoácidos sulfurados, 13 mas quanto ao restante são relativamente bem balanceados. As bactérias apresentam mais metionina que as leveduras, mas estas são mais ricas em lisina. Alguns fatores são tradicionalmente considerados como limitantes para o uso das proteínas unicelulares. Entre eles estão a resistência da parede celular, que diminui a digestibilidade, o teor de ácidos nucleicos, cor forte e escura, falta de textura ou textura viscosa, e sabor e aroma pouco atrativos. Pesquisas relativamente recentes observaram o uso de leveduras no desenvolvimento de animais domésticos, abordando temas de alimentação, do metabolismo de compostos nitrogenados, bactérias no rúmem, degradação de ácidos nucleicos no intestino e absorção de bases nitrogenadas nucleicas e não foram encontradas resultados negativos que desaconselhem o uso de proteína de células microbianas como suprimento alimentar. Nas leveduras secas de destilaria, o teor de proteína bruta é mais baixo que o citado de outras fontes. A diferença pode ser devida ao método de secagem usado, ao mau uso do secador, á composição do meio de fermentação e a lavagem ou não do leite de leveduras. A baixa percentagem de proteínas nas leveduras secas de recuperação produzidas nas destilarias do Brasil tem sido uma constante do processamento. Raramente são encontradas amostras com mais de 35% de proteína bruta. Os possíveis motivos já foram citados, com grande probabilidade de o processos ou a operação de secagem ser a responsável. A secagem severa pode queimar a proteína, a fibra crua ou a matéria graxa. 3.7 Enriquecimento Proteico de Substrato por Saccharomyces Cereviseae Os microrganismos empregados na biossíntese de proteínas podem ser cultivados em substratos provenientes de rejeitos da agroindústria, sendo este tipo de matéria-prima de baixo custo no Brasil, obtendo-se, contudo, alta produção de células ricas em proteínas (DÚRAN, 1989). A levedura é o microrganismo mais empregado na indústria, sendo mais conhecida cientificamente a Saccharomyces cerevisiae. Tal espécie possui estrutura microscópica de célula única, viva e apresente as mesmas funções de qualquer 14 outro ser vivo, respira, alimenta-se, excreta, dentre outras funções vitais (ROCHA, 2002). A Saccharomyces trata-se de um grupo bastante heterogêneo, com leveduras que se multiplicam por brotamento multilateral ou através da formação de pseudomicélio. Todas as espécies têm intensa capacidade fermentativa. As espécies mais importantes são S. cereviseae, empregadas para as mais diversas finalidades: produção de pães, bebidas (cervejas, vinhos, etc.), álcool, glicerol, inverstase, enriquecidos proteicos e outras aplicações em processos tecnológicos. Por outro lado, estão frequentemente envolvidas em alterações indesejáveis em muitos alimentos como frutas, laticínios (leite, manteiga, etc.), maioneses, mel, vinagre e produtos fermentados. A espécie S. cereviseae é, na verdade, uma mistura de inúmeras linhagens, muitas especialmente selecionadas e exploradas para fins industriais (BANWART, 1989). Destacam-se dentre outros, os seguintes substratos utilizados para obtenção do enriquecimento proteico através de microrganismos: resíduos de bananas, farinha e resíduos sólidos do processamento de mandioca, espiga de milho, cana- de-açúcar, bagaço de cana, bagaço de maçã, melaço, vinhaça, farelo e palha de trigo, grão-de-bico, polpa de café, arroz cozido, casca de limão, laranja, rejeito da fabricação de polpa congelada de acerola, maracujá, abacaxi, goiaba, morango e pedúnculo do caju. Estes representam no Brasil, matéria-prima abundante de baixo custo (HOLANDA et. al., 1998). Segundo Araújo (2004), dos vegetais cultivados na região semiárida do Nordeste, entre os mais adequados ao cultivo de microrganismos proteicos, destacam-se o mandacaru sem espinhos (Cereus jamacaru P.DC) e a palma forrageira (Opuntia fícus indica Mill). Estas cactáceas oferecem na sua composição química, alto teor de carboidratos que pode ser empregado como fonte principal para o crescimento de fungos filamentosos ou leveduras. 