Toxocaríase: Diagnóstico e Tratamento

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SUMÁRIO 
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... 9 
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... 11 
ABSTRACT ............................................................................................................................ 13 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14 
1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico .............................................................................................. 14 
1.2 Epidemiologia e Fatores de risco ................................................................................................ 18 
1.3 Manifestações clínicas................................................................................................................. 20 
1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase .............................................................................................. 21 
1.5 Diagnóstico .................................................................................................................................. 22 
1.6 Tratamento e controle ................................................................................................................ 26 
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 27 
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 28 
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................. 28 
3.2 Objetivos Específicos ................................................................................................................... 28 
4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 29 
4.1 Aspectos éticos ............................................................................................................................ 29 
4.2 Soroteca de camundongos .......................................................................................................... 29 
4.3 Sorotecas de humanos ................................................................................................................ 30 
4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares de 
célula B específicos de T. canis e sua síntese. ................................................................................... 30 
4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 .................................................................................................... 32 
4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) .......................................................................... 32 
4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados .............................. 33 
4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1 e rTC-
CTL-2 .............................................................................................................................................. 34 
 
8 
 
4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-
CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 34 
4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-
CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 35 
4.7 Análise Estatística ........................................................................................................................ 36 
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 37 
5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos .............................. 37 
5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas recombinantes rTC-
CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 46 
5.3 Resultados do ELISA anti-IgG, -IgA, -IgG1 e -IgG4 de humanos com lectinas recombinantes rTC-
CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 48 
6. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 55 
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 62 
8. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 63 
9. ANEXOS ............................................................................................................................. 72 
 
 
 
 
 
 
9 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis ....................................................................... 14 
Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis. .......................................................... 16 
Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. ................................................................................... 17 
Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis ............................................................................... 17 
Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina Toxocara canis) com soros de 
camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 38 
Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293)) com 
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-
IgG. ........................................................................................................................................... 39 
Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio Toxocara canis) 
com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA 
anti-IgG. .................................................................................................................................... 40 
Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32 
Toxocara canis) com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em 
experimento de ELISA anti-IgG............................................................................................... 41 
Figura 9: Reatividade do peptídeo 5 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com 
soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-
IgG. ........................................................................................................................................... 42 
Figura 10: Reatividade do peptídeo 6 (KSDPDPKK: miosina Toxocara canis) com soros de 
camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 43 
Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros de 
camundongos infectados por diferentes helmintoses. .............................................................. 44 
Figura 12: Reatividade da lectina TC-CTL-1 com soros de camundongos infectados com 
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ...................................................... 46 
Figura 13: Reatividade da lectina TC-CTL-2 com soros de camundongos infectados com 
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ......................................................47 
Figura 14: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como 
antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. ..................... 48 
Figura 15: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de 
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ............. 49 
 
10 
 
Figura 16: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como 
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 50 
Figura 17: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de 
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgA. ............. 51 
Figura 18: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgA utilizando as lectinas recombinantes como 
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 52 
Figura 19: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de 
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG4. ........... 53 
Figura 20: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG4 utilizando as lectinas recombinantes como 
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 54 
 
 
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LISTA DE ABREVIATURAS 
rTC-CTL-1: (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -1. 
rTC-CTL-2: : (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -2. 
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. 
ICB: Instituto de Ciências Biológicas. 
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais. 
L3: Larva estágio 3. 
ROC: Receiver Operator Curve. 
cDNA: Ácido Desoxirribonucleico complementar. 
DECIT: Departamento de Ciência e Tecnologia. 
TES: Antígeno de excreção/secreção de larvas de Toxocara. 
PCR: Reação em cadeia da polimerase. 
 
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RESUMO 
A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos 
embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, e em especial de Toxocara canis. No cão, é 
uma parasitose intestinal crônica com distribuição mundial, com maiores prevalências em 
países em desenvolvimento e de clima tropical. Nos seres humanos, Toxocara não completa 
seu ciclo biológico, ocasionando em um quadro de larva migrans. O diagnóstico clínico da 
toxocaríase humana é difícil devido à sintomatologia inespecífica e o diagnóstico laboratorial 
geralmente é realizado por testes sorológicos indiretos e comercializado em kits (ELISA 
NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Além disso, existe uma alta reação cruzada 
com outras helmintoses e ao poliparasitismo em geral, diminuindo ainda mais a eficácia do 
diagnóstico da toxocaríase. Devido a estes problemas, este estudo tem como objetivo avaliar o 
desempenho de novos antígenos recombinantes e peptídeos de T. canis para o diagnóstico 
sorológico da toxocaríase humana. Para predição de epitopos lineares para linfócitos B, o 
programa BEPIPRED 1.0 foi usado e seis peptídeos sintetizados foram testados. Além disso, 
duas sequências imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) do antígeno excretado e 
secretado de T. canis foram selecionadas por screening em um banco de cDNA de larvas 
deste helminto. Estas foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) e purificadas. Em 
ensaios de ELISA, os peptídeos e as lectinas recombinates foram testados com soros de 
camundongos (como pré-seleção para as mais promissoras) e humanos infectados por 
diferentes helmintoses, para verificar o reconhecimento específico dos antígenos de T. canis. 
Cálculos sobre especificidade e sensitividade de cada antígeno testado foram feitos, utilizando 
análises das curvas ROC (Receiver Operator Curve) de cada ensaio. As lectinas do tipo C 
recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 obtiveram 100% de sensibilidade e 100% de 
especificidade no ensaio de ELISA anti-IgG com soros de camundongos. Porém, ao serem 
testadas com soros humanos, observou-se uma alta reatividade cruzada com outras infecções 
helmínticas, com melhor desempenho para rTC-CTL-1 em anticorpos anti-IgA e anti-IgG4, 
com sensitividade de 72% e 96% e especificidade de 88.24% e 78.43%, respectivamente. Dos 
6 peptídeos testados em ELISA anti-IgG com soros de camundongos, os peptídeos 1, 2 e 4 
apresentaram 100% de sensitividade, e uma média de 58% de especificidade, obtendo grande 
reatividade cruzada com a infecção por A. suum. Sugerimos novos testes com epítopos e 
antígenos recombinantes modificados, para melhorar o desempenho para um diagnóstico mais 
específico da toxocaríase humana. 
 
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ABSTRACT 
 Toxocariasis is a zoonosis that affects humans by the accidential infection of 
embryonated eggs of the nematode genus Toxocara and especially from T. canis. In the dog, 
it causes chronic intestinal infection. Toxocara has a worldwide distribution with elevated 
prevalences in underdeveloped countries and regions with tropical climate. In humans, the 
parasite does not complete its life cycle, which causes a clinical picture of larva migrans. The 
clinical diagnosis of human toxocariasis is difficult due to its unspecific symptoms and 
diagnosis generally relies on indirect serological tests, which are commercially available 
(ELISA NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Furthermore, there is a high cross-
reactivity with other helminths and polyparasitism in general, further decreasing the 
efficiency of diagnosis of toxocariasis. For prediction linear epitopes for B-lymphocytes , the 
BEPIPRED 1.0 was used and six synthesized peptides were tested . In addition, two 
immunodominant sequences (rTC- CTL-1 and rTC-CT -2) secreted antigen and secreted T. 
canis were selected for screening in a cDNA library larvae of the helminth. These were 
subcloned, expressed in BL21 (DE3) cells and purified. In ELISA assays , the peptides and 
lectins recombinates were tested in mice sera ( pre - selection as the most promising ) and 
humans infected by different helminthiasis , to verify the specific recognition of antigens T. 
canis. In each assay, sensitivity and specificity was calculated by performing a ROC 
(Receiver Operator Curve) analysis. The anti-IgG ELISA with mouse sera revealed 100% of 
sensitivity and specificity for the tested recombinant lectins. However, when tested with 
human serum samples, a high cross-reactivity with other helminth infections resulted. The 
best performance was achieved in anti-IgA and anti-IgG4 assays against rTC-CTL-1, 
resulting in a sensitivity of 72,0% and 96,0% and specificity of 88,2% and 78,4%, 
respectively. Out of the six peptides tested with mouse sera in anti-IgG ELISAs, peptides 
number 1, 2 and 4 presented with a 100% sensitivity, but only a mean specificity o 58,0%. 
Especially sera from mice infected with A. suum showed strong cross-reactivity. In order to 
further improve the specific diagnosis of human toxocariasis, we suggest additional studies 
with new and/or modified peptides or recombinant antigens. 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos 
embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, especialmente Toxocara canis, cujo 
hospedeiro definitivo é o cão (Barriga, 1991). Dentre as diferentes espécies, vale destacar o 
Toxocara cati, que parasita gatos e o Toxocara vitulorum (parasito de ruminantes) que 
possuem grande importância para a saúde pública (Rubinsky-Elefant et al., 2010). A 
toxocaríase é uma parasitose crônica com distribuição mundial de maior prevalência em 
países em desenvolvimento e de clima tropical. No entanto, a prevalência desta doença e seu 
impacto na saúde pública são subestimados, mesmo em países desenvolvidos (Torgeson e 
Budke 2006). 
 1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico 
O Toxocara é um nematódeo de grande importância para a saúde humana e animal. Ele 
pertence ao filo Nemathelmintes, classe Nematoda, ordem Ascaroidea, família Ascaridae e 
subfamíliaAscarinae, sendo que o macho possui aproximadamente 4 a 10 centímetros, e a 
fêmea entre 6 a 18 centímetros de comprimento (Figura 1), cujo hospedeiro definitivo é o cão 
(Foreyt 2005). 
 
Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis 
 
O cão se infecta ao ingerir ovos embrionados de T. canis contendo larvas do terceiro 
estágio (Schnieder et al., 2011). Os ovos ingeridos pelo cão sofrem ação do suco gástrico e as 
larvas eclodem no intestino delgado, atravessa a parede intestinal, seguindo pela veia porta ou 
 
15 
 
vasos linfáticos até o fígado, coração e então para os pulmões. Nos pulmões, as larvas 
rompem os bronquíolos, alcançando a traquéia, quando são deglutidas e retornam ao intestino 
delgado, onde se desenvolvem até a sua forma adulta. Após cerca de 4 a 5 semanas da 
ingestão dos ovos, as fêmeas adultas de T. canis são capazes de produzir diariamente até 
200.000 ovos, que serão eliminados juntamente com as fezes dos animais, tornando-se 
infectante em duas a cinco semanas, sob condições ambientais adequadas de temperatura e 
umidade (Schantz, 1989). A segunda rota de migração é a somática. Neste caso, quando as 
larvas chegam aos pulmões há o retorno das mesmas para o coração, pelas veias pulmonares, 
e assim sua migração é facilitada para qualquer parte do organismo seguindo a circulação 
sanguínea. As larvas ainda podem passar por um estágio de hipobiose em tecidos ou órgãos 
como fígado, rins, olhos e cérebro (Barriga 1988). 
A idade do hospedeiro definitivo é determinante para o tipo de migração. Filhotes com 
menos de cinco meses ainda não possuem resposta imunológica eficiente. Por isso, nesses 
animais, as larvas migram pela via hepato-traqueal, retornando ao intestino delgado, onde 
evoluem para as formas adultas. Aos seis meses, os cães montam uma resposta imunológica 
adquirida contra o parasito. Dessa forma, as larvas que passam pelos pulmões retornam ao 
coração, evadindo para os tecidos, onde permanecem em estado de hipobiose (Glickman et 
al., 1978). 
Os cães podem adquirir a infecção de outras maneiras que não a ingestão de ovos: a 
migração transplacentária ocorre quando a cadela gestante possui larvas em hipobiose nos 
tecidos, que são ativadas, provavelmente por alterações hormonais no terço final de gestação, 
e alcançam o fígado dos fetos pela placenta. Os filhotes nascem com as larvas nos pulmões e, 
a partir da segunda semana de vida, os parasitos adultos são aptos a produzir ovos. Além 
dessa via, as larvas podem alcançar as glândulas mamárias e serem transmitidas pela via 
lactogênica, desde a ingestão do colostro até 45 dias da lactação, com pico máximo de 
eliminação na segunda semana. Nesse caso, a presença de ovos nas fezes dos filhotes se dá 
duas semanas após a ingestão da larva pelo leite (Barriga, 1988). 
As cadelas em puerpério são capazes de se infectar pela ingestão de parasitos adultos 
contidos em vômitos e ovos nas fezes dos filhotes, durante a higienização da ninhada. Os cães 
também podem ingerir as larvas infectantes em hipobiose dos tecidos de hospedeiros 
paratênicos, como roedores e aves. Nestes animais, após a ingestão dos ovos embrionados, 
 
16 
 
ocorre migração somática e as larvas permanecem em hipobiose sem concluir o ciclo 
(Magnaval et al., 2001). 
Uma vez expelidos, os ovos de T. canis (Figura 2) necessitam cerca de duas a seis 
semanas sob condições favoráveis de temperatura (10-30ºC) e humidade para completar o 
embrionamento e transformarem em larvas L3, da qual é o estágio da larva infectante para a 
infecção. O aumento da temperatura pode acelerar o desenvolvimento dos ovos enquanto que 
temperaturas abaixo de 10ºC e acima de 30ºC são hostis à maturação e sobrevivência destes. 
Os ovos são muito resistentes e sobrevivem bem sobre a maioria dos invernos e climas 
temperados, sobrevivendo por seis a doze meses. Alguns ovos podem ser capazes de 
sobreviver em local fresco e úmido por dois a quatro anos ou mais (Gamboa 2005). 
Nos seres humanos, que se comportam como hospedeiros paratênicos, a infecção por 
Toxocara spp. é ocasionada pela ingestão de ovos embrionados deste nematódeo. A ingestão 
de carne crua também tem sido apontada como fator de risco para aquisição de toxocaríase. 
Estudos observaram que em adultos a prevalência foi de 7,8 vezes maior em pacientes com 
histórico de ingestão de carne crua em relação àqueles que não possuíam esse hábito 
(Morimatsu et al., 2006). 
 
 
Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis. 
 
 
17 
 
 
Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. Fonte: www.cdc.gov 
 
Ao serem ingeridos pelo homem, as larvas de T. canis (Figura 3) eclodem e 
atravessam a parede do intestino delgado e ganham a circulação pela via hepática, migrando 
por diversos órgãos como fígado, pulmão, coração e cérebro. Essa doença foi inicialmente 
denominada de larva migrans visceral. Posteriormente, os casos com comprometimento 
oftálmico receberam a denominação de larva migrans ocular, e atualmente essas síndromes 
causadas por larvas de Toxocara spp. são conhecidas como toxocaríase visceral (TV) e 
toxocaríase ocular (TO) (Magnaval et al., 2001). 
 
 
Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis. 
 Fonte: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Toxocariasis.htm 
 
 
http://www.cdc.gov/dpdx/toxocariasis/gallery.html
 
18 
 
 1.2 Epidemiologia e Fatores de risco 
A toxocaríase é uma zoonose de ampla distribuição mundial e possui uma grande 
importância na saúde pública, visto que possui hospedeiros definitivos domésticos como cães 
e gatos, e também hospedeiros selvagens como, por exemplo, raposas (Glickman et al., 1978). 
O toxocara canis é um dos mais importantes helmintos gastrointestinais em cães, com 
relatos de infecções de todas as partes do mundo. Estudos apontam que alguns países como 
Nigéria, China e Itália possuem cerca de 50, 45 e 33% de cães positivos para este helminto. 
No Brasil, os valores de positividade atingem de 45% até 99% em filhotes de cães 
(Sowemimo, 2007; Dai et al., 2009; Habluetzel et al., 2003; Chieffi e Muller, 1976; Barriga 
1988). 
 Esta zoonose é particularmente prevalente nos trópicos e sub-trópicos, em países menos 
industrializados, onde o tratamento de cães e controle populacional é limitado. A infecção por 
T. canis é uma importante causa de morbidade também em países ricos e industrializados, 
especialmente em crianças e nas populações socioeconomicamente desfavorecidas (Torgerson 
e Budke, 2006). 
Outras espécies de Toxocara contribuem para a carga global de toxocaríase, mas sua 
importância é bem menos entendida e definida, porém é importante lembrar que o T. cati 
possui semelhante distribuição global como T. canis, e sua importância não pode ser ignorada. 
Outras espécies como T. malaysiensis, que ocorre em gatos na Malásia e China, T. vitulorum, 
que ocorre em ruminante, T. pteropodis (morcegos), e T. leonina, que ocorre em cães, gatos e 
outros caninos e felinos, possuem certo potencial para causarem zoonose, porém sua 
importância é muito mais limitada (Morgan, 2013). 
Muitos fatores biológicos inerentes ao ciclo de vida do parasito contribuem para a 
perpetuação dessa espécie. Entre esses, incluem-se as inúmeras vantagens da transmissão 
vertical no hospedeiro definitivo jovem, garantido o início precoce da produção de ovos de 
vermes adultos nestes. Além disso, a alta fecundidade, a sobrevivência prolongada de ovos no 
ambiente, e a alta diversidade de hospedeiros definitivos e paratênicos, também são 
fundamentais para o sucesso da espécie, resultando o Toxocara como um dos parasitos mais 
difundidos e causando uma das zoonoses predominante em todo o mundo (Mcpherson, 2013). 
 
