Tradução Artigo de revisão Células de satélite musculares explorando a biologia básica para governá-los

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Artigo de revisão Células de satélite musculares: explorando a biologia básica para governá-los
O músculo esquelético adulto é um tecido pós-mitótico com uma enorme capacidade de regeneração após lesão. Isto é realizado por células estaminais residentes, chamadas células satélites, que foram identificadas há mais de 50 anos. Desde sua descoberta, muitos pesquisadores têm se concentrado esforços para responder a perguntas sobre sua origem e papel no desenvolvimento muscular, a forma como eles contribuem para a regeneração muscular, e seu potencial para terapias baseadas em células. As células de satélite são mantidas em um estado quiescente e, mediante a exigência são ativados, proliferando e fundindo com outras células para formar ou reparar mioscópios. Além disso, eles são capazes de auto-regeneração e reabastecer o tanque de talo. Cada fase da atividade das células de satélite é altamente regulada e orquestrada por muitas moléculas e vias de sinalização; a elucidação de jogadores e mecanismos envolvidos na biologia das células de satélite é de extrema importância, sendo o primeiro passo para expor os pontos cruciais que poderiam ser modulados para extrair a melhor resposta dessas células em estratégias terapêuticas. Aqui, nós revisamos os aspectos básicos sobre a biologia das células de satélite e brevemente discutimos descobertas recentes sobre tentativas terapêuticas, tentar levantar questões sobre como a biologia básica poderia fornecer um suporte sólido para o uso mais bem sucedido destas células em clínicas.
INTRODUÇÃO 
O músculo esquelético é um tecido pós-mitótico que tem um alto potencial regenerativo. Esta característica deve-se principalmente às células-satélite (SCs), que formam um reservatório de células precursoras responsáveis pelo seu crescimento pós-parto e também pela resposta a lesões, quer por exercício quer por doença [1]. Suas quantidades no músculo adulto podem variar entre 3 e 11% do myonuclei, dependendo de quais espécies estão sendo analisadas. Em ratinhos, a quantidade de SCs desce de 32% em recém- nascidos para 5% em adultos [2, 3]. Estas células estão estritamente associadas com o sarcolema, residindo entre a membrana e a lâmina basal [4], tornando-se associada com a fibra muscular antes da formação de sua lâmina circundante [3].
 O músculo esquelético é um tecido pós-mitótico que tem um alto potencial regenerativo. Esta característica deve-se principalmente às células-satélite (SCs), que formam um reservatório de células precursoras responsáveis pelo seu crescimento pós-parto e também pela resposta a lesões, quer por exercício quer por doença [1]. Suas quantidades no músculo adulto podem variar entre 3 e 11% do myonuclei, dependendo de quais espécies estão sendo analisadas. Em ratinhos, a quantidade de SCs desce de 32% em recém- nascidos para 5% em adultos [2, 3]. Estas células estão estritamente associadas com o sarcolema, residindo entre a membrana e a lâmina basal [4], tornando-se associada com a fibra muscular antes da formação de sua lâmina circundante [3]. 
 Embora quiescente em músculos adultos normais, estas células podem ser ativadas por sinais específicos quando ocorre uma lesão muscular. Após a activação, estas células passam por uma divisão assimétrica, através da qual podem formar células capazes de se auto-regenerar ou podem entrar na via miogénica e diferenciar-se para restaurar o músculo [7–9]. No entanto, em doenças caracterizadas por degeneração implacável, como distrofias musculares, as células de satélite são constantemente ativadas, o que eventualmente leva ao esgotamento da piscina SC e consequente falha do processo de regeneração [10]. Actualmente, não existe um tratamento eficaz para as doenças degenerativas musculares, pelo que muitos investigadores estão a concentrar-se em terapias baseadas em células estaminais. No entanto, até à data, a maioria das tentativas limita-se a modelos animais e os ensaios clínicos anteriores falharam.
Nesta revisão, nós resumimos achados recentes sobre a biologia básica de células-tronco específicas do músculo e discutimos possíveis novas vias para abordagens terapêuticas mais eficazes e viáveis para os distúrbios do desgaste muscular, principalmente distrofias musculares.
 
2. Origem das células satélites no desenvolvimento muscular 
No embrião, estruturas mesodermicas chamadas somites são formadas e os músculos esqueléticos são derivados de uma região específica, o dermomiátomo [11]. Nesta etapa são formadas as primeiras fibras musculares e depois são adicionadas fibras adicionais utilizando-se as primeiras como modelo [12,13]. No período final da embriogênese, os progenitores musculares começam a proliferar vastamente até chegarem a um estado em que o número de núcleos é mantido e a síntese de proteína miofibrilar atinge o seu pico [14]. O músculo atinge então um estado maduro com suas células progenitoras residentes, os SCs, adquirindo um estado quiescente neste tecido [11].