3.8 Fermentação Semi-Sólida (FSS) A palavra fermentação já teve muitos significados no passado. Deacordo com a definição de um dicionário, fermentação é "um processo de variação química com efervescência...", "um estado de agitação ou sem descanso...", "qualquer uma de 15 várias transformações de substâncias orgânicas". A palavra se tornou popular antes dos estudos de Pasteur com vinho. Prescott e Dunn (1957) e Doelle (1975) discutiram a história do conceito de fermentação e concluíram que o sentido geral no qual esse termo é normalmente utilizado é definido como "um processo no qual transformações químicas são realizadas em um substrato orgânico pela ação de enzimas produzidas por microrganismos". Bioquimicamente, a fermentação é o processo metabólico no qual carboidratos e compostos relacionados são parcialmente oxidados, resultando em liberação de energia, sem qualquer aceptor de elétrons externo. Os aceptores finais de elétrons são compostos orgânicos produzidos diretamente da quebra de carboidratos. Consequentemente, ocorre a oxidação incompleta do composto original, resultando em liberação de apenas uma pequena quantidade de energia durante o processo. Os produtos da fermentação consistem em alguns compostos orgânicos, os quais são mais reduzidos do que outros (JAY, 2005). A FSS é, com certeza, mais antiga que o próprio homem, sendo, portanto muito difícil precisar o início desta prática pela atividade humana. Sabe-se, contudo, que várias formas de alimentos utilizando esse processo microbiano fazem parte da dieta de muitos povos há muitos anos (DEL BIANCHI et. al., 2001). Fermentação semi-sólida (FSS) é o processo em que há crescimento de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida, onde a quantidade de líquido apresenta um nível de atividade de água que possa garantir o crescimento e o metabolismo dos microrganismos, mas que não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz (PINTO et. al., 2006). O substrato deve ter algumas características que possibilitem o maior rendimento do processo. A principal peculiaridade é o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o meio e, para tanto, de suas características mais importantes destacam-se a porosidade, o tamanho e o formato das partículas (DEL BIANCHI et. al., 2001). Em relação ao tamanho da partícula, um problema se apresenta: se, por um lado, quanto menor o tamanho maior a área superficial e, consequentemente, maior o grau de transformação, por outro lado o processo necessita ter granulometria própria visando permitir a circulação de ar por ente a massa e a dissipação de gases e calor produzidos, os quais poderiam vir a prejudicar o rendimento do processo. 16 Esse item é importante para a definição da altura do substrato e granulometria do meio que deve ser empregado no processo (DEL BIANCHI et. al., 2001). Embora alguns autores citem como aspecto importante a simplicidade do meio de culturas utilizado no processo, em boa parte dos estudos o substrato necessita de um pré-tratamento para se adequar as condições necessárias ao crescimento e à produção de metabólitos pelos microrganismos (DEL BIANCHI et. al., 2001). Assim, para facilitar a atuação dos microrganismos sobre o meio, podem ser empregados alguns processos como o esmagamento, quebra, moagem e peneiramento, visando adequar o meio à granulometria mais adequada ao processo. Nesse último caso, porém, além de ser uma etapa de consumo muito grande de energia, a esterilização pelo calor pode causar uma modificação nas características do substrato, tais como textura ou qualidade nutricional, que refletem na formação de uma massa compacta ou granular, um ressecamento da massa e, às vezes, uma adesão de massa à parede do fermentador (DEL BIANCHI et. al., 2001). A fermentação semi-sólida (FSS) igualmente chamada de fermentação sólida ou em estado sólido tem se sobressaído nas pesquisas e progressos obtidos no aproveitamento de resíduos. De um modo geral a FSS é um processo microbiano que se desenvolve na superfície de materiais sólidos, que apresentam a característica de absorver ou de conter água, com ou sem nutrientes solúveis. Estes materiais sólidos podem ser biodegradáveis ou não. Para a FSS, é necessário que os microrganismos cresçam com nutrientes difusíveis sob ou sobre a interface liquido-sólido (VINIEGRA-GONZALEZ, 1997). Esta fermentação se diferencia por 2 tipos: uma, em que as condições para o estado sólido são propiciadas pelo próprio substrato. Na outra FSS, o desenvolvimento do processo se dá utilizando um suporte inerte (COUTO; SANROMÁN, 2005; DEL BIANCHI et. al., 2001). O principal aspecto que torna possível diferenciar a fermentação em estado sólido e a de cultura submersa está no conteúdo de água do disponível no