Atividade Assíncrona 3

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Atividade Assíncrona Individual 3 
 
Quantificação 
 
 
 
 
Olá 
	
Assista aos vídeos indicados abaixo, leia o capítulo do livro 
Nelson, David L.; Cox, Michael M.; Lehninger, Albert Lester - 
Princípios de bioquímica de Lehninger https://bit.ly/2AF2jFi e 
responda aos questionários sobre o conteúdo 
 
		
 
QUANTIFICAÇÃO	DE	 SUBSTÂNCIAS	A	 PARTIR	DE	PRINCÍPIOS	BÁSICOS	DA	
ESPECTROFOTOMETRIA.	
	
Ø Referencial	teórico:	
	
Quando	 vamos	 estudar	 fenômenos	 bioquímicos	 quase	 sempre	 nos	
deparamos	 com	 a	 necessidade	 de	 sabermos	 a	 quantidade	 de	 alguma	molécula	
em	 nosso	 objeto	 de	 estudo.	 Seja	 para	 saber	 a	 quantidade	 de	 agrotóxico	
acumulado	nas	raízes	de	uma	planta	bioindicadora,	ou	até	mesmo	para	examinar	
a	 quantidade	 de	 colesterol	 no	 sangue	 de	 algum	 paciente,	 vamos	 precisar	 de	
técnicas	capazes	de	quantificar	estas	substâncias	no	meio	em	que	elas	estão.	Um	
dos	 exemplos	 mais	 comuns	 são	 as	 técnicas	 que	 se	 utilizam	 de	 propriedades	
físicas	de	absorção	de	luz	de	algumas	substâncias	como	a	espectrofotometria.	
A	questão	 é	que	 todas	 as	 substâncias	 são	 capazes	de	 interagir	 com	energia	
eletromagnética	 como	 é	 o	 caso	 da	 luz.	 Afinal,	 é	 por	 causa	 dessa	 interação	 que	
nossos	 olhos	 são	 capazes	 de	 “ver”.	 Quando	 a	 luz	 atravessa	 determinada	
substância	 parte	 da	 energia	 dela	 é	 absorvida	 (chamamos	 de	 absorbância).	
Porém,	cada	substância	absorve	em	um	comprimento	de	onda	(λ)	específico	e	de	
acordo	 com	 sua	 estrutura	molecular.	 Então	 se	 emitirmos	 um	 feixe	 de	 luz	 com	
comprimento	 de	 onda	 específico	 em	 uma	 substância	 que	 absorve	 naquele	
comprimento,	 parte	 da	 intensidade	 deste	 feixe	 é	 absorvido	 pelas	 moléculas	 e	
parte	atravessa	a	solução	(chamamos	de	transmitância).	Quer	dizer	que	quanto	
maior	a	quantidade	de	moléculas	daquela	 substância,	maior	 será	a	 intensidade	
de	luz	absorvida	e,	consequentemente,	menor	a	intensidade	que	atravessa.	Esta	é	
uma	lógica	bem	familiar	para	nós	na	verdade,	fazemos	isso	por	exemplo	quando	
olhamos	 para	 a	 água	 de	 um	 lago.	 Quanto	 maior	 a	 intensidade	 do	 marrom	 e	
menos	 pudermos	 ver	 através	 da	 água	 dizemos	 que	 há	 maior	 quantidade	 de	
matéria	orgânica	em	suspensão	ali.	Porém,	para	realizarmos	estudos	científicos	
utilizamos	 aparelhos	 bem	mais	 sensíveis	 e	 precisos	 que	 nossos	 olhos.	No	 caso	
das	próximas	aulas	o	aparelho	que	vamos	utilizar	é	o	espectrofotômetro	(figura	
1).																																													
Nesta	aula	trabalharemos	com	a	seguinte	molécula:		
	
	
O	azul	 de	 bromofenol	(ou	3,3,5,5-tetrabromofenolsulfonftaleína2	3	)	 é	
um	corante	utilizado,	 dentre	 outras	 coisas,	 para	 monitorar	 a	migração	de	
moléculas	em	experimentos	com	fragmentos	de	DNA.	O	azul	de	bromofenol	atua	
como	indicador	 de	 pH	que	 vira	 entre	 o	pH	3,0	 e	 4,6	 de	amarelo-azul	para	
violeta,	respectivamente.	A	reação	responsável	pela	mudança	de	cor	é	totalmente	
reversível.	
	
