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Relatório Final - Iniciação Científica em Imunogenética UFPR

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(ITIM) em roxo, e receptores ativadores (ITAM) em laranja, com os seus respectivos ligantes.
MATERIAIS E MÉTODOS
AMOSTRAS
Os casos utilizados no trabalho são pacientes do Hospital Central de Câncer Erasto Gaertner (HCCEG) com diagnostico histopatológico confirmado de neoplasia intraepitelial cervical de grau II (NIC II) e III (NIC III), e os controles incluem mulheres não portadoras de NICs, selecionadas randomicamente em campanhas de prevenção ao câncer cervical do HCCEG. Todos os indivíduos da coorte tiveram 10mL do sangue periférico coletados através de punção venosa. Casos e controles foram coletados no mesmo período (2010 a 2012), e todas as mulheres incluídas neste estudo assinaram um termo de consentimento. O estudo está aprovado pelo comitê de Ética e Pesquisa em seres Humanos do Hospital Erasto Gaertner sob o número 1943/2009. 
GENOTIPAGEM
As amostras foram genotipadas através do método PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probes), que se baseia na amplificação do DNA amostral e sua hibridização com sondas de oligonucleotídeos sequência-específicas (XAVIER, 2012). Os resultados obtidos nas análises laboratoriais, foram apresentados em teses e dissertações desenvolvidas no Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade (LIGH), do departamento de Genética-UFPR. 
O gene HLA-C foi genotipado por Marina Bárbara de Souza Xavier e os resultados foram apresentados em sua tese de mestrado (XAVIER, 2012), enquanto que o gene HLA-B foi tipado pela doutoranda Patrícia Pinho França, que apresentou os resultados na sua tese em 2012 (FRANÇA, 2012). 
Para aumentar o tamanho amostral, também foram utilizados 27 controles tipados para os genes HLA-C e HLA-B pelo método NGS (Next Generation Sequencing), cedidas por colaboração com o Dr. Danilo Gardenal Augusto (University of California, San Francisco). 
Os dados brutos, obtidos através do processamento laboratorial pelo método PCR-SSOP (XAVIER, 2012; FRANÇA, 2012), foram recuperados no banco de dados do LIGH-UFPR e passaram por uma nova análise computacional no Software HLA Fusion versão 4.3, cuja função é analisar as combinações de sondas positivas para a amostra e fornecer as possibilidades de combinações alélicas (genótipo). Foram analisadas computacionalmente 302 amostras de HLA-B (159 casos e 143 controles) e 410 de HLA-C (203 casos e 207 controles) em alta resolução, ou seja, quatro dígitos. 
	Levando em conta que o HLA Fusion oferece uma gama de possibilidades de genótipos, foi necessária seleção de genótipo entre os possíveis. Para tanto. Foram utilizados os critérios descritos a seguir. No caso de amostras genotipadas pelas técnicas PCR-SSOP e NGS, foi utilizada a genotipagem obtida por NGS, por ser um método mais sensível. Amostras genotipadas para HLA-C e HLA-B (n= 215) foi verificado o desequilíbrio de ligação entre as variantes alélicas dos dois genes, para encontrar possíveis discrepâncias na genotipagem e verificar qual o haplótipo mais provável entre as possibilidades genotípicas obtidas. A análise baseada no desequilíbrio de ligação foi feita utilizando a tabela Haplotype Frequencies do National Marrow Donnor Program (NMDP), e a ferramenta de busca de haplótipo do website The allele Frequency Net Database (AFND), que levam em conta a frequência em que as variantes alélicas são herdados juntos. No restante das amostras o alelo mais frequente, indicado pelo HLA Fusion, foi considerado. Amostras com ambiguidade alélica, ou cuja aferição de alelo não foi possível pelos meios utilizados, foram utilizadas apenas na análise de grupos ligantes KIR.
	Para a definição de C1/ C2 e Bw4/ Bw6 (T/I), foi necessário identificar em cada amostra, no Software HLA Fusion, qual(is) sonda(s) foi positiva na posição 80, e qual o aminoácido contemplado pela sonda. Na análise do HLA-C as sondas que contemplavam a posição 80 da cadeia poderiam representar uma Asparagina (N), indicando que a amostra possuía um ligante C1, ou uma Lisina (K), indicando um ligante C2 (Quadro 1). 
Quadro 1 Sondas que hibridizam com a posição 80 do HLA-C e o aminoácido correspondente.
