Aula 6 - Sequenciamento Genômico

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Sequenciamento Genômico
Profª Drª Lilian Rodrigues Alves
Disciplina: Biotecnologia de Produtos Farmacêuticos
O que significa sequenciar um genoma ou 
mesmo pequenos fragmentos de DNA?
• Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da
sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço
de DNA ou em um genoma inteiro.
• Sequenciar um genoma inteiro: requer quebrar o DNA do genoma
em pequenos fragmentos, sequenciar esses pedaços e montar as
sequências em uma única e longa sequência "consenso".
Sequenciamento de Sanger: o método 
de terminação da cadeia
• Desenvolvido pelo bioquímico britânico Fred Sanger e seus
colaboradores, em 1977.
• Regiões de DNA com até 900 pares de base de comprimento.
• No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para
determinar as sequencias de muitos fragmentos relativamente
pequenos de DNA humano.
Sequenciamento de Sanger: o método 
de terminação da cadeia
• Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados
usando outros métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger
ainda é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos
individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA
ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
• O método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma
região alvo de DNA.
• Os ingredientes são similares àqueles usados para replicação de
DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase
(PCR), os quais fazem cópias de DNA in vitro.
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
Eles incluem:
• Uma enzima DNA polimerase
• Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples
que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a
polimerase
• Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• O DNA molde a ser sequenciado
• MgCl2 e tampão
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
Entretanto, uma reação de sequenciamento de Sanger contém um 
ingrediente único:
Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro
nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com
um corante de uma cor diferente.
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
• Dideoxinucleotídeos são similares aos nucleotídeos comuns, ou
deoxinucleotídeos, mas com uma diferença chave: falta um grupo
hidroxila na posição 3' do carbono do anel de sacarose.
• Em um nucleotídeo comum, o grupo 3' hidroxila atua como um
"gancho", permitindo que um novo nucleotídeo seja adicionado à
cadeia existente.
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
• Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há
hidroxila disponível e nenhum outro nucleotídeo pode ser adicionado.
• A cadeia termina com o dideoxinucleotídeo, o qual é marcado com um
cor particular de corante dependendo da base (A, T, C or G) que carrega.
• A molécula de corante em um dideoxinucleotídeo está ligada à base
nitrogenada.
Método Sanger de sequenciamento
•A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo
com primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP,
dGTP, and dCTP).
•Os quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com
corantes são adicionados também, mas em concentração muito
menor que a dos nucleotídeos comuns.
Método Sanger de sequenciamento
• A mistura é primeiro aquecida para a desnaturação do DNA molde
(separar as fitas), então resfriadas para que os primers possam se
ligar ao molde de fita simples.
• Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada
novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo
DNA a partir do primer.
Método Sanger de sequenciamento
• A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até
que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um
normal.
• Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e
portanto a fita terminará em um dideoxinucleotídeo.
Método Sanger de sequenciamento
• Este processo é repetido em um número de ciclos.
• Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um
dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do
DNA alvo em pelo menos uma reação.
• Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos,
terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA
original.
• As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que
indicam o nucleotídeo final.
Método Sanger de sequenciamento
• Este processo é repetido em um número de ciclos.
• Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um
dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do
DNA alvo em pelo menos uma reação.
• Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos,
terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA
original.
• As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que
indicam o nucleotídeo final.
Método Sanger de sequenciamento
• Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados
através de um longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um
processo chamado de eletroforese capilar em gel.
• Pequenos fragmentos movem-se rapidamente através dos poros
do gel, enquanto longos fragmentos movem-se mais devagar. Assim
que cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final do tubo, ele
é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja
detectado.
Método Sanger de sequenciamento
• O menor fragmento (que termina apenas um nucleotídeo após o
primer) atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo
menor fragmento (terminando dois nucleotídeos após o primer), e
assim por diante.
• Portanto, a partir das cores dos corantes registradas uma após a
outra no detector, a sequência do pedaço original de DNA pode ser
construída com um nucleotídeo por vez.
Método Sanger de sequenciamento
• Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de
picos em intensidade de fluorescência, como mostrado no
cromatograma a seguir.
• A sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma.
Uso e Limitações do Método Sanger
• O método Sanger de sequenciamento promove sequências de alta
qualidade para trechos relativamente longos (por volta de 900
pares de base).
•É tipicamente usado para sequenciar peças individuais de DNA,
como plasmídeos bacterianos ou DNA copiado em PCR.
Uso e Limitações do Método Sanger
• Entretanto, o método Sanger de sequenciamento é caro e
ineficiente para projetos de larga escala, como o sequenciamento
de um genoma inteiro.
• Para tarefas como essa, novas técnicas de sequenciamento de
larga escala são mais rápidas e menos caras.
Sequenciamento de Nova Geração 
(Next Generation)
• O sequenciamento de nova geração é algo como conduzir um
grande número de pequenas reações Sanger de sequenciamento
em paralelo.
• Alto paralelismo: muitas reações de sequenciamento ocorrem ao
mesmo tempo
Sequenciamento de Nova Geração 
(Next Generation)
• Graças a essa paralelização, grandes quantidades de DNA podem
ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com
métodos de última geração do que com sequenciamento Sanger.
• 2001: 100 milhões de dólares
•2015: 13 mil dólares
Sequenciamento de Nova Geração 
(Next Generation)
• A habilidade de sequenciar genomas rotineiramente abre novas
possibilidades para pesquisa em biologia e aplicações biomédicas.
•
• Sequenciamento de baixo custo é um passo em direção à medicina
personalizada – isso é, tratamento médico adaptado às
necessidades de um indivíduo, baseado nas variante gênicas no seu
genoma.
Vídeo
Obrigada!