19 
 
A prevalência global de Toxocara spp. em seres humanos é influenciada por um grande e 
complexo número de variáveis que estão ligados ao nível de desenvolvimento populacional, 
geográfica, cultural e socioeconômico do local. Além disso, deve-seconsiderar também o 
nível de heterogeneidade de susceptibilidade genética individual à infecção relacionado à 
imunidade, co-infecção, genética, idade, sexo, nutrição e comportamento dos hospedeiros 
definitivos e paratênicos como os cães e humanos (Viney e Graham, 2013). 
Esses fatores, juntamente com o aumento da população humana e o alto índice de 
migração global da população rural para a urbana (mais de 50% da população mundial agora 
reside em áreas urbanas), aumentam ainda mais a interação entre os hospedeiros definitivos e 
o homem, sugerindo que no mundo inteiro a importância da toxocaríase na saúde pública seja 
cada vez maior (Macpherson, 2013). Entretanto, os fatores de risco para a transmissão da 
doença variam consideravelmente em diferentes partes do mundo: a pobreza, a baixa 
educação e problemas com descontrole e falta de tratamento dos hospedeiros definitivos 
levará a ambientes altamente contaminados que em climas quentes e condições favoráveis irá 
proporcionar oportunidade de transmissão ideal, principalmente se associada à falta de 
higiene. Esses fatores de risco são observados em muitas partes do mundo (Dunsmore et al., 
1984). 
Crianças, devido ao seu comportamento e seu contato próximo com animais domésticos, 
principalmente cães, possuem mais contato com terra, colocam objetos em suas bocas e 
associados à falta de higiene possuem um maior risco para contrair a doença. Em muitas 
cidades, ambientes públicos como parques e playgrounds representam áreas de grande risco 
para exposição humana aos ovos (Deplazes et al., 2011). 
Estudos epidemiológicos na América Latina indicaram alta exposição de crianças por 
Toxocara, resultando em uma prevalência de 28.8 a 62.3%. Áreas rurais, onde pessoas 
possuem maior contato com solo e animais, tendem a uma maior prevalência, cerca de 35 a 
42%, enquanto áreas semi-rurais possuem cerca de 15 a 20% e áreas urbanas por volta de 2 a 
5%, principalmente em parques e playgrounds (Magnaval et al., 2001; Mendonca et al., 2012; 
Maraghi et al., 2014). Em países industrializados, estudos sorológicos conduzidos em sua 
maioria em crianças, apontam que a prevalência da toxocaríase varia de 0,7% na Nova 
Zelândia, 1,6% no Japão, 2,4% na Dinamarca, 7,5% na Austrália, 14% nos Estados Unidos e 
15% na Polônia (Fan et al., 2013). Em contrapartida, maior soroprevalência foi constatada em 
 
20 
 
países menos industrializados e tropicais como na África: 30% na Nigéria, 45% na 
Suazilândia e 93% em La Reunion (África), 81% no Nepal, 63,2% na Indonésia e 58% na 
Malásia (Ásia) e 36% no Brasil e 37% no Peru (América Do Sul) (Macpherson, 2013). 
A alta soroprevalência de Toxocara reportada (14%) nos Estados Unidos, estima que 
cerca de 1,3 a 2,8 milhões de pessoas possuem a infecção. Isso é um exemplo de que mesmo 
em países ricos, a toxocaríase é uma zoonose de grande importância na sociedade, e junto 
com outras helmintoses, são consideradas doenças negligenciadas e que não afetam somente 
populações empobrecidas (Hotez, 2008). 
 
 1.3 Manifestações clínicas 
No cão, os sinais da toxocaríase incluem diarreia, flatulência, distensão abdominal, 
desidratação e atraso no desenvolvimento. A passagem das larvas pelos pulmões pode resultar 
em tosse e quadro de pneumonia. Em migrações aberrantes, a migração larval pode ocasionar 
alterações como celulite orbital e em infecções massivas, a morte do animal. A eosinofilia é 
considerada a principal alteração hematológica na toxocaríase canina (Santarém et al., 2009). 
Os sintomas clínicos da toxocaríase humana são causados pela migração da L3 de 
Toxocara spp. através da corrente sanguínea para o interior de órgãos, incluindo músculo, 
fígado, cérebro e olho. Essas migrações podem ser assintomáticas ou pode conduzir uma 
ampla variedade de sintomas, dependendo do órgão invadido, a duração da migração, 
intensidade da infecção, idade e resposta imunológica do hospedeiro (Despommier, 2003). A 
sobrevivência de longo prazo das larvas de T. canis foi atribuída a duas estratégias 
moleculares evoluídas pelo parasito: a larva libera substâncias de excreção-secreção que 
incluem lectinas, mucinas e enzimas que interagem e modulam a imunidade do hospedeiro, e 
secundariamente, a larva produz uma mucina de revestimento de superfície frouxamente 
ligada na epicutícula do parasito. Esse revestimento permite o parasito escapar quando os 
anticorpos e as células do hospedeiro aderem no mesmo, porém, esse processo resulta em uma 
reação inflamatória em torno do local recém-desocupado (Maizels, 2013). 
Em seres humanos a toxocaríase raramente é fatal, mas as respostas inflamatórias devido à 
migração das larvas geralmente são associadas com linfadenopatia generalizada, hepatite 
 
21 
 
granulomatosa, endomiocardite, endoftalmite, asma e leucocitose, incluindo alta eosinofilia. 
Muitos pacientes possuem hipergamaglobulinemia de IgG e IgE, manifestações cutâneas, e 
raramente, meningoencefalite pode ocorrer. As infecções são geralmente autolimitadas e as 
larvas ficam encapsuladas na musculatura e no fígado, e assim os sintomas desaparecem. As 
síndromes da infecção por Toxocara spp. são relacionadas com a migração das larvas e da 
resposta imune do hospedeiro em relação a isso (Despommier, 2003). 
A toxocaríase humana possui duas classificações, que foram definidas originariamente: a 
toxocaríase visceral e toxocaríase ocular. O entendimento da variedade clínica e dos sinais e 
sintomas da toxocaríase evoluíram ao longo dos últimos 30 anos, e com a introdução de testes 
de diagnósticos melhorados e de triagem soroepidemiológico, há uma maior compreensão da 
base molecular e imunológica da evasão. Com isso, síndromes adicionais principais têm sido 
descritas, como a toxocaríase comum ou disseminada, e a neurotoxocaríase (Fan et al., 2013; 
Taylor et al., 1988; Smith et al., 2009). 
 