substrato. Enquanto na cultura em estado sólido, o conteúdo de água disponível no substrato varia entre 40% e 80%, na cultura submersa típica, o conteúdo de água é superior a 95% (CRUEGER; CRUEGER, 1990). Na cultura líquida, o substrato, no formato de 17 pequenos fragmentos, é suspenso ou dissolvido no líquido, geralmente água, juntamente com o microrganismo ativado (TAJIMA, et. al., 1966). Segundo Reed, (1981), a escolha do processo fermentativo em estado sólido deve se basear nas considerações sobre as vantagens e desvantagens do método quando comparadas com a cultura submersa. Os maiores problemas da fermentação em estado sólido consistem no monitoramento e controle de pH, temperatura, conteúdo de água, agitação e homogeneização durante todo o processo de fermentação (RODRIGUES; SANT’ANNA, 2001). 3.9 Vantagens e Desvantagens Segundo os autores Bramorski (1997) e Lu, Maddox e Brooks (1998) podem ser consideradas algumas vantagens da FSS, como, o meio que é geralmente simples, consistindo de produtos agrícolas não refinados que podem conter todos os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo. O tratamento de efluentes e disposição de resíduos é geralmente simples ou minimizado. Geralmente todo o produto é utilizado, principalmente, se é intencionado o uso como suplementação alimentar de animais. O espaço ocupado pelo equipamento de fermentação é pequeno, considerando-se o rendimento do produto e a utilização em menor quantidade de água, sendo assim, o custo de esterilização reduzido, pois se aquece menos água. Como a maioria das bactérias requer altos níveis de mistura líquida, a FSS exclui, ou reduz, sensivelmente, o problema da contaminação bacteriana, sendo o meio facilmente aerado, desde que haja espaço entre as partículas do substrato. O resíduo remanescente possui um volume reduzido e este resíduo não apresenta condições para o desenvolvimento de patógenos, exigindo menor demanda de energia e equipamentos de menor custo. Outros autores apresentam também algumas vantagens operacionais do processo em estado semi-sólido em relação ao estado submerso como vários estudos apontam que o substrato utilizado é relativamente simples, necessitando, em muitos casos, somente de adição de água ou uma pequena correção do meio 18 com a introdução de fontes de nitrogênio e de outros nutrientes minerais (CANNEL; MOO-YOUNG, 1980). Devido à menor quantidade de água empregada, o volume do reator deve ser sempre bem menor que a operação similar em processo submerso o que irá reduzir os custos de operação e de capital investindo assim como o espaço ocupado necessário ao processo (AIDOO et. al., 1982). A utilização de agitação contínua raramente é necessária, podendo ser empregada, ocasionalmente, apenas uma leve mistura de substrato (CANNEL; MOO-YOUNG, 1980); já que a aeração, natural ou forçada, é facilmente acessível aos microrganismos, devido as fendas existentes entre as partículas do substrato (HESSELTINE, 1977). Os baixos teores de umidade empregados, somados à alta concentração de inóculo incorporado ao meio, reduzem, ou muitas vezesaté eliminam, o problema de contaminação por outros microrganismos indesejáveis (ROUKAS, 1994). Além do que há uma menor produção de resíduos líquidos a serem tratados ou dispostos, o que reduz também os custos de capital investido e de operação da planta de tratamento construída, além de resultar em uma redução nos problemas ambientais originados pelo processo (KARGI et. al., 1885). Os autores Bramorski (1997) e Lu, Maddox e Brooks (1998) apontam algumas desvantagens da FSS, a exemplo dos tipos de microrganismos que podem ser usados são limitados, em função das condições do processo, tais como: baixa concentração de água livre. Os mais utilizados são fungos e algumas leveduras. A transferência de oxigênio entre as partículas do meio pode se tornar um problema, quando se utiliza granulometria do substrato muito elevado. O controle de temperatura é crítico e, muitas vezes, é necessário controlar a composição da atmosfera no que diz respeito a O2, CO2 e outros metabólitos voláteis. Contrariamente á simplicidade de operação da FSS, a heterogeneidade da mistura dificulta o controle de crescimento microbiano e de variáveis como agitação, aeração e concentração de nutrientes e produtos. A natureza do substrato sólido empregado em uma fermentação semi-sólida é o fator mais importante no desenvolvimento