Em somites, as altas concentrações de FGF e Wnt na área caudal levam à formação de células mesenquimais em um estado indiferenciado e esta via também envolve o controle por Notch [15]. Em seguida, a parte mais dorsal forma o dermomiátomo, que dará origem à maioria dos músculos esqueléticos. As células deste compartimento têm alta expressão dos fatores Pax3 e Pax7 e uma baixa expressão do regulador miogênico Myf5 [16–18]. Posteriormente, a maturação de uma peça dermomiomatosa formará o miotoma, que se caracteriza pela expressão de MyoD e Myf5 [18–20]. Os progenitores musculares intercalam subsequentemente no miotoma primário, originando uma fracção dos SCs que reside no músculo esquelético pós- natal [21–24].
Sabe-se que as SCs participam da regeneração muscular adulta e muitas semelhanças foram descritas entre este processo e a miogênese embrionária, relacionando as SCs com progenitores de origem somática [21–23, 25] (Figura 1(a)). Também é importante notar que as células envolvidas no processo de regeneração adulta estão sob a mesma hierarquia genética envolvida na miogênese embrionária, com os mesmos genes participando da sua regulação [26] (Figura 1(b)). A principal distinção entre miogênese no embrião e regeneração é que este requer um andaime que funcionará como modelo [27].
Vários dados indicam também que existem SCs específicos que passam por divisão assimétrica, gerando células comprometidas dedicadas ao processo de regeneração, mas também produzindo novos SCs que são capazes de repor o pool de células-tronco musculares [11].
Células miogênicas adultas são derivadas principalmente de SCs durante o desenvolvimento fetal tardio. No entanto, houve provas de outras populações de células estaminais adultas que também podem estar envolvidas na regeneração [12]. No entanto, é notável que mesmo que essas outras células estaminais existam e tenham potencial miogênico, experiências que esgotam Pax7-As células de satélite mostram que nenhum outro tipo de células estaminais é capaz de reconstituir a reserva de SC nem de atuar na regeneração após uma lesão, salientando a importância única das SCs [28].
3. Marcadores de células de satélite
 As células satélites podem ser identificadas pela expressão de vários marcadores, com atenção especial ao Pax7, qsue é considerado o principal fator definidor desse tipo de célula [5]. Esse marcador foi correlacionado com a manutenção de um estado indiferenciado, sendo um fator importante para a auto-renovação nessas células [29]. Além da Pax7, outra proteína da família de fatores de transcrição de domínio emparelhado pode ser expressa, Pax3, que também é importante nas etapas iniciais da formação muscular e está envolvida na transcrição de outro marcador, o receptor de tirosina cinase c-Met [30 –32] Curiosamente, no nocaute do Pax7, alguns SCs podem ser encontrados, indicando que o Pax3 sozinho poderia desempenhar um papel semelhante [30, 33]. Por outro lado, outros resultados sugerem que o Pax3 não é capaz de compensar a função Pax7 [32]. Além disso, a presença de Pax3 SCs depende do tipomuscular [30]. Além da família de proteínas Pax, muitos outros marcadores podem ser usados ​​para identificar SCs, como o fator regulador miogênico Myf5 [31, 34]; fator de transcrição da homeobox Barx2, que é co-expresso com Pax7 e é um regulador do crescimento, manutenção e regeneração muscular [35]; proteína de adesão celular M-caderina, que é conhecida por ser co-expressa com c-Met [31, 36]; receptor de ligação à superfície celular 7-integrina [37, 38]; cluster de proteína de diferenciação (CD34) que é expresso em SCs inativos [34]; proteoglicanos transmembranares de sulfato de heparano syndecan-3 e syndecan-4 [39]; receptor de quimiocina CXCR4 [40]; proteína de formação de cavernas caveolin-1 [38, 41]; receptor de calcitonina, que foi descrito como relacionado ao estado de repouso [38, 42]; proteína de adesão celular vascular 1 VCAM-1 [43]; molécula de adesão de células neurais 1 NCAM-1 [44, 45]; e proteínas de envoltório nuclear laminam A / C e emerin [38]. No entanto, essas proteínas individuais não são expressas exclusivamente em SCs, o que significa que apenas sua coexpressão simultânea tem sido útil na identificação desse tipo de célula. Embora outros marcadores tenham sido propostos para identificar SCs, os citados acima e indicados na Figura 2 são os mais comumente estudados. A tabela 1 apresenta exemplos de anticorpos para imunofluorescência referidos na literatura. Diferentes anticorpos podem ser utilizados de acordo com a metodologia adotada (western blotting, citometria de fluxo, etc.).
*4. heterogeneidade na população de células satélites*
Ainda que a identificação das células de satélite se baseie na expressão do marcador e na análise morfológica, foi sugerido que estas células constituem uma população heterogénea de células precursoras [33]. Também tem sido relatado que estas células podem ser propensas a ser comprometidas com a linhagem muscular ou com a via auto-renovável, o que também é uma evidência de sua heterogeneidade [44, 46, 47]. A expressão dos marcadores citados na seção anterior, embora bem estabelecida na literatura, pode ser variável nesta população celular, sendo outra indicação de que esta população celular pode ser heterogênea, mesmo que as células mantenham seu potencial miogênico.