1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase 
A toxocaríase visceral é a mais comum diagnosticada em crianças menores que oito anos 
de idade, e está associada com a alta intensidade ou repetidas infecções larvais por T. canis, 
das quais podem persistir por semanas ou meses. Os sintomas clássicos incluem febre, 
hepatoesplenomegalia, dor abdominal, vômitos, diarreia, sintomas respiratórios como tosse e 
chiados, asma, anorexia, perda de peso, fatiga, manifestações neurológicas, palidez e 
ocasionalmente, urticária (Despommier, 2003). 
A toxocaríase ocular é considerada rara em comparação a toxocaríase visceral, e acredita-
se que é resultado de uma baixa intensidade de infecção por T. canis, e também é mais 
frequente em crianças. Casos de TO são normalmente unioculares e são causados pela 
migração da L3 para o olho e resultante da reação imunológica neste. A deficiência visual 
ocorre ao longo de dias ou semanas, e o nível de prejuízo depende da localização da larva. 
Tardiamente, uma eosinofilia e um granuloma fibroso podem criar uma distorção e até mesmo 
um descolamento da mácula, o que pode resultar em cegueira. Os impactos visuais dependem 
da área específica envolvida. A toxocaríase ocular pode causar endoftalmite difusa ou papilite 
(inflamação da extremidade do nervo óptico que entra no olho). Infecções em longo prazo por 
 
22 
 
Toxocara spp. podem levar até mesmo a uma corioretinite da membrana neovascular coroidal 
(Despommier, 2003; CDC, 2011). 
A toxocaríase comum ou disseminada é caracterizada pelo quadro de sintomas não 
específicos da doença, sintomas leves ou assintomáticos. Inquéritos soroepidemiológicos 
muitas vezes detectam anticorpos específicos anti-Toxocara em pessoas, porém o quadro 
clínico não é claro, ou até mesmo é assintomático. Esses achados são caracterizados como a 
toxocaríase comum e são as mais comuns, ou seja, a maioria das infecções por Toxocara 
comportam desta maneira, principalmente em adultos saudáveis, o que de certa maneira 
contribui para negligência e subnotificação da doença (Tayloret al., 1988). 
A neurotoxocaríase, uma outra possível síndrome decorrente da infecção, surge a partir da 
invasão de L3 de Toxocara no cérebro e cordão espinhal, causando meningite, encefalite, 
mielite, vasculite cerebral e convulsões (Ruttinger et al., 1991). 
 
1.5 Diagnóstico 
O diagnóstico da toxocaríase humana pode ser realizado por meio direto e indireto 
(exames sorológicos). O exame direto por meio de microscópio (exame histopatológico) de 
Toxocara spp. em seres humanos é difícil e raramente feito, pois consiste na procura de larvas 
no tecido por meio de biópsia. Além disso, as biópsias realizadas em tecidos humanos permite 
a identificação do helminto por meio de PCR baseada em sequências ITS-1 e ITS-2 de rDNA 
nuclear, porém este procedimento também raramente é feito e geralmente é realizado em 
casos extremos da doença (Jacobs et al., 1997). 
O imunodiagnóstico, que é um meio indireto de diagnóstico, é realizado por meio de 
exames sorológicos que, na maioria dos testes, detectam anticoporpos circulantes no soro de 
pacientes com alguma possível infecção por algum patógeno. Estes anticorpos, que são 
denominados como imunoglobulinas, podem ser usados para revelar diagnóstico de várias 
doenças (Abbas, 2013). 
 
 
23 
 
As imunoglobulinas constituem um grupo de glicoproteínas presentes no soro e fluidos 
teciduais de todos os mamíferos e podem estar presentes na superfície celular onde funcionam 
como receptores, ou também podem estar livres no sangue ou na linfa funcionando como 
anticorpos. Quando a célula B entra em contato com o antígeno ela é ativada e é capaz de 
liberar anticorpos, que passam a ser chamadas de plasmócitos. No ser humano existem cinco 
classes de imunoglobulinas designadas como IgG, IgE, IgD, IgM e IgA. 
O uso de subclasses de IgG em ensaios sorológicos podem ainda aumentar a 
especificidade dos testes diagnósticos. Cada subclasse de IgG possui uma diferença biológica 
e físico-químicas, e portanto, podem ser preferencialmente produzidas em resposta a 
diferentes antígenos e condições patológicas (Watthanakulpanich et. al., 2008). 
A IgA é a segunda imunoglobulina mais abundante no sangue. Ela é a predominante nas 
secreções dos tratos gastrointestinal e respiratório, como também no colostro e leite humanos. 
A IgA promove imunidade mucosa local contra vírus e parasitos e limita o crescimento 
bacteriano nas superfícies mucosas. A IgA também funciona no trato gastrointestinal e mostra 
uma resistência maior a enzimas proteolítica que outras classes de anticorpos (Abbas, 2013). 
Na toxocaríase, esta possui grande importância devido a migração das larvas e estimulação da 
ativação destes anticorpos pelas mucosas (Elefant et al., 2006). 
O IgE embora presente em quantidades ínfimas no soro, é encontrada nas membranas 
superficiais dos mastócitos e basófilos, possuindo peso molecular de 188.000. Ela é capaz de 
sensibilizar as células nas superfícies das mucosas e ainda possui papel importante contra 
helmintos, estando também associada a reações alérgicas (Abbas, 2013). Estas são 
importantes na patologia da toxocaríase, que é caracterizada pela reação alérgica da migração 
das larvas no homem, porém, será mais abundante na fase aguda da doença (Elefant et al., 
2006). 
Em geral, o diagnóstico da toxocaríase possui vários problemas, especialmente em países 
tropicais, onde o poliparasitismo é comum. O diagnóstico é feito com base na apresentação 
clínica, anamnese do paciente, e principalmente pelo teste sorológico de ELISA (Enzyme 
Linked Immuno Sorbent Assay), utilizando antígeno de excreção/secreção de larvas de 
Toxocara (TES) comercializado em kits (ELISA NOVUM®, ELISA PU® and Toxocara 
CHEK®) disponíveis e amplamente utilizados para diagnósticos e estudos sorológicos. 
 
24 
 
Porém, a diferença na qualidade dos antígenos utilizados e a falta de padronização de 
resultados, juntamente com as diferenças populacionais de exposição ao poliparasitismo e 
outros patógenos, reatividade cruzada, alimentação e condições sócio econômicas, dificultam 
e tornam cada vez mais difícil o diagnóstico correto e a comparação de resultados e pesquisa 
(Smith e Noordin, 2006). 
O antígeno TES é um grupo de glicoproteínas secretadas pelo resultado do metabolismo 
da larva do parasito durante seu desenvolvimento. Ele consiste em uma diversidade de 
proteínas entre 30 a 400 kDa juntamente com grandes quantidades de carboidratos. Esta 
mistura de substâncias e antígenos é altamente imunogênico durante a infecção, por isso é o 
alvo principal de estudos envolvendo diagnóstico (Badley et al., 1987). 
Durante o passar dos anos, vários estudos sobre o TES vem sendo realizado usando 
técnicas de biologia molecular para classificar mais precisamente os componentes deste 
antígeno. Com isso, uma combinação de sequências de peptídeos, anticorpos monoclonais e 
técnicas de DNAs recombinantes, caracterizaram três conjuntos de proteínas e glicoproteínas 
do antígeno TES, nomeados como: TES-26, TES-32/70 e TES-120. Dos quais possuem 
grande importância na reação parasito-hospedeiro na toxocaríase (Maizels, 2013). 
O uso de antígenos TES do parasita resultou num aumento da sensibilidade e 
especificidade dos testes comerciais citados, porém como ainda existe uma reatividade 
cruzada com antígenos de outras helmintoses, este teste deve ser usado com muito critério 
para evitar resultados falsos positivos quando aplicado em áreas endêmicas (Turrientes et al., 
2011). Mesmo usando subclasses de IgG (Watthanakulpanich et al., 2008) ou antígenos 
recombinantes do parasita (Mohamad et al., 2009), o problema da reatividade cruzada com 
antígenos de outras helmintoses ainda continua. O poliparasitismo, principalmente por 
helmintos gastrointestinais, podem reduzir a especificidade em cerca de 50% nos testes de 
ELISA na detecção de anticorpos IgG e suas subclasses (Watthanakulpanich, 2008). 
Devido ao problema da reatividade, soros de pacientes que forem positivos para Toxocara 
spp. em testes de ELISA, devem ser confirmados por „western blotting‟ (WB) baseado no 
reconhecimento de antígenos TES fracionados e nativos de larvas de T. canis, das quais vêm 
demonstrando um aumento significante da especificidade da reatividade de bandas de baixo 
 