deste bioprocesso, sendo a sua seleção dependente de diversos fatores, principalmente do custo e da sua disponibilidade. Pesquisas voltadas para 19 os resíduos agroindustriais de todo o mundo vem sendo feitas a fim de selecionar substratos adequados para a FSS (ZADRAZIL; PUNIA, 1995). Alguns autores também citam algumas restrições do processo de FSS, resaltando que devem ser conhecidas para futuros estudos e visando uma possível resolução destes problemas como o fato de devido à heterogeneidade do substrato, dissipação de calor e gases gerados, na manipulação do meio e do produto final e do monitoramento e controle do processo, poderá haver dificuldades intrínsecas quando se desejar realizar a ampliação da escala do sistema (DEL BIANCHI et. al., 2001), além de que se for necessário o emprego de agitação do meio em fermentação, a energia desprendida deverá ser bem maior que em processo submerso (RALPH, 1976). Segundo Neto e Couri (1996) nos anos 70, quando houve uma retomada nas pesquisas em FSS, já havia uma conformidade entre autores que as dificuldades encontradas na fermentação semi-sólida estão, principalmente, em se improvisar o escalonamento dos modelos de bancada, a sua instrumentação, automação e construção de biorreatores adequados. Observa-se, também, uma tendência para fermentadores do tipo tambor rotativo. Ainda segundo os mesmos autores, algumas demandas por Pesquisa e Desenvolvimento na área de FSS são métodos econômicos de mistura, aquecimento, esterilização, inoculação e incubação do substrato sólido; melhorias na instrumentação para monitoramento, controle e automação dos parâmetros do processo; desenvolvimento de modelos matemáticos para predição efetiva e otimização dos dados. 3.10 Tipos de Biorreatores A fermentação semi-sólida (FSS) pode ser processada em dois tipos de reatores estáticos (leito fixo ou bandejas) e dinâmicos (tambor rotativo). A principal desvantagem dos reatores estáticos está associada à remoção de calor, que ocorre apenas por condução, tornando o processo caro quando se opera em escala comercial, necessitando de equipamentos grandes e com elevada fração de vazios. A principal desvantagem dos reatores dinâmicos está associada ao impacto sobre o 20 micélio, que é frágil. Não existem, portanto, princípios estabelecidos para a seleção de biorreatores. Cada sistema substrato-microorganismo requer um projeto e condições específicas (NETO; COURI, 1996). Os reatores convencionais usados na FSS são classificados em cinco tipos principais, sendo eles os reatores com bandejas, torre, leito com aeração forçada, tambor rotativo e tanque agitado. Os primeiros três tipos são sistemas de operação descontínua, de menor custo de capital e operação, porém não possibilitam um controle adequado dos parâmetros envolvidos no processo. Os demais podem ser usados em operação contínua e descontínua, têm maior custo de capital e, se necessário, permitem um controle mais adequado do processo (NETO; COURI, 1996). Segundo Del Bianchi, et. al., (2001), a forma empregada em praticamente todos os experimentos a nível de laboratório diz respeito ao processo em batelada no qual, basicamente, o meio é adicionado ao reator, ocorrendo então a inoculação do substrato e a inoculação do substrato e a incubação do mesmo por um determinado período de tempo. Um item que deve também ser bem analisado refere-se a escolha dos fermentadores e, neste caso, deve-se levar em conta os objetivos da fermentação, os análise econômicas dos custos iniciais e operacionais do processo (CANNEL; MOO-YOUNG, 1980), a manipulação simplificada do sistema (carga/recarga, limpeza, manutenção) e a possibilidade de monitoramento e controle de diversos parâmetros, se houver necessidade (DURAND, et. al., 1988). Dos diferentes tipos de reatores encontrados na literatura, alguns dos mais comumente empregados são os reatores de bandejas, onde as primeiras a surgirem foram as bandejas rasas. Constituídas em estrutura, alumínio ou aço inoxidável ou outros materiais, de diversos tamanhos (geralmente com a altura do meio variando basicamente entre 2 a 7 cm), elas podem possuir seu fundo intacto, o que significaria uma atuação muito parecida com a dos erlenmeyers, porém com uma área superficial de troca e uma capacidade de alocar meio de cultura muito maior. Podem também ter seu fundo substituído por uma tela perfurada, o que lhes confere uma maior eficiência na circulação de ar por todo o meio, e não somente na parte superior exposta ao ambiente. 