ARTIGO HISTORICO CROMATOGRAFIA

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UNIVERSIDADE DO BRASIL 
 
CENTRO DE CIÊNCIAS MATEMÁTICAS E DA NATUREZA 
 
Instituto de Química 
 
Departamento de Química Orgânica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO ACOPLADA A 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS APLICADA AO ESTUDO DE AGENTES 
ANABÓLICOS E CANDIDATOS A FÁRMACOS MODULADORES DE RECEPTORES 
DOPAMINÉRGICOS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MONICA COSTA PADILHA 
Tese de Doutorado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Rio de Janeiro 2007 
CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO ACOPLADA A 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS APLICADA AO ESTUDO DE AGENTES 
ANABÓLICOS E CANDIDATOS A FÁRMACOS MODULADORES DE RECEPTORES 
DOPAMINÉRGICOS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS 
 
Monica Costa Padilha 
 
Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Química da Universidade do Brasil-
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências 
 
Aprovado por: 
 
 
 Prof. Francisco Radler de Aquino Neto (IQ/UFRJ) 
 
 
 
 
 Prof. Carlos Alberto Manssour Fraga (IQ/UFRJ) 
 
 
 
 
 Prof. Ângelo da Cunha Pinto (IQ/UFRJ) 
 
 
 
 
 Prof. Eliezer de Jesus Barreiro (FF/UFRJ) 
 
 
 
 Profa. Paula Fernandes de Aguiar (IQ/UFRJ) 
 
 
 
 
 Prof. Tanus Jorge Nagem (DEQUI/UFOP) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro, dezembro de 2007 
 iii 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Padilha, Monica Costa 
CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO ACOPLADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSAS APLICADA AO ESTUDO DE AGENTES
ANABÓLICOS E CANDIDATOS A FÁRMACOS MODULADORES DE
RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS 
xx, f. 
 
Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade do Brasil – UFRJ. Centro de Ciências
Matemáticas e da Natureza, Instituto de Química, Departamento de Química
Orgânica, 2007 
 
Orientadores: Francisco Radler de Aquino Neto e Carlos Alberto Manssour Fraga 
 
1. Anabolizantes 2. Protótipos para receptores D2 3. Cromatografia gasosa de alta
resolução 4. Espectrometria de massas 5. Validação de metodologia – Teses. I.
Francisco Radler de Aquino Neto e Carlos Alberto Manssour Fraga (orientadores). II.
Universidade do Brasil. Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza. Instituto de
Química. Departamento de Química Orgânica. III. Título. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Tese realizada no Departamento de Química Orgânica do 
INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE DO BRASIL-
UFRJ, como parte dos requisitos necessários para a obtenção 
do Grau de Doutor em Ciências, sob a orientação dos 
Professores Francisco Radler de Aquino Neto e Carlos Alberto 
Manssour Fraga. 
 v 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
Ao professor Francisco Radler de Aquino Neto, pela enorme contribuição na minha 
formação profissional, pela parceria, confiança, pelas melhores oportunidades de 
aprendizado e pelo incentivo demonstrado na convivência ao longo de todos esses anos. 
 
Ao professor Carlos Alberto Manssour Fraga, pela importante contribuição científica 
e enorme incentivo ao longo da realização desse trabalho. 
 
Aos meus queridos amigos Renata S. L. Raices, Flavio L. Vicente, a Júlia R. L. 
Vicente, Rebecca S. Nocolich e Valter Luiz Gonçalves pelo total apoio e amizade 
demonstrados ao longo do desenvolvimento desta tese. 
 
Aos companheiros de trabalho do LAB DOP, Henrique, Rafael, Professor Luiz 
Nelson e Tarcísio, pela união nos momentos difíceis e pelo apoio e incetivo frente aos 
desafios que envolvem trabalhar com controle de dopagem no Brasil. 
 
A VARIAN pelo apoio, amizade e enorme contribuição em minha carreira. 
 
Aos professores da PGQO, em especial aos professores Pierre Mothé Esteves, 
Ângelo da Cunha Pinto e Cláudia Moraes de Rezende pela enorme contribuição em 
minha carreira. 
 