Por exemplo, a expressão do marcador Myf5 foi relatada como ausente em ~ 10% da população de SC, e as células identificadas como Pax7+/Myf5 contribuíram para o seu reservatório em contraste com as células Pax7+/Myf5+ que estavam comprometidas com a diferenciação [48]. Estudos também mostraram que as células ativadas que expressavam baixos níveis de Pax7 estavam mais comprometidas com a diferenciação, enquanto níveis elevados de Pax7 estavam relacionados com células menos propensas a diferenciar e que tinham características mais indiferenciadas [49]. As experiências com a marcação histona 2B também demonstraram que existem SCs que retêm ou perdem esta marca e que a primeira é capaz de se auto-regenerar e as células que perdem a marca estão limitadas à diferenciação [50].
Observaram-se igualmente diferenças na taxa de proliferação de SCs, uma vez que coexistem células de divisão lenta e rápida [51]. Os lentos são capazes de auto-renovação a longo prazo, enquanto as células de divisão rápida comprometem-se com a linhagem miogênica sem produzir progênie auto-renovável [52]. Neste sentido, subpopulações que são consideradas comprometidas com a linhagem miogênica poderia participar da regeneração de um músculo lesionado antes dos que ainda estão no estado mais progenitor e, portanto, levaria mais tempo para ser envolvido neste processo de [53]. Este cenário é consistente com uma célula-tronco para a hierarquia das células progenitoras.
Como se sabe que os músculos dentro do corpo são distintos entre si, tem sido visto que os SCs também apresentam heterogeneidade com base no músculo que estão localizados dentro, o que pode correlacionar com a sua origem embrionária distinta [6, 54]. Isto é consistente com os resultados anteriores observados por Buckingham et al. e Relaix et al. que mostram que a expressão de Pax3 por SCs é dependente muscular [30, 32]. À medida que o conhecimento aumentou, estudos foram feitos para determinar se a heterogeneidade dos EC no músculo era devida ao ambiente muscular ou programação interna, e os resultados de pesquisas distintas mostraram que há evidências para ambos [55, 56].
Diferenças nos EC também foram encontradas ao considerar as fibras extrafusais e sua categorização em fibras rápidas e lentas em relação à taxa de proliferação e potencial de diferenciação. Notavelmente, os SCs poderiam diferenciar em fibras rápidas exclusivas quando vieram de um músculo rápido e em fibras rápidas ou lentas quando são derivados de um músculo lento [57–59]. Como observado anteriormente, o fenótipo após a diferenciação pode ser dependente da programação intrínseca que está relacionada com o tipo de fibra ou pode estar sob influência do ambiente, ou seja, a fibra muscular com quem a célula interage [6 de 60]. Quanto às fibras intrafusais, sabe-se que os SCs neste compartimento são mais plásticos e direcionados para um fenótipo específico por estimulação de inervação estrangeira [61, 62].
Diferenças morfológicas traduzidas como células redondas e espessas também foram observadas na população de EC e foram associadas com potencial miogênico distinto [63], sendo as mais espessas mais propensas à diferenciação. Funcionalmente, há observações que sugerem duas subpopulações de SCs, uma que está comprometida com o crescimento muscular, cujo número de células diminui com a idade e está presente em uma quantidade maior em homens, e outra subpopulação relacionada com a regeneração muscular após uma lesão, cuja quantidade celular é relativamente mantida durante o envelhecimento e não está relacionada com o género [64].
A heterogeneidade também pode resultar do nicho distinto em que estas células estão localizadas, como tem sido observado no processo de envelhecimento, onde as células podem escapar da quiescência e perder a sua capacidade de auto-renovação [65–67]. Um componente importante do nicho muscular que atua diretamente na proliferação e diferenciação de células de satélite é o precursor fibro/adipogênico, e sabe-se que eles agem positivamente em ratos jovens dmd mdx, o modelo para a distrofia muscular de Duchenne, mas reprime a formação de miopúbicos em antigos, indicando que o processo de envelhecimento tem implicações diretas nas células de satélite [68]. Outros fatores como Notch e Wnt também estão envolvidos neste processo não autônomo de SCs envelhecimento [67, 69]. Além disso, mudanças intrínsecas nas células também são observadas no processo de envelhecimento tais como em SCs geriátricos que perdem a quiescência reversível e entram em uma presença que não pode ser revertida e que em um músculo lesionado não conseguem iniciar o processo regenerativo e entrar em um estado de senescência completa [70]. Também foi demonstrado que fatores celulares intrínsecos também levam à perda da autorrenovação com o envolvimento da via MAPK [71, 72]. É importante distinguir entre fatores autônomos e não autônomos celulares que interferem com SCs no envelhecimento, uma vez que os não autônomos, como o nicho, podem ser corrigidos com um ambiente jovem [73]um facto que não pode ser corrigido quando o factor é intrínseco à célula [70].