21 Para a disposição das bandejas, deve-se ter um local apropriado para o desenvolvimento da fermentação. Podem ser utilizadas simplesmente salas com estantes, fazendo-se uso de ar natural ou aeração forçada (passando antes por umidificadores), desde que haja o controle de temperatura e umidade. As bandejas perfuradas, por outro lado, podem ser também dispostas em estufas que possuam uma adaptação para a entrada de aeração forçada pelo fundo do equipamento (DEL BIANCHI, et. al., 2001). Ainda segundo Del Bianchi, et. al., (2001), nesses casos, o substrato é aspergido por uma solução de inóculo. Instalações desse tipo requerem um elevado número de trabalhadores, além de um número de bandejas manipuladas diariamente ser igualmente elevado. A Esteira rolante é uma variante do fermentador de bandejas. As etapas de inoculação e incubação do material esterilizado são realizadas em longas esteiras de fundo perfurado por onde circula ar úmido. De acordo com as necessidades de cada produto, pode ser realizada também uma agitação ocasional (THIEMANN, 1985). 3.11 Controle do processo Como em todo o processo fermentativo, o controle de determinados parâmetros faz necessários para a obtenção de produtos com características constantes e uniformes como o controle da umidade, da temperatura e do pH do meio, a velocidade e frequência de agitação, as condições de transferência de massa, transferência de calor, cinética das reações, concentração de gases, além da influência do substrato e do biorreator no processo fermentativo (DEL BIANCHI et. al., 2001). A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o tipo de produto final desejado são os principais fatores que determinam o grau de umidade que o substrato deverá ter no inicio e ao longo da fermentação. Um substrato apropriadamente umedecido deve ter um filme superficial de água visando facilitar a dissolução e a transferência de massa de nutrientes e de oxigênio. Porém,22 entre as partículas devem existir canais que permitam a difusão de gases e a dissipação de calor (THIEMANN, 1985). Assim, se o nível de umidade for elevado, implicará no decréscimo de porosidade do substrato e irá resultar em uma menor difusão de oxigênio no interior do meio e consequente decréscimo de trocas gasosas, além de aumentar o risco de contaminação principalmente bacteriana (LONSANE, et. al., 1985). Para níveis de umidade menores que o necessitado, haverá maior dificuldade na difusão de nutrientes, resultando em um crescimento de microrganismos menor do que o possível e esperado e, consequentemente, com menor produção do produto desejado (lembrando que, a um teor de umidade a baixo de 12%, não há desenvolvimento microbiano) (MOO-YOUNG, et. al., 1983). Para a produção de toxinas, é necessário apenas um teor de umidade entre 18 e 30 % (LINDERFELSER; CIEGLER, 1975), enquanto para o crescimento de microrganismos, tendo lignocelulose como substrato, os níveis variam entre 70 a 80%. Quando o microrganismo utilizado é uma bactéria, a umidade costuma ser sempre superior a 60% (SILMAN et. al., 1979). Durante a fermentação, haverá uma perda de umidade devido à evaporação e às atividades metabólicas microbianas. Essa perda poderá ser reposta ou evitada, pela adição de água esterilizada em intervalos constantes de tempo, pela manutenção da umidade atmosfera entre 90-97% de umidade relativa através de injeção contínua de ar úmido no fermentador ou com instalação de umidificadores (LONSANE, et. al., 1985). A atividade de água fornece a quantidade de água não ligada viável à disposição dos microrganismos. Ela é definida como a razão entre a pressão de equilíbrio de vapor do substrato em relação a água pura, à mesma temperatura. A atividade de água (aw) influencia o desenvolvimento microbiano e os processos bioquímicos. Assim, cada microrganismo tem um nível de aw mínimo para que possa efetuar suas atividades metabólicas. Em termos gerais, por exemplo, os fungos possuem uma aw mínima de 0,7, enquanto que para as leveduras o valor situa-se em 0,8 e para bactérias, 0,9 (RAMANA MURTHY, et. al., 1993). Devido às atividades metabólicas dos microrganismos e dependendo da altura da camada de substrato, uma grande quantidade de calor pode ser produzida 23 durante o processo fermentativo, assim a temperatura é considerável uma variável importante no processo