25 
 
peso molecular (24-32 kDa), anteriormente propostas como específicas deste helminto (Smith 
et al., 2009). 
Além dos antígenos providos diretamente dos parasitas, a bioinformática proporciona 
informações sobre genomas, transcriptomas e proteomas que podem ser usadas para buscar 
sequencias específicas em bancos de dados, resultando na previsão de candidatos para novas 
vacinas, predição de antígenos/epítopos para diagnóstico ou de novas drogas (Albubacker et 
al., 2011; Pinheiro et al., 2011). 
Mais recentemente um novo banco de dados, HelmCoP, foi criado para helmintos que 
já contem informações sobre várias espécies de helmintos e com a expectativa de incluir 
genomas de mais 20 espécies em breve (Abubucker et al., 2011). Outro banco de dados, 
Nematode.net, já contem informações sobre sequencias de ESTs/cDNA de 30 espécies de 
nematódeos parasíticos (Martin et al., 2009). No caso do T. canis ainda não existe o genoma 
completo disponível nos bancos de dados, porém, dispomos de publicação de sequencias 
expressas deste, o que permite na utilização dessas técnicas de bioinformática para a predição 
de epítopos específicos para diagnóstico (Zhou et al., 2011). 
Em outra via do diagnóstico, as técnicas de imagem podem ser úteis para auxiliar este em 
pacientes com toxocaríase. No caso da visceral, com um quadro mail definido, lesões 
hepáticas ovais com cerca de 1.0 a 1.5 cm de diâmetro, características deste tipo de infecção, 
podem ser detectadas em tomografia computadorizada, ressonância magnética e 
ultrassonografia, ajudando na confirmação do diagnóstico. As lesões de Toxocara spp. são 
diferentes de nódulos metastáticos poisestes tem margens difusas, tamanhos uniformes e 
formas não esféricas (Lim, 2008). 
Em relação aos diferentes tipos da doença, o diagnóstico da neurotoxocaríase também é 
complicado e inclui os exames sorológicos para detectar a presença de anticorpos anti-
Toxocara, porém estes podem estar baixos ou até mesmo ausentes. Portanto a realização de 
tomografia computadorizada e outros exames de imagens para possível visualização da larva 
são cruciais para o diagnóstico correto (Finsterer e Auer, 2007). Nessa mesma linha, o 
diagnóstico da TO também é complicado devido à ausência ou baixa presença de anticorpos 
sanguíneos, e comparado a NT, difere-se apenas pelas técnicas de imagens que são 
oftalmológicas, como a tomografia de coerência óptica (Arevalo et al., 2013). 
 
26 
 
 
 1.6 Tratamento e controle 
O tratamento quimioterápico em pacientes com toxocaríase varia de acordo com a 
severidade e a localização dos sintomas. Pacientes com sintomas de toxocaríase visceral e 
neurotoxocaríase são administrados anti-helmínticos como Albendazol, Tiabendazol e 
Mebendazol juntamente com anti-inflamatórios corticoides para aliviar os sintomas causados 
pela severa resposta inflamatória do sistema imune. No caso da toxocaríase ocular, o 
tratamento é realizado com corticoides e procedimentos oftalmológicos delicados para 
retirada da larva (Despommier, 2003; Magnaval e Glickman, 2006). 
A grande variedade doméstica e selvagem de hospedeiros definitivos e paratênicos assim 
como suas formas de transmissão de Toxocara spp. tornam o controle deste helminto 
complicado. Dentro dos principais reservatórios e vias de transmissão do parasito como a 
infecção intestinal do hospedeiro definitivo, ovos no ambiente, larvas nos hospedeiros 
paratênicos e larvas somáticas nos hospedeiros, a população de mais fácil controle da 
toxocaríase são os animais de estimação como os gatos e os cães (Schnieder, 2001). Existem 
excelentes tratamentos para estes animais, e se estes forem feitos de forma correta, ocorre 
uma considerável redução da contaminação ambiental por estes reservatórios do toxocara 
(Palmer et al., 2010). 
A educação da população também exerce importante papel para o controle deste helminto, 
pois é fundamental para a redução da infecção humana. Os veterinários desempenham um 
importante papel na educação dos donos dos animais domésticos, orientando quanto ao perigo 
da zoonose, e alertando principalmente os pais das crianças e elas mesmas, para uma boa 
educação higiênica ao se envolver com os animais (Palmer et al., 2010). 
Outra medida crucial para a redução de Toxocara canis. no ambiente, é o controle do 
número de cães errantes principalmente nas cidades onde as áreas de lazer são compartilhados 
com estes animais por muitas pessoas e crianças. Esta medida foi alcançada em certo ponto 
pela América do Norte, Europa e Austrália em cerca de 30 anos atrás, mostrando que é 
possível tal medida (Beck, 1979). 
 
27 
 
Um costume importante educacional por parte dos donos, e que também contribui para a 
diminuição da zoonose, é a coleta das fezes realizadas por seu cão em áreas públicas. Isto 
pode permitir que as pessoas e os cães possam compartilhar áreas públicas com seus donos 
nas grandes cidades. Restringir os cães em playgrounds, parques e jardins pode ser a medida 
mais efetiva de controle, porém mais difícil de ser implantada além de causar transtornos nos 
donos que podem fazer questão da companhia de seus animais de estimação (Kirchheimer e 
Jacobs, 2008). 
Uma boa higiene e o cozimento adequado dos alimentos pode impedir a ingestão acidental 
de ovos encontrados no ambiente pelos homens. Infelizmente tais medidas de higiene, a 
princípio são simples e fáceis de serem implementadas, porém na prática não é dessa forma, 
especialmente devido ao grande contato do homem com o cão e às crianças que têm maior 
dificuldade. Além disso, é relevante considerar a grande resistência dos ovos a produtos que 
podem destruir o Toxocara spp. no ambiente, e o aumento da tendência global de comer carne 
e vegetais cru ou mal cozidos, que facilita a transmissão deste helminto (Macpherson, 2005). 
 
2. JUSTIFICATIVA 
Devido à grande frequência de cães infectados por Toxocara canis e ao grande potencial 
destes contaminarem o ambiente domiciliar, peridomiciliar e lugares públicos, como praças e 
parques, a toxocaríase humana torna-se uma zoonose de importância para a saúde pública 
(Hotez, 2008). As áreas rurais tendem a apresentar maior prevalência (35-42%) comparada a 
semi-rural (15-20%), e urbana (2-5%). No entanto, as áreas urbanas, particularmente em 
parques e praças, foram mostradas um elevado número de ovos de Toxocara acarretando em 
um grande risco de infecçãonos seres humanos. Sendo assim, a toxocaríase é considerada uma 
das importantes doenças negligenciadas, principalmente nas Américas (Macpherson, 2013). 
O diagnóstico da infecção humana geralmente está sendo feito por testes indiretos, 
aplicando testes de ELISA ou WB. Entretanto, mesmo os testes descritos com antígenos 
fragmentados ou antígenos recombinantes demostram reatividades cruzadas com outras 
helmintoses comumente encontradas em países tropicais e em desenvolvimento como o Brasil 
(Turrientes et al., 2011). Dentre estas helmintoses, têm-se o Schistosoma mansoni, 
 
28 
 
Angiostrongylus, Strongyloides e ainda, a que possui maior reatividade cruzada, as espécies 
de Ascaris (Smith et al., 1983). 
Portanto, o presente estudo se justifica pela necessidade da busca por novos antígenos 
para o diagnóstico da toxocaríase com uma sensitividade e especificidade efetiva, 
principalmente tentando eliminar a reatividade cruzada no diagnóstico com outros helmintos, 
especialmente com Ascaris lumbricoides, visto que ao contrário dos testes comerciais, que 
ainda podem apresentar uma grande reatividade cruzada, usaremos lectinas recombinantes 
imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) para o estudo. 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo Geral 
Avaliar o desempenho de novos antígenos e peptídeos por meio de ensaios de ELISA 
indireta com soros de camundongos e humanos infectados por diferentes espécies de 
helmintos. 
 