Esta heterogeneidade na população de células estaminais no músculo tem vindo a complicar a identificação, função e nome destas células. Tem havido na literatura uma descrição de outros tipos de células com elevada capacidade miogénica e directamente relacionadas com a regeneração muscular, chamadas células estaminais derivadas de músculo que expressam marcadores distintos [74]. No entanto, é importante notar que houve resultados posteriores indicando que, sem SCs, nenhum outro tipo de célula tem a capacidade de regenerar o músculo [28]. Isto pode ser porque os outros tipos de células estudados não incluíam a população específica descrita por Qu-Petersene colegas [74]ou que a actividade de outros tipos de células tem um requisito de utilização em conjunto com SCs ou com o principal factor SC Pax7 [75]
Além disso, diversas populações de células-tronco derivadas de músculo (MDSC) foram identificadas. Estas populações incluem células progenitoras miogênicas caracterizadas como CD56+, CD34 , CD45 , e CD146 ; CD56+, CD34+, CD144+, CD45 , e CD146 mio-endoteliais; CD56 , CD34 , CD45 , e CD146+ células progenitoras perivasculares; e uma população lateral derivada do músculo com características semelhantes às células estaminais da medula óssea [76]. Com base nas propriedades aderentes e proliferativas, Qu-Petersen e colegas [74] isolaram três populações de células derivadas do músculo. Duas dessas populações, EP (precoce) e LP (tardio), representam as células de satélite; a terceira, que também adere ultimamente, é denominada MDSC e apresenta características geralmente associadas com células progenitoras não comprometidas A população de EP representa a maioria das células obtidas a partir da digestão muscular e se diferencia em mirotubos. No entanto, as células EP têm um potencial regenerativo limitado. A população de LP é responsável por cerca de 1% das células de satélite, mas tem baixas taxas de proliferação e diferenciação. Por outro lado, o MDSC mostrou uma melhor capacidade de auto-renovação e proliferação sustentada e são multipotentes. Assim, o MDSC seria células menos comprometidas e mais promissor para terapias em comparação com células de satélite [74]. 
Outros tipos de células, tais como células estaminais mesenquimais da medula óssea [77–81], células estaminais mesenquimais derivadas de adipose [82–84], células CD133+ [85–87], pericitos/mesoangioblastos [88, 89] e população lateral [90, 91]foram descritos como sendo capazes de participar na formação de Myotube, bem como reabastecer a piscina de satélites. Estas células não estão inicialmente comprometidas com o músculo e não podem expressar o clássico marcador de células de satélite, Pax7. No entanto, são capazes de contribuir para a regeneração muscular quando se fundem com células miogénicas e, adicionalmente, podem transformar-se em células Pax7 que expressam originando novas SCs, o que é um facto que pode contribuir fortemente para a heterogeneidade observada nesta população.
Também é importante notar que foi encontrada evidência de que as células miogênicas são formadas por fusão [78, 92–94] ou transdifferenciação, em que as células se desenvolvem em intrinsecamente miogênicos [95–97]e a heterogeneidade aumentaria pela contribuição de ambas as células que participam no processo de fusão ou por uma célula inicialmente não comprometida com o músculo tornando-se miogênico. Além disso, outros tipos de células podem estar envolvidos na assistência à regeneração muscular, enviando sinais de diferenciação direta de SCs, tais como precursores fibro/adipogénicos [98–100]. É claro, então, que se um tipo de célula se transforma em músculo por fusão ou transdifferenciação ou que o próprio precursor recebe sinais que direcionam a sua proliferação e diferenciação, o resultado final é que todos esses fatores contribuem com a população miogênica sendo heterogênea.
5. As células satélites podem sofrer diferenciação de várias linhas.
Além de seu potencial miogênico, foi descrito na literatura que essas células podem sofrer diferenciação osteogênica e adipogênica, por exemplo. Isso destaca suas propriedades como uma célula-tronco capaz de se diferenciar dentro da linhagem mesenquimal [101-104]. Estudos em ratos mostraram que a heterogeneidade na taxa de proliferação se correlaciona com o potencial de diferenciação, com altos clones proliferativos sendo capazes de se diferenciar em adipócitos [105]. A heterogeneidade morfológica também estava relacionada a um potencial distinto, com células espessas também sendo capazes de sofrer diferenciação osteogênica [63]. A heterogeneidade também na expressão de CD34 foi correlacionada com potencial distinto para passar pela via adipogênica, e apenas as células que expressaram esse marcador foram capazes de sofrer diferenciação adipogênica [106]. Além disso, em camundongos idosos, foi observado que os SCs tendem a ir para a linhagem fibrogênica em vez de manter seu potencial miogênico, o que pode contribuir para a maior fibrose observada em camundongos idosos [69].
6. A balança entre quietude e ativação 
A regeneração do músculo esquelético segue uma série de etapas que recapitulam as fases de desenvolvimento. Primeiro, células progenitoras musculares devem sair do estado de quietude e tornar-se ativo e proliferar. Divisões assimétricas são importantes para fornecer células filhas comprometidas com o programa miogênico (myoblasts) e também células filhas que retornam ao estado quiescente, a fim de repor o pool de células-tronco. Após a proliferação, os mioblastos diferenciam-se e fundem-se para formar miopúbis, que se fundem entre si ou a uma fibra anterior para repará-lo. Finalmente, os mirofibers crescem e amadurecem.