fermentativo (DEL BIANCHI, et. al., 2001). O controle do pH durante a fermentação em estado sólido, embora este seja um dos parâmetros mais críticos, dificilmente será conseguido devido à homogeneidade e à consequência do material. Como tentativa de amenizar o efeito de uma variação brusca do potencial hidrogeniônico, utilizam-se substratos com boa capacidade tamponante ou a adição de soluções-tampão durante a etapa de umidificação do substrato (LONSANE, et. al., 1985). Para um bom rendimento e uma rápida fermentação em substrato sólido, é necessário o uso de uma grande área superficial do meio de cultura, no qual o microrganismo pode se desenvolver em contato com o ar. Na maior parte dos processos, tanto em nível laboratorial como em nível industrial a oxigenação do meio é realizada pela introdução de ar esterilizado sob pressão no equipamento de fermentação (DEL BIANCHI, et. al., 2001). Há diferentes maneiras para se obter uma melhor movimentação de ar por entre o substrato, permitindo assim uma melhor transferência de oxigênio, que seja pela utilização de material poroso medianamente granulado ou fibroso, pelo uso de pequena espessura da camada de substrato, pela utilização de bandejas perfuradas ou reatores com fundo composto por uma tela de arame, pela agitação do substrato ou ainda pela introdução de ar estéril dentro do reator (LONSANE, et. al., 1985). O emprego da agitação em um processo em estado sólido pode vir a fornecer uma melhor homogeneização quanto à distribuição dos inóculos e do umidificante, impedir a formação de agregados e favorecer tanto a transferência gasosa pela exposição de partículas de substrato à atmosfera do fermentador como a troca de calor dentro do meio (LONSANE, et. al., 1985). A agitação, porém, devido à fragmentação mecânica do micélio, pode interferir na formação dos esporos e no desenvolvimento natural do microrganismo (SILMAN, 1980). Pode causar também a compactação do meio e a danificação das hifas (THIEMANN, 1985). A sequência de crescimento microbiano em meio de cultura, em condições ótimas, envolve a germinação nas primeiras horas, seguida de um aumento gradual de temperatura devido ao início das atividades metabólicas, uma taxa crescente das atividades metabólicas, a fase estacionária e de declínio. A duração de cada etapa 24 vai depender das condições de fermentação, do microrganismo empregado e do produto que se deseja obter (LONSANE, et. al., 1985). 3.12 Aplicabilidade da Fermentação Semi Sólida Nos países do Ocidente, nos dias de hoje, diversos estudos estão sendo realizados utilizando-se substrato semi-sólido tanto na obtenção de bioprodutos como no desenvolvimento de reatores ou conhecimento do metabolismo e condições do processo (DEL BIANCHI, et. al., 2001). O bom emprego comercial da FSS pode ser racionada em dois tipos aplicações socioeconômicas tais como a compostagem de resíduos, valorização de produtos lignocelulósicos e fibras alimentares; assim como aplicações economicamente lucrativas, tais como, a produção de enzimas, ácidos orgânicos e alimentos fermentados. (MITCHELL et. al., 2002). Há muitas décadas, investigadores de diversos países vêm estudando a utilização de microrganismos como alimento. Eles fazem parte da alimentação do homem desde séculos, como agentes ou integrantes de processo de preparo de alimentos e, em muitos casos, são ingeridos com o alimento que ajudaram a preparar (LIMA; SATO, 2001). Uma das primeiras referências que se tem sobre o processo em meio sólido no Ocidente, além de uma citação da obtenção de queijo roquefort em 100 d. C. (CANNEL; MOO-YOUNG, 1980), está associada, no início deste século, nos Estados Unidos, ao nome do pesquisador Takamine na produção de "mold bran", similar ao "Koji", que consiste basicamente no emprego do farelo de trigo no lugar do arroz e de outros fungos para a obtenção do complexo enzimático. Este estudo visava substituir o malte na indústria de destilados (THIEMANN, 1985). Em tempos de guerra foram feitos, com sucesso, ensaios de alimentação de populações com micélio seco de fungos. Algumas espécies, como Fusarium e Rhizopus, contêm quantidades apreciáveis de cistina e de metionina, mas outros são deficientes nestes aminoácidos. Da mesma forma, alguns são menos ricos em vitaminas do grupo B do que as leveduras (LIMA; SATO, 2001). 