3.2 Objetivos Específicos 
- Identificar novos antígenos e/ou epítopos de T. canis por meio da busca em bancos de 
dados com genomas completos ou sequências de ESTs, como HelmCoP e 
Nematode.net e selecionar sequências de peptídeos específicas para linfócitos B. 
- Testar e avaliar peptídeos promissores em ensaios de ELISA anti-IgG com soros de 
camundongos infectados por diferentes helmintoses. 
- Testar e avaliar as lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de 
ELISA anti-IgG com soros de camundongos infectados com diferentes helmintoses. 
- Testar e avaliar as lectinas TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de ELISA anti-IgG,-
IgG1,-IgG4 e -IgA com soros de humanos infectados por diferentes helmintos. 
 
29 
 
 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4.1 Aspectos éticos 
O presente projeto é uma continuação do projeto de pesquisa intitulado “Identificação de 
proteínas específicas para o imunodiagnóstico da larva migrans humana” (ETIC 223/02, 
Parecer n° 124/02) e do projeto “Novo diagnóstico para toxocaríase humana” (Parecer CAEE 
– 05548512.5.0000.5149) do Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas 
da UFMG. 
 4.2 Soros de camundongos 
Para os testes de ELISA com soros de camundongos infectados, foram utilizados 
sorotecas do Laboratório de Helmintoses Intestinais do departamento de Parasitologia e 
Laboratório de Esquistossomose e Imunohelmintologia localizado no ICB-UFMG. Sendo 
assim, usou-se: 
- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de T. canis, 
sendo um intervalo de duas semanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50 dias 
pós infecção. 
- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de Ascaris 
suum, sendo um intervalo de duassemanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50 
dias pós-infecção. 
- Oito soros de camundongos Swiss coinfectados por Schistosoma mansoni (infecção 
injetada contendo 25 cercárias) e Angiostrongylus costaricensis (infecção realizada por 
gavagem contendo 8 larvas L3). O soro foi coletado quando o camundongo possuía 125 
dias pós-infecção de S. mansoni e 21 dias de infecção por Angiostrongylus, totalizando 3 
semanas de co-infecção. 
- Cinco soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 25 
cercarias de Schistosoma mansoni. O soro foi coletado com 50 dias pós-infecção. 
 
30 
 
- Seis soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 700 
larvas L3 de Strongyloides venezuelensis. O soro foi coletado com 14 dias pós-infecção. 
- Quatro soros de camundongos BALB/C não infectados como controle negativo. 
 Em cada momento das infecções experimentais, os animais de cada grupo foram 
anestesiados com injeção intraperitoneal de solução de ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 
mg/kg). Para cada 12-15 g foram aplicados 100 ml da solução e, quando necessário, aplicar 
depois mais ¼ a ½ da dose inicial. Após confirmação da anestesia coletou-se a amostra de 
sangue por punção cardíaca ou plexo braquial dos animais anestesiados. Posteriormente, cada 
animal será eutanasiado por sobredose de ketamina e xilazina para realização de necropsia. 
 
4.3 Soros de humanos 
Os soros humanos de pacientes com exames de fezes positivos para Schistosoma mansoni, 
Ascaris summ (infecção experimental em humanos, 70 dias pós-infecção), negativos e de 
pacientes com toxocaríase confirmados por Western blot, que em parte já foram usados em 
ensaios anteriores por Peixoto et al., 2011, foram obtidos pelas sorotecas do Laboratório de 
Imunologia e Genômica de Parasitos e do Laboratório de Helmintoses Intestinais (ambos 
ICB-UFMG). Cinco soros positivos por teste comercial de ELISA (RIDASCREEN® 
Toxocara IgG, R-Biopharm, Alemanha) e com suspeita de toxocaríase por anamnese foram 
fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas de Belém, e acrescentados nos testes. Soros de 
pacientes positivos para exames de fezes por ancilostomídeos também foram utilizados no 
estudo, e fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas do Pará. 
Sendo assim, no total foram usados 25 soros de pacientes com Toxocara, 5 com Ascaris 
suum (projeto Ascaris humano, Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, CAAE: 
26945814.1.0000.5149), 20 com ancilostomídeos (projeto DECIT, Pará), 16 com Schistosoma 
mansoni (projeto DECIT, Januária) e 10 negativos (projeto DECIT, Januária). 
 
4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares 
de célula B específicos de T. canis e sua síntese. 
 
31 
 
Os epítopos lineares para linfócitos B foram preditos usando o programa BEPIPRED 
1.0 („B cell epitope prediction‟) (Larsen et al., 2006). O programa avalia todos os 
aminoácidos da sequência dando uma pontuação baseado na hidrofilicidade (Parker, 1989) e 
no método de cadeia de Markov. Vários aminoácidos seguidos com pontuação igual ou maior 
que 1.3 formam um epítopo linear. O programa não apresenta limitações para o número 
mínimo de aminoácidos para formar um epítopo. Para limitar esse tamanho, um script PERL 
(filtro) do grupo da Profa. Daniella Bartholomeu foi criado para selecionar somente os 
epítopos com tamanho igual ou maior que quinze aminoácidos (Freitas et al., 2011). Peptídeos 
com alta similaridade com proteinas de de A. lumbricoides foram eliminados. 
Após a busca, identificou-se um total de 154 proteínas de T. canis depositada no NCBI 
(National Center for Biotechnology Information) na data de acesso em 24/07/2013, das quais 
foram recuperadas para análise. Epítopos lineares de células B foram preditos utilizando o 
programa Bepipred 1.0, considerando um valor de corte de 1.3, que representa 96% de 
especificidade e 13% de sensibilidade. 
Foram identificados 18 peptídeos não redundantes com alto potencial de ser um 
epítopo. Para identificar potenciais epítopos específicos de T. canis, foi utilizado o algoritmo 
BLASTP para alinhar os peptídeos não redundantes com o proteoma predito baseado no 
genoma de A. summ versão 1.0 (contendo 18542 proteínas). Sendo assim, foram considerados 
específicos epítopos com identidade e cobertura menor de 70%. 
Um total de 15 epítopos foram considerados específicos para T. canis: 
 
EAKNQDSTT; EGGGGKKKG; EIPTPDTTVSDD; ENGDPSDA; ESKPQPKAPAK; 
GGRAPPKHDNP; GGSKGFPPAPY; KNRKPGDKSSE; KPETDSLAT; KQKGQNAT; 
KSDPDPKK; NPADSMQA; PAATTTAAPGVTTT; SSKSKPQPKVP; YGPGAAAS. 
Destes epítopos promissores, seis foram selecionados de acordo com sua origem e 
sintetizados (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha): 
 
1) EGGGGKKKG: miosina de T. canis. 
2) GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo. 
3) GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis. 
4) PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo E/S TES 32 T. canis. 
 
32 
 
5) YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo. 
6) KSDPDPKK: miosina T. canis. 
Os peptídeos foram recebidos liofilizados em uma concentração de 10 mg. Cada um deles 
foi reconstituído em 1 mL de água bidestilada, resultando em uma concentração de 10 
mg/mL. Estes foram aliquotados a 100 µL por tubo (10 tubos para cada peptídeo) e 
armazenados em freezer -20ºC. 
 
 
 
4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 
 As lectinas recombinantes TC-TCL-1 e TC-TCL-2 foram produzidas pelo grupo de 
Dr. Bin Zhan da Escola de Medicina do Baylor College, localizada em Houston, Texas, EUA. 
Estas lectinas foram selecionadas a partir de proteínas imunodominantes selecionadas por 
screening em bancos de dados cDNA de larvas de T. canis, a partir do antígeno TES-32, e 
após a seleção, foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) de Escherichia coli e 
purificadas para os ensaios de ELISA. 
 
