Protocolo Experimental

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RENATA TONCOVITCH DAS NEVES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITOS DO CORANTE AZO VERMELHO 2D NOS 
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E TOXICIDADE INDUZIDA POR 
ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS JOVENS MACHOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2020 
RENATA TONCOVITCH DAS NEVES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITOS DO CORANTE AZO VERMELHO 2D NOS 
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E TOXICIDADE INDUZIDA POR 
ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS JOVENS MACHOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Projeto de pesquisa da disciplina de Nutrição 
Experimental do 3 ano do Curso de Nutrição do 
Centro Universitário Filadélfia. 
 
 Orientadora: Cleusa Wichoski Maier 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2020 
2. RESUMO 
Estudos toxicológicos tem mostrado efeitos negativos referentes ao consumo e 
exposição crônica ou aguda aos corantes alimentares, principalmente os da classe azo, 
além de mostrar genotoxicidade, interações com moléculas sanguíneas, mudanças 
comportamentais, prejuízo na divisão celular, distúrbios hormonais, entre outros. Como 
aponta a literatura, a toxicidade é predominada pelas aminas aromáticas, compostos 
oriundos da degradação dos corantes desse grupo. Entretanto, faltam estudos e normas 
precisas quando ao limite adequado para consumo humano, principalmente do corante 
Vermeho 2G, utilizados em produtos cárneos. Essa pesquisa foi conduzida para avaliar 
o potencial tóxico do corante alimentar Vermelho 2G em diferentes tecidos de ratos 
adultos, como sangue, fígado, rins, baço e tecido adiposo sendo administrada por via 
oral na dose de 300 mg / kg de peso corporal a ratos Wistar machos adultos durante um 
período de 30 dias. A fim de explorar o possível mecanismo envolvido, será feita a 
avaliação do estresse oxidativo a fim identificaram alterações oxidativas críticas em todos 
os órgãos testados, conforme pode ser mostrado pela promoção da peroxidação lipídica 
e pela modificação das enzimas endógenas de defesa antioxidante. Assim, é de 
relevância considerar mais estudos toxicológicos desse corante para adequar a 
regulamentação desses aditivos à realidade, além de contribuir para a saúde dos 
consumidores. 
Palavras-chave: corantes sintéticos, propriedades químicas, toxicologia, estresse 
oxidativo, azo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. COORDENADOR 
Instituição. 
Centro Universitário Filadélfia- Unifil 
Equipe. 
Docente: 
Profª Cleusa Wichoski – Docente do curso de Nutrição do Centro Universitário 
Filadélfia (UNIFIL). Av. JK, 1626 - Colegiado de Nutrição/UNIFIL, (43)99168-6242 – 
cleusa.maier@unifil.br 
 
Discente: 
Renata Toncovitch das Neves – Dicente do curso de Nutrição do Centro 
Universitário Filadélfia (UNIFIL). 
 
4. CURSO 
Curso de Nutrição – 3o ano noturno 
 
5. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
O uso de aditivos para conservação de alimentos ou para proporcionar mudanças 
como de aparência, cor e sabor sempre ocorreu devido às características químicas 
naturais que proporcionam sua deteriorização. Porém, era feita de forma mais natural 
com o emprego de calor ou frio, secagem, aditivos como sal e corantes extraídos de 
urucum, cascas de uvas, entre outros, porém com cores limitadas (CÂMARA, 2017). 
No entanto, na indústria muitos alimentos não apresentam cor originalmente ou sua 
cor natural é alterada ou perdida durante os processos, com isso se viu a necessidade 
de realçar essa coloração tão importante para aumentar a aceitabilidade do produto e na 
escolha na hora da compra (PRADO; GODOY, 2004) 
Assim, com as mudanças econômicas e pela descoberta de métodos de fabricação 
de corantes sintéticos de forma eficaz e barata nos meados do século XX, o uso de 
corantes artificiais para manipular a coloração de alimentos comercializados teve um 
grande crescimento. (BAFANA; DEVI; CHAKRABARTI, 2011). 
mailto:cleusa.maier@unifil.br
Muitos estudos toxicológicos se iniciaram, apontando diversos efeitos negativos ao 
consumo e ao contato dessas substâncias decorrente das suas propriedades químicas 
e da metabolização dos mesmos no organismo humano (DOWNHAM; COLLINS, 2000). 
Porém, há grandes limitações nesses estudos já que a maioria avalia os corantes 
individualmente, porém sabe-se que na indústria eles são usados simultaneamente, 
então os efeitos podem não ser fidegnidos à realidade (CÂMARA, 2017). 
Assim, o uso desses aditivos químicos costuma levantar grandes polêmicas e 
controvérsias entre os consumidores, pesquisadores e governo, já que muitos países 
proibem o seu uso, diferentemente do Brasil que permite os seguintes corantes artificiais: 
Amaranto, Amarelo Crepúsculo, Azorrubina, Ponceau 4R, Vermelho 40, Tartrazina, 
Vermelho 2G, Marrom HT, Litol Rubina BK e Negro Brilhante BN, classificados como Azo 
(BRASIL, 2015) 
Sendo assim, se viu a necessidade de elaborar legislações regulamentadoras do 
seu uso, como tem feito a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) ao 
estabelecer normas que fiscalizam a aplicação e os efeitos toxicológicos, buscando se 
adequar às mudanças tecnológicas e econômicas no país e à garantir o controle sanitário 
dos alimentos. 
Contudo, ainda há restrições nas legislações quanto as quantidades permitidas 
para todos os corantes. O Comitê Misto FAO/OMS de Especialistas em Aditivos 
Alimentares estabeleceu em 1996, a ingestão diária aceitável (IDA ou ADI) de 0 – 7,5 
mg/ kg de peso corporal/ dia e a ANVISA individualizou e regulamentou algumas 
quantidades permitidas para o Brasil com excessão dos corantes Vermelho 2G e Litol 
Rubina BK, encontrados respectivamente em compostos cárneos, como hambúrgueres 
e salsichas, e cascas de queijos (PRADO; GODOY, 2004; CÂMARA, 2017) 
Dito isso, o presente estudo busca investigar os efeitos tóxicos induzidos pela 
administração de corantes da classe azo sem IDA definida pela ANVISA, já que os 
estudos para esses corantes são escassos . Os resultados obtidos poderão elucidar tais 
questões, contribuido para a saúde dos consumidores. 
 