A professora Paula Fernandes de Aguiar pela amizade, motivação e por 
compartilhar comigo seus conhecimentos em estatística. 
 
Aos amigos da PGQO, em especial a turma de 2004/1, por todos os momentos que 
passamos juntos ao longo desses anos. 
 
Aos técnicos da triagem IV, Isadora, Márcia, Sabrina, Roberto, Glauco e Mariana 
pelo apoio, compreensão e incentivo ao longo desses anos. 
 
 vi 
A todos os companheiros do LAB-DOP - LADETEC (Instituto de Química, UFRJ) e 
a todos que contribuíram de forma direta ou indireta na execução desta tese. 
 
Aos professores da CEFETEQ-RJ, pelo incentivo e amizade ao longo de todos 
esses anos de convivência. 
 
Ao Dr. Ivan Costas Barros pela pergunta certa em um momento difícil, pelo 
incentivo e amizade ao longo de todos esses anos de convivência. 
 
À minha mãe e ao meu pai pela força, carinho e incentivo, a minha irmã Luciana e 
ao meu cunhado Marcelo pelo apoio e compreensão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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“A imaginação é mais importante que o conhecimento” 
Albert Einstein 
 viii 
RESUMO 
 
A pesquisa de protótipos de candidatos a fármacos e o desenvolvimento de 
métodos de controle de dopagem no esporte exigem, invariavelmente, o estudo do perfil 
de biotransformação da substância de interesse. Para identificar esses possíveis 
metabólitos, a cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a espectrometria de 
massas (CGAR-EM) tem-se mostrado uma técnica analítica confiável e versátil, 
permitindo sua aplicação a diferentes tipos de moléculas orgânicas. 
 
Um grupo de protótipos candidatos a fármacos com propriedades antipsicóticas foi 
sintetizado pelo LASSBio/FF-UFRJ em 2004. Entretanto, para esses protótipos N-fenil-
piperazínicos, ainda não havia sido feita a caracterização detalhada por espectrometria de 
massas e a investigação de possíveis metabólitos usando modelos animais. Por outro 
lado, em função dos jogos Pan-Americanos 2007, o LABDOP/IQ-UFRJ teve de incluir 
diversos agentes anabólicos no escopo de seu trabalho, o que requer o controle não só 
dos fármacos mas também de seus metabólitos. 
 
Tendo em vista essas duas necessidades prementes, o objetivo deste trabalho foi 
desenvolver, e validar metodologias analíticas, baseadas em CGAR-EM, para o estudo 
dos metabóliots de N-fenilpiperazinas e de esteróides anabolizantes em fluidos biológicos. 
 
Para os protótipos candidatos a fármacos, a caracterização por ESI-EM/EM indicou 
um único fragmento dominante para os pirazóis e quatro fragmentos majoritários para os 
triazóis. Em relação a investigação de metabólitos para o composto LASSBio 581, não foi 
possível a detecção de algum sinal que pudesse ser atribuído a um possível metabólito. 
 
No caso dos agentes anabólicos, foi possível a inclusão na rotina do laboratório 
dos metabólitos de Tamoxifeno, Clomifeno, Ciclofenil, Letrozol, Metilnortestosterona, 
Metasterona, Tibolona, Zeranol e dos fármacos Formestano e Hiperdrol, assim como a 
validação da metodologia empregada. Adicionalmente foi possível desenvolver um 
método que tanto atendeu a demanda dos jogos – permitindo, inclusive, liberação de 
resultados em 24 horas – quanto cumpriu as exigências da Agência Mundial Anti-
dopagem. Assim, com um tempo total de corrida de 6,25 min para análise de Clembuterol, 
Epimetendiol, 3α,5β-Metiltestosterona, 3’OH-estanozolol e Norandorsterona, a técnica 
proporcionou a detecção no limite de desempenho requerido pela agência reguladora. 
 ix 
ABSTRACT 
 The research for prototypes to drug candidates and the methods development for 
doping control in sports invariably demand the study of the biotransformationprofile of the 
interest substance. In order to identify these possible metabolites, high resolution gas 
chromatography coupled with mass spectrometry (HRGC-MS) has been shown to be 
reliable and versatile, allowing its application to different types of organic molecules. 
 