4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 
 Ensaios de ELISA indireto foram utilizados para dosagem de anticorpos específicos 
em soros de camundongos e de seres humanos, contra os peptídeos sintetizados e as lectinas 
TC-CTL-1 e TC-CTL-2. No caso do ELISA de camundongos, foi usado como anticorpo 
secundário anti-IgG (Anti-camundongo IgG peroxidase, anticorpo produzido em coelho, 
SIGMA-ALDRICH®, EUA). Em ensaios com soros humanos, foram usados anti-IgG-AP 
(Anti-Humano IgG, específico para cadeia y e conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-
ALDRICH®, EUA), anti-IgG1(Anti-Humano IgG1, Clone 8c/6-39, biotinilado, SIGMA-
ALDRICH®, EUA), anti-IgG4 (Anti-Humano IgG4-Biotinilado, clone HP-6025, biotinilado, 
 
33 
 
SIGMA – ALDRICH®, EUA) e anti-IgA-AP (Anti-Humano IgA,específico para cadeia α, 
conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-ALDRICH®, EUA) como anticorpos secundários. 
 
4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados 
 Para este teste foi usada a placa de 96 poços (COSTAR®, EUA, 96 poços, Nº2595, 
vinil; para ensaios com proteínas). O ELISA indireto foi realizado em três etapas: 
 
1) Sensibilização; 
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário; 
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação. 
 
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em água bidestilada 
acrescida do peptídeo testado, em uma concentração de 10 µg/mL e volume total de 100 µl 
por poço, incubados durante a noite à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda 
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina 
(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito 
duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o 
anticorpo primário (soros) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%, incubado 
durante a noite em geladeira 4-8 ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem das 
placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e então 
aplicadoo anticorpo secundário IgG-peroxidase (SIGMA-ALDRICH®,USA) em uma 
diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas 
horas à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço 
de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100 µl de substrato OPD (o-
phenylenediamine dihydrochloride, Thermo Scientific®, EUA) na concentração de 0,05 
gramas diluído em 30 ml de tampão citrato-fosfato (Na2HPO4.12 H2O). A reação 
colorimétrica em temperatura ambiente foi interrompida após 20 minutos pela adição de 50 µl 
em cada poço de solução de parada (H2SO4 2M), e levada para leitura no leitor de ELISA 
(Versa Max, Molecular Devices®) a 490 nm. 
 
 
34 
 
4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1 
e rTC-CTL-2 
 Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade 
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas: 
 
1) Sensibilização; 
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário; 
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação. 
 
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH 
9,6) acrescido das lectinas rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL, 
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. A segunda e a terceira etapa foram realizadas 
de acordo com o protocolo descrito no item 4.6.1. 
4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de 
T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2 
 
 Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade 
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas: 
 
1) Sensibilização; 
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário; 
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação. 
 
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH 
9,6) acrescido da lectina TC-CTL-1 ou TC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL, 
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda 
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina 
(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito 
duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o 
anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%, 
incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem 
das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e 
 
35 
 
então aplicado o anticorpo secundário IgG fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) ou 
IgA fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) em uma diluição de 1:5000 em PBS 
Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas horas à 37ºC. Após o tempo de 
espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco 
vezes e feita a adição de 100 µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de 
substrato pNPP e tampão (SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®, 
EUA). Foi esperado 20 minutos em temperatura ambiente e sob abrigo da luz para a reação 
colorimétrica e levada para leitura no leitor de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®, 
EUA) a 405 nm. 
 
 
 
4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de 
T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2 
 
 Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade 
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas: 
 
1) Sensibilização; 
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário; 
3) Diluição e adição do anticorpo secundário, aplicação da streptavidina ligada a 
fosfatase alcalina e revelação. 
 
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH 
9,6) acrescido da lectina rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL, 
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda 
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com 200 µl por poço de solução de PBS caseína 
(Casein, Bovine Milk da marca CALBIOCHEM®) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o 
bloqueio, foi feita duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e 
aplicado o anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 
0,05%, incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a 
lavagem das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco 
 
36 
 
vezes, o anticorpo secundário IgG1 ou IgG4 biotinilados (ambos SIGMA-ALDRICH®, EUA) 
em uma diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µg/mL em cada poço, e incubado 
durante duas horas à 37ºC. Feito cinco lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS 
Tween 0,05% e aplicado 100 µl de Streptavidina-AP (Streptavidin-Alkaline Phosphatase from 
Streptomyces avidinii (SIGMA®, USA) na proporção de 1:2000 em tampão de bloqueio de 
caseína 0,25% por uma hora e meia à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das 
placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100 
µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de substrato pNPP e tampão 
(SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®, EUA). Foi esperado 40 
minutos em temperatura ambiente para a reação colorimétrica e levada para leitura no leitor 
de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®) a 405 nm. 
 
4.7 Análise Estatística 
Os resultados da sorologia foram expressos em média ± desvio padrão. Utilizou-se o 
teste de Kolmogorov-Smirnov, para verificar a normalidade das amostras e para comparação 
entre os grupos com diferentes helmintoses. Para os valores que seguiram um padrão de 
normalidade, foi utilizada análise variância ANOVA com ajuste pós-teste Tukey, e então 
aplicado o Teste t de Student. Para aqueles que não seguiram padrão de normalidade, foi 
utilizada como análise de variância o Kruskal-Wallis com ajuste de pós-teste Dunn`s, e então 
aplicado o U-test de Mann-Whitney. Todos os testes e análises foram realizados pelo software 
GraphPad Prism® 5 (GraphPad Software Inc.), considerando-se um nível de significância de 
5% (p < 0,05). 
Para fins de cálculo de porcentagens de especificidade e sensitividade dos peptídeos e 
lectinas testados, foi utilizado a linha de corte definida pela curva ROC (Receiver Operator 
Curve), que segundo Martinez et al. 2003, é uma função contínua da sensibilidade e 
especificidade para diversos valores obtidos dentro do espaço amostral ligados por linha reta. 
 
 
 
 
37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5. RESULTADOS 
5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos 
 No total foram testados seis peptídeos, como referido antes na metodologia. O 
Peptídeo 1 (Figura 5), refere-se a sequência EGGGGKKKG com origem de miosina de T. 
canis. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de 
normalidade e verifica-se uma diferença significativa entre a média dos soros negativos e a 
média dos soros com infecção de T. canis (p ≤ 0.001). A sensibilidade do ensaio resultou em 
100% dos soros com infecção de T. canis reconhecidos, porém, houve reatividade cruzada, 
especialmente com soros de animas infectados com A. suum e com animais co-infectados com 
S. mansoni e A. costaricensis, resultando em uma especificidade total do ensaio sorológico em 
62,5%. 
 
 
38 
 
Peptídeo 1
To
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A
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S
ch
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S
ch
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0.0
0.5
1.0
100%
37,5%
100%
A
b
so
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b
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 [
4
9
0
 n
m
]
0%0% 0%
Soros camundongos
 
Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina T. canis) com soros de 
camundongosinfectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. 
Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio 
em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: 
Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por 
Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); 
Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. 
venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha 
pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de 
sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é 
indicado. 
 
 
O peptídeo 2 (Figura 6), refere-se a sequência GGRAPPKHDNP, depositado no banco 
de dados com origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293). Na reação de ELISA, esse 
peptídeo mostrou uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 53,13% (menor em 
relação ao peptídeo 1). As amostras seguem um padrão de normalidade e verifica-se uma 
diferença significativa entre a média dos soros negativos com a média dos soros com infecção 
de T. canis (P=0.0166). Apesar da sensibilidade satisfatória de 100% de reconhecimento dos 
soros de T. canis, novamente verificou-se uma reatividade cruzada principalmente com soros 
de animais infectados por A. suum e animais co-infectados com S. mansoni e A. costaricensis, 
o que resulta em uma especificidade de 53,13%. 
 
39 
 
 
Peptídeo 2
To
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ca
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A
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m
S
ch
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to
/A
ng
io
S
ch
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a
S
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N
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at
iv
os
0.0
0.5
1.0
A
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 [
4
9
0
 n
m
]
0%
100%
77,3%
0% 0%
100%
Soros camundongos
 
Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293)) 
com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de 
ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto 
com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos 
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos 
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. 
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: 
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados 
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor 
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada 
grupo é indicado. 
 