 
 
6. OBJETIVOS 
Objetivo Geral 
Verificar os efeitos tóxicos dos corantes alimentícios azo, com ênfase nas 
substâncias permitidas no Brasil sem IDA definida. 
 
Objetivos Específicos 
Os objetivos específicos do projeto compreendem a determinação do efeito do 
corantes sobre os seguintes parâmetros: 
a) Mensurar peso corporal e peso dos órgãos (baço, fígado e rins); 
b) Amostra de sangue e parâmetros hematológicos; 
c) Avaliar o perfil de gordura e tecido adiposo das regiões subcutânea, mesentérica 
e visceral; 
d) Avaliar o perfil lipídico por meio da análise de triacilglicerol e colesterol total; 
e) Imunofenotipagem de linfócitos de baço por citometria de fluxo; 
f) Marcadores bioquímicos de fígado e rins (creatinina, ácido úrico, ureia e 
enzimas); 
g) Medição de estresse oxidativo por peroxidação lipídica. 
 
7. MATERIAL E MÉTODOS 
7.1 Produtos Químicos 
Será utilizado o corante alimentar Vermelho 2G administrado via oral em até 0,5 x 
LD50, isto é, a dose letal, ou uma dose limite de 2g/ kg. Para definir a dosagem adequada 
de cada aditivo alimentar, Sasaki et al (2002) determinaram LD50 por meio de 
experimentos simples de toxicidade aguda em quatro ou cinco animais. 
 
7.2 Animais 
Serão utilizados 20 ratos machos Wistar, provenientes do Biotério Central do 
Centro Universitário Filadélfia – UniFil, pesando em torno de 130 gramas. Os animais 
serão mantidos em caixas moradia individuais dimensionadas em 65 x 25 x 15 cm, com 
assoalho coberto de maravalha. Os animais serão submetidos ao ciclo claro/escuro de 
12 em 12 horas, onde as luzes permanecerão acesas das 07:30 às 19:30 horas, 
mantidos em temperatura controlada (20 - 24°C) e umidade relativa (66 – 74%). 
 
7.3 Desenho Experimental 
Os animais serão randomizados e divididos em dois grupos de 10 animais cada. O 
primeiro grupo, correspondente ao controle total (CT), receberá ração padrão (AIN 93) e 
água destilada ad libitum durante 30 dias; o segundo grupo, tratado com coranteVermelho 2G (CV), receberá a mesma ração padrão e 300 mg/ kg de peso/ dia de corante 
diluida em água ad libitum (menos de 15% da dose letal - LD50) por via oral durante o 
mesmo período. 
Os animais permanecerão no Laboratório de Nutrição Experimental durante o 
período do experimento, sendo expostos à manipulação para limpeza das caixas-
moradia e para medidas de peso corporal duas vezes por semana para avaliação dos 
dados antropométricos de peso e comprimento dos animais, seu consumo alimentar e 
ingestão hídrica diária. 
Ao final do experimento os animais serão sacrificados pela administração de 
Xilazina e Cetamina via intraperitoneal com doses de 2 mg/kg e 50 mg/kg, 
respectivamente. A dose de anestésico administrada deprime intensamente o SNC, 
permitindo que o sacrifício seja feito sem sofrimento. Após a completa anestesia os 
animais serão pesados e submetidos a laparotomia para evisceração e retirado dos 
orgãos para análise 
 