25 Vários dos produtos alimentícios fermentados no Oriente são obtidos em substrato sólido como o tempeh, nato, miso, que geralmente empregam soja e cereais como substratos. Foram esses processos de produção de alimentos fermentados no Oriente que deram procedência às técnicas atuais de Fermentação Semi-Sólida (NETO; COURI, 1996). No decorrer do tempo, a FSS passou a ser empregada para a obtenção de vários produtos, desde que se dispusesse do microrganismo adequado. Para a produção de enzimas são utilizados basicamente dois tipos de processo: a fermentação semi-sólida e a fermentação líquida submersa (NETO; COURI, 1996). A ecologia microbiana dos alimentos e das fermentações relacionadas tem sido estudada há muitos anos em produtos como queijos maturados, chucrute, vinhos e outros. As atividades dos organismos fermentadores dependem dos parâmetros intrínsecos e extrínsecos de crescimento. Por exemplo, quando o alimento in natura contém açúcares livres e é acidificado, leveduras crescem rapidamente e produzem álcool, restringindo as atividades de outros organismosnaturalmente presentes. Se, ao invés disso, a acidez de um produto permite um bom crescimento bacteriano e, ao mesmo tempo, tem altas concentrações de açúcares simples, é de se esperar o crescimento de bactérias acidolácticas. A adição de baixas quantidades de NaCl também permitirá o crescimento preferencial das bactérias em relação as leveduras (como ocorre na fermentação do chucrute) (JAY, 2005). Além de altos teores proteicos a levedura exibe como característica um bom equilíbrio de aminoácidos, onde os níveis de lisina e metionina destacam-se em relação a outras fontes proteicas (ANGELIS, 1986). Ainda segundo Angelis (1986), nas leveduras encontram-se mais de 10 vitaminas solúveis na água, pertencentes ao complexo B (principalmente tiamina, riboflavina, niacina e ácido pantatênico). Existe ainda uma quantidade razoável de ergosterol, o que a torna uma excelente fonte de vitamina D. A quantidade de carboidratos nas leveduras de alimentação varia de 22 a 34% da matéria seca. O teor de lipídeos nas leveduras atinge cerca de 18%, podendo chegar a 40%. Os componentes lipídicos predominantes são triglicerídeos, lecitina e ergosterol. Nos triglicerídeos predomina os ácidos, portanto, semelhante à composição dos óleos vegetais. 26 De acordo com a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (1991) a levedura de destilaria de álcool produzido a partir de cana-de-açúcar é um alimento rico em proteína de alto valor biológico e uma boa fonte de lisina, leucina, treonina, vitaminas do complexo B, carboidratos, lipídios e minerais os que podem favorecer sua combinação com cereal como o milho. Produtos que contêm polissacarídeos, mas não apresentam níveis significativos de açúcares simples são normalmente estáveis a atividades de leveduras e bactérias acidolácticas devido a alta de amilase na maioria destes microrganismos. Para a fermentação ser realizada, uma fonte exógena de enzima sacarificantes deve ser fornecida. O uso de malte de cevada em cervejarias e indústrias de destilação é um exemplo disso. A fermentação de açúcares até a formação de etanol é resultante da maltagem e ocorrem devido às leveduras (JAY, 2005). O uso do koji na fermentação de produtos de soja é outro exemplo de como fermentações alcoólicas e acidolácticas podem ocorrer em produtos contendo baixos níveis de açúcares e altos níveis de amidos e proteínas. Embora as enzimas sacarificantes do malte de cevada sejam provenientes da germinação das sementes de cevada, as enzimas do koji são produzidas pelo Aspergillus oryzae, que cresce em grãos de arroz molhados ou cozidos a vapor, ou em outros cereais (o produto comercial takadiastase é preparado com A. oryzae que cresce em farelo de aveia). Os hidrolisados do koji podem ser fermentados por bactérias acidolácticas e leveduras, como ocorre no caso do molho de soja, ou suas enzimas podem agir diretamente no grão de soja na produção de produtos como o miso japonês (JAY, 2005). Proteína unicelular é aquela proveniente de células de microrganismos. Fungos filamentosos, leveduras, bactérias e algas são fontes de proteínas unicelulares. As leveduras têm sido preconizadas com mais frequência, contudo esta produção depende do tipo de substrato a ser utilizado, disponibilidade de matéria prima, velocidade e multiplicação do organismo, toxicidade, digestibilidade e valor nutritivo do produto final. A levedura é fonte de proteínas e vitaminas do complexo B e minerais. No estado seco, contém cerca de 50% de proteína de boa qualidade (MESSIAS, 2013). 