	
Azul de Bromofenol (indicador de pH) 
pH abaixo de 3,0 
 
pH acima de 4,6 
amarelo 
 
púrpura 
 	
 
 
 
 
 
PARTE	I	–	DESCOBRINDO	COMPRIMENTO	DE	ONDA	(λ)	DE	ABSORÇÃO	
Ø Objetivo:	Determinar	o	espectro	de	absorção	do	azul	de	bromofenol	em	
diferentes	pHs,	
	
Ø Material	e	métodos:	
	
Material:	
	
• Solução	de	azul	de	bromofenol	pH	<	3,0	
• Solução	de	azul	de	bromofenol	pH	>	4,6	
• Placa	de	96	poços.	
	
Procedimento:	
	
1. Pipete	200	µL	de	cada	solução	em	um	poço	da	placa	conforme	indicado	na	
imagem	abaixo	(pipete	3x	para	cada	solução	-	triplicata).	
Fig.	1.	Estrutura	da	molécula	
de	azul	de	bromofenol.	
Figura	1.	Exemplo	de	funcionamento	de	um	
espectrofotômetro.	
2. Lembre-se	de	pipetar	um	poço	com	água	destilada	como	poço	branco.	
3. Proceda	para	a	leitura	no	espectrofotômetro	(chame	um	monitor	para	
auxiliar	na	configuração	do	aparelho).	
4. Realize	a	leitura	na	opção	de	espectro	na	faixa	de	400	a	750	nm	e	anotar	o	
pico	de	absorção	para	cada	pH.	
			
Pipetagem:	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
 
 
 
 
 
 
 Resultado ( os valores são os valores médios das três leituras independentes) 
 Comprimento 
de onda (nm) 
370 400 430 460 490 520 550 580 610 630 660 
H2O 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,11 0,10 
H2O 0,12 0,12 0,13 0,11 0,10 0,10 0,11 0,10 0,12 0,10 0,10 
H2O 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,11 
 
< 3,0 0,310 0,500 0,694 0,610 0,410 0,310 0,280 0.210 0,191 0,193 0,190 
< 3,0 0,315 0,505 0,690 0,613 0,400 0,315 0,295 0.216 0,190 0,198 0,190 
< 3,0 0,310 0,500 0,695 0,610 0,420 0,310 0,290 0.212 0,197 0,190 0,195 
 
> 4,6 0.210 0,280 0,317 0,400 0,450 0,500 0,520 0,620 0,632 0,650 0,510 
> 4,6 0.215 0,285 0,310 0,400 0,440 0,500 0,516 0,605 0,634 0,645 0,505 
> 4,6 0.210 0,290 0,313 0,400 0,460 0,500 0,510 0,600 0,630 0,650 0,500 
 
	
• Desconte	a	média	dos	valores	de	absorbância	dos	poços	branco	de	
todos	outros	pontos	da	curva.	
• Faça	média	das	triplicatas.	
• Elabore	um	gráfico	contendo	as	duas	curvas	onde	o	eixo	y	é	a	média	
das	absorbâncias	e	o	eixo	x	os	valores	de	leitura		
	
Comprimento	de	absorção	máxima	do	az.	de	bromofenol	pH	<	3,0:	______________	
Comprimento	de	absorção	máxima	do	az.	de	bromofenol	pH	>	4,6:	______________	
Inclua seus gráficos no relatório da atividade 
	
	
	
PARTE	II	–	OBTENÇÃO	DA	CURVA	DE	DILUIÇÃO	DO	AZUL	DE	BROMOFENOL	
	
Ø Objetivo:	Correlacionar	a	quantidade	de	uma	substância	com	o	aumento	
na	absorção	de	luz.	
	