7.4 Medidas antropométricas 
O controle do peso dos animais será realizado semanalmente, com pesagem em 
balança digital Filizolla com precisão de 0,5g. O ganho de peso será expresso tanto em 
termos absolutos (gramas adquiridas/período) quanto em termos relativos (gramas 
adquiridas/100g de peso inicial/período). Para realização da pesagem dos animais, será 
utilizada caixa de polipropileno na balança, desconsiderando-se o peso da mesma 
através da função “tarar” em seguida, o animal será colocado em seu interior para 
obtenção do peso do animal. 
O ganho de peso absoluto será calculado subtraindo-se da semana em questão o 
peso inicial do rato, sendo assim, o ganho de peso absoluto da semana reflete o ganho 
de peso do animal desde o início do experimento até a semana. O ganho de peso relativo 
será obtido multiplicando-se o ganho de peso absoluto por 100 e dividindo-se o valor 
achado pelo peso inicial do rato, obtendo assim, o ganho de peso da semana 
correlacionado com 100g de peso inicial do animal. 
O crescimento será avaliado durante o experimento através da aferição da medida 
do comprimento naso-anal (cm) para posterior determinação do índice de Lee. 
Os órgãos dos animais serão retirados e pesados em balança digital com precisão 
de 0,005 gramas. Os órgãos e tecidos removidos serão: fígado, rins, baço e tecido 
adiposo das regiões subcutânea, mesentérica e visceral. 
 
7.5 Coleta de soro 
Serão realizadas duas coletas, a primeira após 12 horas de jejum, antes de iniciar 
o protocolo experimental e a segunda ao termino do protocolo, após 12 horas de jejum 
e 24 horas da última sessão de estresse. A amostra será coletada através da pulsão na 
veia lateral da cauda do animal, com auxilio de um dispositivo artificial de contenção. A 
cauda será aquecida com lâmpada ou toalha quente ou imersa em água morna (40 °C), 
para dilatar os vasos, após tal procedimento a cauda será higienizada com álcool 70% 
em uma gaze ou cotonete, para então realizar-se a pulsão. 
 
7.6 Amostra de sangue 
Após o sacrifício, o sangue arteriovenoso será rapidamente coletado e centrifugado 
a 1.000 g por 10 min a 4ºC. Alíquotas de plasma serão armazenadas em 80ºC até o uso. 
 
7.7 Parâmetros Hematológicos 
As amostras de sangue coletadas em tubos de ácido etilenodiaminotetracético 
(EDTA) serão imediatamente analisadas usando um analisador de ensaio hematológico 
automático (analisador de hematologia automática terceirizado) para determinar a 
contagem de glóbulos vermelhos (RBC), concentração de hemoglobina (HGB), 
hematócrito (HT), hemoglobina corpuscular média (MCH), volume corpuscular médio 
(MCV), concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), plaquetas (PLT), 
contagem de leucócitos (WBC), linfócitos, monócitos e granulócitos. 
 
7.8 Perfil lipídico 
As concentrações plasmáticas de colesterol total (TC), colesterol de lipoproteína de 
baixa densidade (LDL), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL) e triglicerídeo 
(TG) serão dosadas por meio aparelhos específicos para teste rápido (monitor de perfil 
lipídico). 
 
7.9 Imunofenotipagem de linfócitos de baço por citometria de fluxo 
O baço será transferido para uma placa de Petri contendo 50 ml de RPMI-1640 e 
picado usando duas lâminas congeladas. A dispersão de tecido centrifugada a 1.200 g 
a 4 ° C por 10 min, e o pellet ressuspenso em 3 ml de lise de RBC contendo 0,83% NH 
4 Cl em tampão Tris 100 mM (pH 7,4) e mantido à temperatura ambiente durante 3 
minutos. As células serão lavadas três vezes com RPMI-1640 e finalmente suspensas 
em 1 ml de meio completo. A fenotipagem das células do baço será feita conforme 
descrito em Kubosaki (2008). 
Suspensão de esplenócitos em RPMI-1640 (1 ± 10 6 células / ml) será lavado com 
PBS e incubado com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 de acordo com as 
instruções do fabricante. Os subtipos celulares podem ser determinados usando 
citômetro de fluxo. 
 