27 No processo de produção de proteína unicelular dá-se preferência a matérias abundantes, de baixo custo, ricos em carboidratos, como resíduos industriais, de destilarias, de processamento de alimentos, soros de leite, resíduos lignocelulósicos de bagaço de cana, papéis velhos, etc. (MESSIAS, 2013). Consiste primeiramente, na transformação de hidratos de carbono da matéria- prima em matéria celular, com suplementação de sais de amônio e fósforo; em seguida na obtenção de proteína unicelular de leveduras, a conversão da matéria- prima em proteína é conduzida em fermentadores que são dotados de dispositivos para agitação e aeração, objetivando fornecer oxigênio que é essencial ao desenvolvimento dos microrganismos (MESSIAS, 2013). Finalizada a fase de conversão, segue-se o processo de recuperação, que consiste em separar a massa celular dos outros componentes indesejáveis do meio de cultura, o que se consegue por processos de centrifugação, lavagem, filtração e secagem (MESSIAS, 2013). 3.13 Trabalhos sobre fermentação semi-sólida Almeida et. al. (2009) analisaram a bioconversão do mandacaru para produção de bioprodutos, e verificaram que durante a fermentação semi-sólida do mandacaru o fungo do Aspergillus niger teve um aumento protéico de 76,9% no tempo de 72 h de fermentação na temperatura de 30 ºC a uma espessura da camada de 1 cm. Campos (2008) pesquisou o enriquecimento nutricional da palma forrageira e observou que o teor máximo de proteína bruta alcançado no biorreator de tambor rotativo foi de 43,27%, obtendo um aumento proteico de 6,44 vezes utilizando a levedura Sacharomyces cerevisiae. O mesmo autor também observou que os melhores resultados para obtenção de proteína bruta e enriquecimento proteico foi no tempo de 8 h fermentação em bandejas e 4 h para fermentação em tambores rotativos. Holanda et. al. (1996) estudaram o enriquecimento proteico de pendúculo de caju com a levedura Saccharomyces cerevisiae para alimentação animal e observou que a proporção de 10% de levedura na biomassa do pendúculo do caju proporciona 28 um teor proteico acima de 20% do material fermentado, o mesmo autor conclui que o tempo de fermentação necessário para conversão proteica dos carboidratos do pedúnculo de caju é inferior a 24 h. Oliveira (2007) trabalhou com o enriquecimento nutricional por bioconversão de resíduos agroindustriais para utilização na alimentação animal e observou que os melhores valores da concentração de proteína bruta para os resíduos foram no tempo de 48 h utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Em seu trabalho Coelho et. al., (2001), realizou o enriquecimento proteico do bagaço de pedúnculo de caju utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae como alternativa para a produção de ração animal, onde este observou a cinética do processo, avaliando a concentração inicial do microrganismo, temperatura de cultivo, assim como o tempo de armazenamento do produto final sobre o teor de proteínas. Neste estudo foi alcançado um aumento proteico máximo de 3,0 vezes correspondendo a um teor de 20,3% de proteína bruta na matéria seca. A fermentação semi-sólida com a levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando o bagaço do fruto de palma demonstrou que microrganismo cresceu e aumentou em 1, 46 vezes o teor de proteína do bagaço se comparado com o bagaço in natura (AMORIM et. al., 2005). O trabalho de Araújo et. al., (2003), teve como objetivo estudar o enriquecimento proteico do mandacaru sem espinhos (Cereus jamacaru P.DC) utilizando também a levedura Saccharomyces cerevisiae por fermentação semi- sólida. Em relação aos resultados deste estudo, os teores de proteína bruta obtidos nas condições em que foram conduzidos os experimentos, pode-se concluir que o processo de enriquecimento proteico do mandacaru sem espinhos, influenciou os elevados valores do teor proteico de 7,24% na forma in natura para valores entre 37,8% e 24,78%. Valores compatíveis e superiores aos encontrados nos concentrados proteicos convencionais (ARAÚJO et. al., 2003). 29 4 MATERIAIS E MÉTODOS O experimento realizado neste trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Entomologia Vegetal e Laboratório de Tecnologia de Grãos e Cereais do Centro de Ciências e Tecnologia Agroindustrial da Universidade
Compartilhar