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O mecanismo de ação da vancomicina consiste na inibição da síntese e acoplamento dos polímeros de peptideoglicano da parede celular. Isso ocorre devido a sua ligação ao D-alanil D-alanina. A vancomicina, por ligar-se rápida e firmemente às bactérias, exerce um efeito bactericida sem período de latência, porém age apenas em microorganismos em fase de multiplicação.
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