Ø Material	e	métodos:	
	
Material:	
	
• Microtubos	de	plástico.	
• Solução	de	azul	de	bromofenol	pH	<	3,0	
• Solução	de	azul	de	bromofenol	pH	>	4,6	
• Placa	de	96	poços.	
	
Procedimento:	
	
1. Enumerar	duas	séries	de	microtubos	de	1	a	7	(uma	para	cada	pH	de	azul	
de	bromofenol).	
2. Adicionar	700	µL	de	água	destilada	em	cada	microtubo	
3. No	microtubo	1	manter	apenas	água	para	servir	como	branco.	
4. Coloque	700	µL	de	azul	de	bromofenol	no	tubo	2	e	agite	até	misturar	bem.	
5. Retire	700	µL	do	tubo	2	e	coloque	no	tubo	3.	Agite	até	misturar	bem.	
6. Repita	sequencialmente	o	processo	de	diluição	seriada	para	os	demais	
microtubos.	(do	3	para	o	4	e	assim	por	diante).	
7. Ao	final	transfira	200	µL	de	cada	tubo	para	os	poços	da	placa.	Faça	em	
triplicata.	
8. Realize	a	leitura	de	cada	solução	nos	comprimentos	de	onda	
correspondentes	ao	experimento	anterior.	
	
							Pipetagem:	
 
 
Resultados 
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 
< 3,0 0,10 0,550 0, 275 0,130 0,078 0,030 0,021 
< 3,0 0,10 0,560 0, 270 0,140 0,068 0,040 0,020 
< 3,0 0,10 0,555 0, 280 0,137 0,058 0,034 0,022 
 
> 4,6 0,12 0,425 0,215 0,115 0,055 0,022 0,015 
> 4,6 0,12 0,430 0,210 0,100 0,050 0,030 0,012 
> 4,6 0,12 0,420 0,212 0,105 0,051 0,040 0,014 
 
Ø Análise	dos	resultados:	
	
• Desconte	a	média	dos	valores	de	absorbância	dos	poços	branco	de	
todos	outros	pontos	da	curva.	
• Faça	média	das	triplicatas.	
• Elabore	um	gráfico	contendo	as	duas	curvas	onde	o	eixo	y	é	a	média	
das	absorbâncias	e	o	eixo	x	os	valores	de	leitura		
• 	Para	o	experimento	II		utilize	as	diluições	na	construção	do	gráfico	ex.	
ponto	2	=	100%	ou	1,	ponto	3	=	50%	ou	0.5,	e	assim	por	diante		
 
Inclua seus gráficos no relatório da atividade 
 
Questionário 
1)	Quais	os	princípios	básicos	de	espectrofotometria?	
	
2)	O	que	é	a	lei	de	Lambert-Beer?	
	
3)	Qual	a	diferença	entre	quantidade	e	concentração?	
	
4)	Qual	a	diferença	entre	fotometria	e	espectrofotometria?	
	
5)	Como	podemos	correlacionar	o	tamanho	dos	picos	de	absorção	encontrado	no					
experimento	I	com	a	diferença	das	curvas	de	diluição	do	experimento	II?	
	
6)	As	condições	do	ambiente	podem	alterar	a	absorção	de	luz?	Como?	
	
 
 
 
Vídeos sugeridos : 
1) Princípios da colorimetria -https://www.youtube.com/watch?v=noUSORH5JWo 
2) Encontrando a concentração de uma solução usando colorimetria, em ingles-
https://www.youtube.com/watch?v=rdY41FPI9iE 
3) Funcionamento e demonstração do espectrofotometro, em inglês -
https://www.youtube.com/watch?v=xHQM4BbR040 
4) Introdução à espectrofotometria- 
https://www.youtube.com/watch?v=F5dCva8fnDg&t=718s 
 
5) O que é espectrofotometria? | JORGE SANTOS | IT'S FARMA - 
https://www.youtube.com/watch?v=z5FCyxrFb34