	Sonda Hibridizada
	Aminoácido da posição 80
	#007 (C413) : 75-VS-RN—82
	Asparagina (N)
	#015 (B116) : 79RN---83
	Asparagina (N)
	#019 (C414): 80K---83
	Lisina (K)
	#020 (C412): 75-V--RK-81
	Lisina (K)
	#063 (C602G): [32---Q---38 + 77--RK-81]
	Lisina (K)
	#097 (C759G) : [65Q-Y-RQ70 + 77--RK-81]
	Lisina (K)
	#507 (C413): 75-VS-RN—82
	Asparagina (N)
	#515 (B116) : 79RN---89
	Asparagina (N)
Fonte: HLA Fusion Versão 4.3
Aminoácidos destacados em negrito correspondem à posição 80
	Já na análise do HLA-B, além das sondas da posição 80, também foram consideradas as da posição 81, 82 e 83, de modo a definir Bw4 pelos epítopos IALR, TLLR, ou TALR nos resíduos 80-83, (BAO et al, 2018), e categoriza-los em Bw4 80I, Bw4 80T, ou Bw6 pela ausência dos epítpos citados.	Nem todas as sondas de HLA-B possuíam os aminoácidos da posições 80-83 claramente no HLA Fusion, alguns aminoácidos são representados pelo hífen (-), nesses casos foi necessário fazer o alinhamento de todas as possibilidades alélicas da sonda. O alinhamento foi feito com auxílio da ferramenta Allign do IPD-IMGT/ HLA 3.41.0, e nele foi possível definir qual aminoácido a sonda estava representando (com exceção da sonda 526) (Quadro 2). Amostras que positivaram para a sonda 526 (n= 76 casos e 84 controles), ou que foram genotipados por NGS (n= 27 controles), ao invés de ter a classificação definida diretamente pela bead, passaram por dupla checagem através do alinhamento das possibilidades alélicas utilizando a ferramenta do IPD-IMGT/ HLA 3.41.0.
Quadro 2 Sondas que hibridizam com o resíduo 80-83 do HLA-B e os aminoácidos correspondentes 
	Sonda
	Aminoácido 80
	Aminoácido 81
	Aminoácido 82
	Aminoácido 83
	Classificação
	#004 (B115): 80-ALR--85
	Treonina (ACC)
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80T
	#073 (B154): 78-RN--(-/D)83 
	Asparagina
	Leucina (CTG)
	Arginina (CGC)
	Aspartato
	Bw6
	#081 (B204G) : [66IC-68 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#515 (B117): [75-ED77 + 79R--LR--85]
	Treonina (ACC)
	Leucina (CTG)
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80T
	#519 (B153) : 78-RIALR83
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#526 (B112G) : [72--Y-E-77 + 81ALR--85]
	Treonina/ Isoleucina (ATC/ ACC)
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 
	#528 (B422G) : [67S-TN70 + 77S-RN-81]
	Asparagina
	Leucina (CTG)
	Arginina (CGC)
	G (GGC)
	Bw6
	#554 (B199G) : [62R--QI66 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#581 (B200) : [62RN-QI66 + 79RIALR83]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#593 (B226G) : [42-PRK---48 + 79RIALR-84]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina
	Bw4 80I
	#600 (B284G) : [42-PR-A-47 + 78-RIAL82]
	Isoleucina
	Alanina
	Leucina
	Arginina (CGC)
	Bw4 80I
Fonte: HLA Fusion Versão 4.3
Aminoácidos da posição 80-83 estão destacados em negrito nas sondas. Aminoácidos em vermelho foram obtidos por alinhamento
	Para verificar a confiabilidade dos resultados obtidos, e detectar possíveis erros na genotipagem, foi calculado o Equilíbrio de Hardy-Weinberg das amostras utilizando o grupo ligante KIR e os alelos definidos. O cálculo foi feito pelo programa Genalex v. 6.51b2, e alelos com frequência menor que 3% foram agrupados em uma única categoria, de modo a evitar que genótipos raros levassem ao desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (conforme utilizado em BOOSLOPER, 2020). 
	Como na primeira análise as frequências genotipícas da amostra controle não se encontravam em equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi necessário revisitar os dados de todas as amostras no HLA Fusion v. 4.3 via acesso remoto.
ANÁLISE ESTÁTISTICA 
	Para a análise de associação, após contagem direta, os dados foram organizados em tabela 2x2 de número de portadores e não-portadores dos alelos nos casos e controles, e o software Rstudio v. 1.3.1056 foi utilizado para a análise estatística. Grupos ligantes KIR e alelos com frequência de portadores maior que 3%, em no mínimo um dos grupos, passaram