6.1. Mecanismos de quiescência Tal como outros tipos de células estaminais adultas, os SCs são quiescentes até serem activados quando há uma lesão muscular. A manutenção da quiescência é crucial para preservar o SC e é controlada por diferentes mecanismos moleculares, com participação de muitos genes e vias regulatórias. Estudos de microarray mostraram que mais de 500 genes são superexpressos em SCs quiescentes em comparação com mioblastos em proliferação [42]. Os reguladores negativos do ciclo celular estão entre estes genes. Apesar do fato de que todos os jogadores e mecanismos de SCs’ homeostasis não estão sendo totalmente compreendidos, muitos esforços têm sido empregados para retratá-los (Figura 3).
A sinalização de entalhe foi implicada na manutenção da quiescência de SC, bem como na regulação da proliferação e diferenciação, em vários estudos [107–111]. Com efeito, a sinalização de entalhe foi estabelecida como o primeiro regulador de quiescência em células estaminais adultas, uma vez que a interrupção da actividade de entalhe favorece a diferenciação espontânea das células, sem a entrada na fase S [110]. A maior atividade da sinalização de entalhe é vista em SCs quiescentes e é progressivamente reduzida à medida que a célula progride através da diferenciação miogênica. Curiosamente, a sinalização de entalhe de bloqueio prolongado não impede que as células proliferem, mas leva ao esgotamento do SC, demonstrando que é necessário para auto-renovação [110].
Um estudo semelhante mostrou resultados relacionados à perda de sinalização de entalhe por deleção de RBP-J. A ausência de sinalização de entalhe tem pelo menos três efeitos principais: falha na manutenção da quiescência, perda da capacidade de autorregeneração e diferenciação espontânea, sem uma fase de proliferação [108].
A família FOXO de fatores de transcrição regula as piscinas de células estaminais em tecidos adultos. Os níveis de Foxo3 transcrito e proteína são mais elevados em SCs quiescentes do que em ativados. A ablação do gene Foxo3 especificamente em SCs mostrou que este fator de transcrição é importante para o retorno do SC à quiescência e auto-regeneração. As células negativas FOXO3 são mais proliferativas e se diferenciam mais rapidamente, enquanto a superexpressão do Foxo3 suprime a entrada no ciclo celular e reprime a diferenciação terminal [112]. Este trabalho também liga FOXO3 à sinalização de entalhe: FOXO3 regula a expressão do receptor NOTCH1 e NOTCH3, ativando a sinalização de entalhe e, assim, promove a quiescência em SCs
Os MicroRNAs são intervenientes significativos na regulação da expressão genética, incluindo genes relacionados com as funções das células estaminais, e a sua actividade na regulação dos SCs foi recentemente explorada. Foi demonstrado que o Mir-489 é altamente expresso em SCs quiescentes e é desregulado à medida que se tornam ativados. Um alvo de Mir-489 é dek, um oncogene, cujos níveis de mRNA e proteína são mais elevados em SCs ativados doque em SCs quiescentes. Nas SCs, dek promove a proliferação após a ativação; células dek-positivas estão comprometidas com a diferenciação miogênica e células dek-negativas são auto-renováveis [113].
Outra Mirna envolvida na quiescência SCs é Mir-31. Embora a maioria dos EC no tecido adulto tenha o gene Myf5 ativado [48], eles não necessariamente se diferenciam, o que implica que um mecanismo deve existir para prevenir a tradução do Myf5 mRNA antes do momento apropriado. Esta repressão é realizada pelo Mir-31, que tem uma maior expressão em SCs quiescentes; tem como alvo Myf5 mRNA e, em seguida, sequestra-lo em grânulos mRNP. Após a ativação, os níveis de Mir-31 diminuem e Myf5 mRNA é liberado para tradução [114].
A quiescência dos SCs também é estabelecida pela decadência do RNAm. Hausburg e colegas mostraram que a transcrição de Myod é conduzida ao decaimento de mRNA, impedindo que o SC prossiga no programa miogênico. Isto é conseguido pela ação da proteína tristetraprolina (TTP) que se liga ao mRNA, impedindo que seja traduzida e, além disso, regulando sua deterioração [115]. Todos estes mecanismos de regulação pós-transcripcional parecem ser um pouco redundantes e parecem actuar de uma forma subpopulacional específica; no entanto, são necessários mais estudos para clarificar todos os mecanismos envolvidos na manutenção da quiescência e para definir se são comuns a todos os SCs.