O peptídeo 3 (Figura 7) corresponde a sequência GGSKGFPPAPY, tendo como 
origem parte do canal de potássio de T. canis. Em geral, foi observada uma reatividade menor 
a este peptídeo. Na performance do teste para o grupo infectado com T. canis, resultou uma 
sensitividade mais baixa que nos testes anteriores, de 77,78%, e uma especificidade de 
62,50%. O teste segue padrão de normalidade e possui diferença significante entre a média 
dos soros negativos e a média dos soros infectados por T. canis (P= 0.0049). Mesmo 
apresentando esta diferença significante, o não reconhecimento de todos os soros infectados 
 
40 
 
por T. canis, o que não foi observado nos peptídeos anteriores, diminui sua sensibilidade, 
porém o padrão de especificidade mantém o mesmo que os demais. De novo, soros de animais 
infectados com A. suum demonstraram uma reatividade maior (p= 0.0080) quando 
comparados com a infecção por T. canis. 
To
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A
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S
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iv
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0.0
0.5
1.0
Peptídeo 3
0%
100%
50%
0%
0%
75%
A
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 [
4
9
0
 n
m
]
Soros Camundongos
 
Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis) com 
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA 
anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o 
valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos 
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos 
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. 
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: 
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados 
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor 
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada 
grupo é indicado. 
 
 
O peptídeo 4 (Figura 8), é a sequência PAATTTAAPGVTTT e tem como origem na 
lectina tipo E/S TES 32 de T. canis. Como observado nos dois primeiros peptídeos, este 
mostrou uma sensibilidade de 100% e novamente seguiu um padrão de especificidade de 
 
41 
 
59,38%. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de 
normalidade e novamente os valores da média dos soros negativos e os soros infectados por T. 
canis possuem diferença significativa (P= 0.0025). Sua sensibilidade é satisfatória, porém 
como observados em todos os outros peptídeos, também possui reatividade cruzada com A. 
suum e os soros co-infectados. 
 
 Peptídeo 4
To
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A
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S
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S
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0.0
0.5
1.0
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 [
4
9
0
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]
0%
100%
50%
0%
100%
0%
Soros camundongos
 
Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32 T. 
canis) com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento 
de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto 
com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos 
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos 
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. 
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: 
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados 
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor 
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada 
grupo é indicado. 
 
O peptídeo 5 (Figura 9) e o peptídeo 6 (Figura 10) correspondem as sequências 
YGPGAAAS (origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293)) e KSDPDPKK (origem da 
 
42 
 
miosina de T. canis) respectivamente. Estes peptídeos, alcançaram resultados menos 
promissores, sendo o Peptídeo 5 mostrando uma sensibilidade de 100%, porém baixa 
especificidade de 34,38%, com reatividade em todos os grupos, inclusive os negativos (Figura 
5). O Peptídeo 6, alcançou uma sensibilidade menor, de 88,89%, e uma especificidade de 
40,63%, mostrando uma reatividade maior nos negativos do que nos soros infectados por T. 
canis (Figura 6). 
 
 
Peptídeo 5
To
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A
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S
ch
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os
0.0
0.5
1.0
A
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c
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 [
4
9
0
 n
m
]
33,3%
100%
75%
66,6%
33,4%
100%
Soros camundongos
 
Figura 9: Reatividade do peptídeo 3 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com 
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA 
anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o 
valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos 
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos 
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. 
costaricensis (n=8); Schistosoma:mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: 
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados 
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor 
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada 
grupo é indicado. 
 
 
43 
 
 
Peptídeo 6
To
xo
ca
ra
A
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S
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S
ch
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S
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es
N
eg
at
iv
os
0.0
0.5
1.0
A
b
so
r
b
â
n
c
ia
 [
4
9
0
 n
m
]
75%
72%
33%
0% 20%
11%
Soros camundongos
 
Figura 10: Reatividade do peptídeo 3 (KSDPDPKK: miosina T. canis) com soros de 
camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. 
Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio 
em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: 
Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por 
Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); 
Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. 
venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha 
pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de 
sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é 
indicado. 
 
Com excessão do peptídeo 3 e 6, todos os soros de camundongos infectados por T. 
canis apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em 
uma sensibilidade de 100% para estes soros, como se pode observar nos gráficos da curva 
ROC (Figura 7). 
 Como em todos os peptídeos houve reatividade cruzada, principalmente com os soros 
de camundongos infectados por A. suum, nenhum peptídeo atingiu 100% de especificidade. 
 As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de 
ELISA com os peptídeos podem ser visualizados a seguir na Figura 11. 
 
44 
 
A) Curva ROC Peptídeo 1
0 50 10
0
15
0
0
50
100
150
% Especificidade
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
 
B) Curva ROC Peptídeo 2
0 50 10
0
15
0
0
50
100
150
% Especificidade
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
 
 
C) Curva ROC Peptídeo 3
0 50 10
0
15
0
0
50
100
150
% Especificidade
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
 
D) Curva ROC Peptídeo 4
0 50 10
0
15
0
0
50
100
150
% Especificidade
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
 
E) Curva ROC Peptídeo 5
0 20 40 60 80 10
0
0
50
100
150
% Especificidade
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
 
F) Curva ROC Peptídeo 6
0 20 40 60 80 10
0
0
50
100
150
%
 S
e
n
si
b
il
id
a
d
e
% Especificidade
 
Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros 
de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC foram utilizadas 
no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com os peptídeos, de forma 
maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A) Curva ROC do 
peptídeo 1 utilizando soros de camundongos com diferentes helmintoses e assim 
 
45 
 
respectivamente: B) Curva ROC do peptídeo 2 C) Curva ROC do peptídeo 3 D) Curva ROC 
do peptídeo E) Curva ROC do peptídeo 5 F) Curva ROC do peptídeo 6. No eixo da ordenada 
está representada a sensibilidade alcançada nos ensaios, e no eixo das abscissas está 
representada a especificidade alcançada também nestes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
46 
 
5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas 
recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2. 
 
 As lectinas recombinantes rTC-CTL-1 (Figura 12) e rTC-CTL-2 (Figura 13), 
apresentaram no ensaio uma sensibilidade e especificidade de 100%, baseadas na curva ROC. 
As amostras seguem padrão de normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, e os valores 
da média dos resultados dos soros negativos e a média dos soros infectados por T.canis 
possuem diferença significativa em ambas lectinas (P= 0.0001). Além disso, nestes ensaios, 
pode-se constatar também uma diferença significativa entre a média dos valores dos soros 
infectados por A. suum e a média dos valores dos soros infectados por T. canis, o que é um 
resultado promissor devido à eliminação da reatividade cruzada (P= 0.0001). 
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N
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iv
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Lectina rTC-CTL-1
100%
A
b
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ã
n
c
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 [
4
9
0
 n
m
]
Soros de Camundongos
 
Figura 12: Reatividade da lectina rTC-CTL-1 com soros de camundongos infectados por 
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de 
absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra 
horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos 
infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9); 
Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-
infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e 
Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à 
linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade 
(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado. 
 
47 
 
Lectina rTC-CTL-2
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 [
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9
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Soros de Camundongos
 
Figura 13: Reatividade da lectina rTC-CTL-2 com soros de camundongos infectados por 
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de 
absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra 
horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos 
infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9); 
Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-
infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e 
Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à 
linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade 
(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado. 
 
Os camundongos infectados por T. canis, tanto para o antígeno rTC-CTL-1 e rTC-
CTL-2, apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em 
uma sensibilidade de 100%. Como nenhum dos soros infectados por outras helmintoses e 
controle negativo apresentou valores acima da linha, a especificidade dos ensaios também 
foram de 100%. 
 As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de 
ELISA com as lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros de camundongos podem ser 
visualizados a seguir na Figura 14. 
 
48 
 
A) ROC rTC-TCL-1 Soros Camundongos
0 20 40 60 80 10
0
0
20
40
60
80
100
100% - Especificidade
1
0
0
%
 -
 S
e
n
si
b
il
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a
d
e
 
B) ROC rTC-TCL-2 Soros Camundongos
0 50 10
0
15
0
0
50
100
150
100% - Especificidade
1
0
0
%
 -
 S
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b
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e
 
Figura 14: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como 
antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas 
ROC foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com as 
lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A) 
Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de camundongos com diferentes 
helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de camundongos com 
diferentes helmintoses.