7.10 Marcadores bioquímicos de fígado e rim 
Atividades das enzimas celulares: aspartato transaminase (AST), alanina 
transaminase (ALT), fosfatase alcalina (ALP) e lactato desidrogenase (LDH) serão 
testadas no plasma usando kits de diagnóstico. As atividades enzimáticas expressas em 
unidades internacionais por litro (U/ l). As concentrações de creatinina, ácido úrico e ureia 
também serão avaliadas no plasma. O teor de proteína total e o nível de albumina no 
soro serão determinados espectrofotometricamente de acordo com o método de Biureto 
usando Albumina de Soro Bovina como padrão. Como as proteínas séricas 
compreendem albumina e globulinas, a concentração de globulinas será calculada da 
seguinte forma: concentração de proteínas totais - concentração de albumina, estimando 
a relação albumina / globulina (A/ G). 
 
7.11 Análise Estatística 
Os dados podem ser expressos como média ± média do erro padrão. O teste 
estatístico t-student realizado para encontrar diferença significativa entre as médias 
registradas para os animais controle e tratados. Será utilizado o software “STATISTICA” 
para avaliar se as diferenças são significativas ou não, considerando P < 0,05 
estatisticamente significativo. 
 
8. RESULTADOS ESPERADOS 
Estudos com roedores reportaram a formação de anilina no trato gastrintestinal pela 
azorredução bacteriana em uma taxa considerável, considerando o composto como 
genotóxico in vivo por meio das linhagens bacterianas e sugerindo que o corante atua 
como mutagênico nas bases de DNA e carcinogênico em roedores. Como não houve 
evidências que a formação de tumores não estava relacionada com o metabolismo do 
corante e que um processo similar não iria ocorrer em humanos, o risco a saúde não 
pôde ser descartado, o que determinou o Vermellho 2G banido da Europa, Estados 
Unidos e Japão. 
Entretanto, não foi possível identificar mutagenicidade em camundongos tratados 
oralmente com o corante através de análises com urina e fezes. Por isso, espera-se com 
esse estudo mais evidências sobre a toxididade desse corante específico que ainda é 
pouco difundido, além de contribuir para análise crítica dos consumidores brasileiros. 
 
9. ORÇAMENTO 
 
Quantidade Unidade Descrição Marca Valor (R$) 
1 Pote Corante Vermelho 2D Brascolor 45,00 
1 Aparelho Monitor de perfil lipídico Luna Wellion 250,00 
100 Tiras Teste colesterol Luna Wellion 400,00 
Total 695,00 
Financiamento: os custos do projeto são da própria instituição de pesquisa. 
 
10. CRONOGRAMA 
 
Atividades e responsáveis Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr 
Levantamento Bibliográfico X X 
Aprendizado de 
metodologias e 
procedimentos técnicos 
 X X 
Aprendizado de vias de 
administração 
 X X 
Aprendizado das técnicas 
de laboratório 
 X X X 
Adaptação dos animais às 
instalações 
 X X 
Início do protocolo 
experimental 
 X X X 
Término do protocolo 
eutanásia dos animais 
 X 
Análises e resultados X 
Data prevista de início: 20de agosto de 2020; 
Duração prevista (meses): oito meses 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BAFANA, A.; DEVI, S.; CHAKRABARTI, T. Azo dyes: past, present and the future. 
Environmental Reviews, Ottawa, v. 19, p. 350-370, 28 set. 2011. 
 
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Anvisa disponibiliza 
consolidado da legislação brasileira de aditivos alimentares. Brasília, 2015. 
Disponível em: http://portal.anvisa.gov.br/noticias/-
/asset_publisher/FXrpx9qY7FbU/content/anvisa-disponibiliza-consolidado-da-
legislacaobrasileira-de-aditivos-alimentares/219201/ . Acesso em: 25 de agosto de 
2020. 
 
CÂMARA, A. M. Corantes azo: características gerais, aplicações e toxicidade. 2016. 
60 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Nutrição) – Curso de Nutrição, 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2017. 
 
CHUNG, K. T. The significance of azo reduction in the mutagenesis and carcinogenesis 
of azo dyes. Mutation Research, Amsterdam, v. 114, p. 269–281, 1983. 
 
DOWNHAM, A.; COLLINS, P. Colouring our foods in the last and next millennium. 
International journal of food science & technology, v. 35, n. 1, p. 5-22, 2000. 
 
GOLLI, N. E.; et al. Toxicity Induced after Subchronic Administration of the 
Synthetic Food Dye Tartrazine in Adult Rats, Role of Oxidative Stress. Recent 
Advances in Biology and Medicine, v. 2, p. 20-28, 2016. 
 
PRADO, M. A.; GODOY, H. T. Determinação De Corantes Artificiais Por 
Cromatografia Líquida De Alta Eficiência (Clae) Em Pó Para Gelatina. Quim. Nova, 
Vol. 27, No. 1, 22-26, 2004. 
 
SASAKI, Y. F.; et al.. The comet assay with 8 mouse organs: results with 39 currently 
used food additives. Mutation Research, 519, p. 103–119, 2002.