6.2. Mecanismos de Ativação e Proliferação Quando o músculo sofre uma lesão, os EC devem ser ativados, começando a proliferar e diferenciar para reparar e/ou formar novas fibras musculares. A ativação do SC é um processo transitório regulado em diferentes níveis. Como o Notch inibe a via de sinalização p38α/β MAPK em estágio quiescente [116], esta é a primeira via a ser ativada [117], resultando na expressão de Myod e consequente entrada no ciclo celular. As fibras danificadas liberam muitos fatores de crescimento que induzem a ativação de vias de sinalização relacionadas ao ciclo celular, como TNF-α, HGF e FGF [118–120]. A transição da fase G1 para a fase S é conseguida através da activação da via ERK1/2 por Fgf2 [121]. Outra via de sinalização MAPK envolvida na progressão do ciclo celular SC é o JNK [122].
A intensa proliferação celular é importante para a reparação muscular, mas tem de ser limitado e o destino de cada célula filha deve ser determinado terminalmente diferenciar ou voltar à quiescência. A sinalização de Wnt/β-catenina é ativada temporalmente durante a regeneração, mas posteriormente regulada para limitar a resposta regenerativa [123]. A sinalização de Wnt/β-catenina também está envolvida na promoção da diferenciação miogênica. O tratamento de SCs com Wnt3a promove a parada do ciclo celular, ativação da miogênio e expressão da folilistatina, promovendo a fusão do mioblasto e diferenciação terminal [124]
A sinalização JAK-STAT é outro player na regulação da função SC, especialmente no músculo envelhecido, em que a ativação Stat3 interfere no MyoD para promover a diferenciação do mioblasto [125]. A sinalização JAK-STAT aumenta progressivamente com a idade ou doença. A inibição transitória do Jak2 e Stat3 em músculos idosos e distróficos aumenta a expansão do SC e melhor regeneração muscular [126, 127].
6.3. Saída do Ciclo Celular Para sair do ciclo celular, é necessário melhorar a regulação dos inibidores das quinases dependentes de ciclina. O retorno à quiescência requer , enquanto a progressão através da miogênese requer a upregulation de , e P57 [50, 128, 129]. Sprouty1 (Spry1) é um receptor de inibidor de sinalização da tirosina quinase expresso em células quiescentes Pax7+, mas regulado para baixo em mioblastos em proliferação. Quando as células Pax7+ regressam à quiescência, a Spry1 é novamente induzida, promovendo a saída do ciclo celular através da inibição da via ERK [130].
6.4. Divisões Assimétricas e auto-renováveis A assimetria das células filhas, ou seja, a segregação de diferentes fatores determinantes, determinará se eles se diferenciam ou se auto-regeneram. Os fatores determinantes miogênicos Myf5, MyoD e Myog têm expressão assimétrica nas células filhas [48, 131, 132]. O MyoD é distribuído em células Pax7 comprometidas e as células Pax+/MyoD se auto-renovam [133]. Para Myog, o mesmo é observado: a linhagem miogênica é Pax7 /Myog+ e as células reservatórios são Pax7+/Myog [134]. A distribuição do modelo de DNA também é assimétrica: o modelo antigo vai para a célula filha que expressa Pax7, a célula reservatório, e o novo modelo de DNA para aquele que expressa Myog [134].
Em SCs Myf5-negativos, aqueles comprometidos com a renovação do pool de células-tronco, o receptor Notch3 é enriquecido, enquanto Myf5-positivo células recebem o ligante de entalhe delta1 [48]; em células Myog-positivo há também a presença de numb, um antagonista do entalhe [107]. Todos estes achados estão relacionados ao papel da sinalização de entalhe na manutenção da quiescência, como discutido acima
7. Células Satélites no Contexto das distrofias Musculares
Diferentes hipóteses e mecanismos são propostos para explicar a degeneração muscular que ocorre em pacientes portadores de mutações em um grande número de genes importantes para a estrutura muscular e função. Como o músculo distrófico é persistentemente ferido, o processo regenerativo é ativado consistentemente, recrutando células de satélite em taxas mais elevadas do que no tecido normal. No entanto, no músculo distrófico, a regeneração não está completa e há uma substituição progressiva do músculo pelo tecido fibroadiposo. Assim, a capacidade das células estaminais para reparar o músculo não é suficiente para compensar a degeneração.
Três cenários foram propostos para explicar esta capacidade regenerativa limitada.
Primeiramente, os ciclos repetitivos da replicação conduziriam SCs ao senescence, devido ao encurtamento do telômero. A presença de telômeros encurtados foi observada em pacientes com DMD (distrofia muscular de Duchenne) e LGMD2C (distrofia muscular de cintas dos membros tipo 2C) [137, 138] e em camundongos Dmdmdx [139]. Os ratinhos Dmdmdx sem actividade telomerase desenvolvem um fenótipo mais fiel à distrofia muscular em seres humanos, incluindo um agravamento com o envelhecimento [140]. No entanto, isto é controverso, uma vez que outro estudo não pôde detectar um encurtamento significativo do telómero [141].
Em segundo lugar, a diferenciação não poderia ser adequada. Estudos precoces mostraram que os mioblastos de pacientes com DMD demoram a se fundir e apresentam diferenciação anormal [142,143]. Em alguns tipos de distrofia muscular, o gene mutado não é expresso em SCs e, portanto, não influencia diretamente na sua função [144].
No entanto, há também provas de que a mutação primária em si pode prejudicar a função do SC, reduzindo o seu número e causando uma senescência prematura, implicando os SC diretamente envolvidos no mecanismo da doença [145]. Alterações nas vias de sinalização também estão subjacentes ao potencial regenerativo das SCs. Em um camundongo-knock-in condicional em que a sinalização Notch é bloqueada em SCs, o músculo desenvolve um típico fenótipo distrófico com regeneração prejudicada [146]. As SCs deste rato mostraram reduzida ativação e proliferação, mas maior diferenciação, corroborando os estudos anteriores sobre o papel da sinalização de entalhe na manutenção da quiescência [146]. No mouse Dmdmdx, a sinalização do entalhe é atenuada, o que diminui a auto-renovação do SCs; e a ativação constitutiva do Notch recuperou a capacidade auto-renovável, mas isso não é suficiente para melhorar a regeneração, provavelmente devido à inibição de MyoD e miogénio [111].
Distrofina é expressa em mioporos diferenciados, mas não em myoblasts proliferando; assim, acreditava-se que também não foi expressa em células de satélite. No entanto, um artigo recentemente publicado mostrou elegantemente que a distrofia é de facto expressa por células de satélite e que ela desempenha um papel essencial na regulação da sua polaridade e divisãoassimétrica. Na ausência de distrofina, há uma redução no número de divisões assimétricas e mais divisões anormais, o que leva a uma diminuição na quantidade de progenitores miogênicos e, portanto, uma falha na regeneração muscular [147]. Este trabalho acrescenta um papel importante para a disfunção de células de satélite na fisiopatologia do DMD, que tem implicações diretas para as terapias.
Terceiro, o nicho distrófico não é favorável à regeneração. No modelo de camundongo de distrofinganopatia Largemyd, um número maior de SCs foi encontrado em fibras isoladas recentemente, relacionadas ao rato de controle [148]. Enquanto os SCs permaneciam ligados às fibras, a sua capacidade proliferativa era reduzida, mas após o isolamento total proliferavam e diferenciavam-se em níveis comparáveis ao controlo normal, indicando um papel importante do nicho na função das células estaminais [148].
Neste modelo de camundongo, a lâmina basal composta por excesso de fibronectina e colágeno atua como um obstáculo à proliferação adequada do SC. Este trabalho contradiz um anterior que sugeria que, uma vez que o SC também exprime distrofia, o defeito de glicosilação também afetaria a sua função, prejudicando a regeneração [149]. Embora uma publicação recente reforce que a capacidade regenerativa não é afectada nos músculos com deficiência de glicosilação, a incapacidade de superar a degeneração está mais relacionada com o esgotamento da capacidade regenerativa devido à degeneração excessiva e progressiva que ocorre em distrofias musculares do que com um defeito inerente na própria função SC [150]. Ao testar os efeitos da irradiação e das miotoxinas no enxerto dos SCs dadores em ratos nude Dmdmdx, verificou-se que, quando o pool de SC hospedeiro ainda está preservado, o enxerto é pobre; pelo contrário, quando o pool SC do hospedeiro é incapacitado pela irradiação, mas o nicho de células estaminais é preservado, a célula dadora é capaz de repovoar e regenerar o músculo [151]. Boldrin et al. investigaram o potencial regenerativo de SCs isolados de camundongos Dmdmdx jovens e velhos. Descobriram que tanto os SCs jovens como os idosos são capazes de regenerar o músculo do Dmdmdx nu jovem pré-irradiado, reforçando a noção de que a função SC é preservada e que o ambiente distrófico, em vez de um defeito inerente, influi negativamente nela [152]. A principal mensagem desses trabalhos é que, para futuras terapias celulares, será interessante capacitar o pool de células-tronco hospedeiras, bem como a preservação/melhoria de um nicho funcional, para obter resultados bem-sucedidos.
Um importante estudo realizado em vários modelos animais também deu uma visão de como as células de satélite são reguladas em um contexto de distrofias musculares [153]. No modelo SJL/L do rato para a distrofia muscular tipo 2B das cintas dos membros, os níveis de MyoD e Myf5 foram regulados, o que indica que neste animal as células dos satélites permanecem quiescentes, o que é esperado uma vez que a histopatologia deste animal não mostra nenhuma evidência do processo de degeneração e regeneração. Este mesmo downregulation foi encontrado no animal Largemyd, o que é consistente com resultados anteriores que mostra que a mutação neste animal poderia interferir com o funcionamento de células de satélite e auto-renovação [149]. Por outro lado, os modelos animais Dmdmdx e Lama2dy-2J/J, os modelos para distrofia muscular congênita tipo 1A, mostraram níveis de expressão aprimorados de MyoD e Myf5, indicando que nestes modelos as células de satélite são ativadas, que é consistente com a presença de áreas de regeneração na sua histologia.
8.. Terapias
Desde a identificação das células-tronco, a terapia mais promissora para doenças de perda de massa muscular tem sido a terapia celular. O primeiro transplante de mioblastos foi realizado no final da década de 1970, quando foi demonstrado que os mioblastos doadores eram capazes de se fundir nas miofibras hospedeiras [154]. Uma década depois, a demonstração de que os mioblastos doadores restauraram a expressão de distrofina nas miofibras Dmdmdx [155] abriu o precedente para muitos ensaios clínicos em seres humanos [156-163]; no entanto, os resultados não foram satisfatórios, principalmente pelo reduzido potencial regenerativo dos mioblastos, uma vez que são mais comprometidos e diferenciados em comparação aos SC. Miofibras inteiras podem ser enxertadas no músculo hospedeiro, onde os SC ligados às miofibras doadoras contribuem para a regeneração muscular [46]. As vantagens do transplante de miofibra são as seguintes: é necessário um enxerto máximo, um número mínimo de células e as células são transplantadas juntamente com seu nicho, embora não sejam fáceis de aplicar nas clínicas [164]. Os SC isolados por citometria de fluxo foram transplantados em camundongos DMmdmdx e foi observado que eles enxertaram nos músculos e também contribuíram para o compartimento do SC, mas se as células foram cultivadas antes do transplante, seu potencial regenerativo foi reduzido [165]. O transplante de um único CE que expressa luciferase ajudou a verificar o fato de que ele pode se auto-renovar e diferenciar, demonstrando a relevância de uma cuidadosa seleção de qual célula usar, dada a alta heterogeneidade da população [166]. Tomados em conjunto, os estudos sobre isolamento direto e transplante de SCs mostram as vantagens da exigência de um número baixo de células, enxerto eficiente e o repovoamento do nicho hospedeiro com novos SCs; em contraste, a migração de células transplantadas é limitada, apenas um pequeno número de células é isolado e elas não podem ser mantidas por um longo período in vitro [164]. Portanto, o uso de células progenitoras como as SCs é mais promissor com a vantagem de também reabastecer o pool de células-tronco com a possibilidade de uma resposta sustentada. No entanto, o uso dessas células em terapia ainda não é uma realidade e muitos desafios ainda precisam ser superados. Isso inclui a seleção da subpopulação mais adequada, condições ideais de cultura e modulação das vias de sinalização que controlam a quiescência, a auto-renovação e a entrega das células. A escolha entre injeções sistêmicas e locais deve considerar características específicas de cada doença, como a gravidade da doença e o número e tamanho dos músculos afetados. Ainda assim, ambas as estratégias têm suas limitações e problemas, incluindo retorno ao lar, enxerto e sobrevivência a longo prazo. Assim, considerando todos os aspectos a serem tratados e a divergência entre os resultados in vitro e in vivo, a combinação de diferentes estratégias seria mais promissora.
9. Conclusão do processo
As células satélites são o primeiro em linha para a regeneração muscular, e por isso eles são o alvo mais promissor em uma terapia baseada em células para distúrbios de perda muscular. Como mostrado ao longo desta revisão, eles têm inúmeras vantagens, como fácil identificação, auto-renovação e diferenciação miogênica, que é bem compreendido, e já foram testados em um contexto terapêutico. No entanto, muitas questões continuam por responder e esta revisão teve como objetivo explorar alguns aspectos possíveis que poderiam ser considerados para alcançar uma terapia celular eficiente.
No início, deve-se considerar a heterogeneidade desta população, como a escolha das que possuem melhor capacidade de autorrenovação para repor a piscina em um músculo lesionado ou aquelas que poderiam ser mais propensas à diferenciação. Além disso, uma vez que SCs de diferentes músculos ou fibras podem ser distintos, é importante considerar estes aspectos, a fim de tratar um grupo muscular específico, por exemplo. O processo de quiescência e ativação é também um aspecto que deve ser considerado, uma vez que pode ser regulado e utilizado, por exemplo, para ativação direta de células residentes. Finalmente, com estudos prévios sobre distrofias musculares e terapias, é possível aprender sobre condições de cultura ideais e melhores maneiras de entregar células, por exemplo.
É importantenotar que uma questão relativa à nomenclatura de diferentes tipos de células de satélite pode complicar a interpretação e comparação de dados entre estudos, uma vez que diferentes termos são por vezes utilizados pelos autores para o mesmo tipo de células, ou as diferentes células são referidas com a mesma nomenclatura geral. É possível, portanto, que os autores estão lidando com as mesmas entidades, mas nomeá-los de forma diferente. Assim, seria útil que a comunidade científica encontrasse um consenso sobre a diversidade das várias populações de células estudadas.
É ainda necessário ultrapassar grandes obstáculos, como a ampla distribuição dos músculos esqueléticos no interior do corpo e o efeito de defeitos genéticos nas células residentes; no entanto, esta revisão propõe que o conhecimento da biologia básica das células de satélite pode contribuir para o desenvolvimento de novas terapias baseadas em células.