A group of prototypes drug candidates for schizophrenia control was synthesized by 
LASSBio/FF-UFRJ in 2004. However, for these N-phenylpiperazinic prototypes, there had 
not been conducted the characterization by mass spectrometry and the investigation about 
possible metabolites, in animal models. On the other hand, due Pan-American Games 
2007, LABDOP/IQ-UFRJ had to include several anabolic steroids in the work scope, which 
would require the control of not only the parent drugs but also their metabolites. 
 
In the face of these two pressing necessities, the objective of this work is to develop 
and validate analytical methodologies based on HRGC-MS for the study of N-
phenylpiperazines and anabolic steroids metabolites in biological fluids. 
 
For the prototypes drug candidates, the characterization was performed by 
electrospray ionization mass and tandem mass spectrometry indicating a dominant 
fragment for the pyrazole series and four major fragments for the triazole series. 
Regarding to metabolites of LASSBio 581, was not possible detect any signal which could 
be related with possible metabolites. 
 
In the case of the steroids, was possible include in screening of laboratory 
metabolites of Tamoxifen, Clomiphene, Cyclofenil, Letrozole, Methylnortestosterone, 
Methasterone, Tibolone, Zeranol the drugs Formestane and Hyperdrol, as well the 
validation of this method used. In addition was possible to develop a method that both 
fulfilled the demand of the Games – allowing the release of results within 24 hours indeed 
– and complied with the requirements from the World Anti-Doping Agency. Then, with a 
total running time of 6.25 min to analysis of Clembuterol, Epimetendiol, 3α,5β-
Methiltestosterone, 3’OH-stanozolol and Norandrosterone, the technique also provide the 
minimum required performance limits according regulatory agency. 
 
 
 x 
ÍNDICE GERAL 
 
Capítulo 1. INTRODUÇÃO Página 
 
1.1. CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO 1 
1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS 3 
1.2.1. Analisadores do tipo “armadilha de íons” – Ion trap 6 
1.2.1.1. Modos de operação no Ion trap 6 
1.3. TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRA 6 
1.3.1. Precpitação 7 
1.3.2. Extração por fase sólida Hidrólise 7 
1.3.3. Extração líquido-líquido 8 
1.3.4. Derivatização 9 
1.4. CONTROLE DE DOPAGEM NO ESPORTE - UM BREVE HISTÓRICO 10 
1.5. AGENTES ANABÓLICOS NO CONTEXTO DO CONTROLE DE DOPAGEM NO 
ESPORTE 11 
1.5.1. Mecanismo de ação e uso clínico 13 
1.5.2. Abuso de esteróides 13 
1.5.3. Metabolismo 14 
1.5.4. Estrutura química 19 
1.5.4.1. Anabolizantes 21 
1.5.4.1.1. Estanozolol 21 
1.5.4.1.2. Metandienona 23 
1.5.4.1.3. Nandrolona 24 
1.5.4.1.4. Metiltestosterona 25 
1.5.4.1.5. Metilnortestosterona 26 
1.5.4.1.6. Metasterona 27 
1.5.4.2. Agentes anabólicos 27 
1.5.4.2.1. Clembuterol 27 
1.5.4.2.2. Tibolona 28 
1.5.4.2.3. Zeranol 29 
1.5.4.3. Agentes com atividade anti-estrogênica 30 
1.5.4.3.1. Tamoxifeno 32 
1.5.4.3.2. Clomifeno 34 
1.5.4.3.3. Ciclofenil 35 
 xi 
1.5.4.3.4. Letrozol 35 
1.5.4.3.5. Formestano 36 
1.5.4.3.6. Hiperdrol 36 
1.5.5. Estratégia do exame antidopagem para agentes anabólicos 37 
1.5.6. Métodos analíticos aplicados a agentes anabólicos 38 
1.5.6.1. Cromatografia gasosa de alta resolução acoplada 
 a espectrometria de massas (CG-EM) 38 
1.5.6.2. Critérios de identificação para ensaios qualitativos 
 envolvendo a Cromatografia e a Espectrometria de massas 38 
1.6. PROTÓTIPOS PARA RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS 40 
1.6.1. Planejamento estrutural de novos heterocíclicos N-fenilpiperazínicos 
a partir da clozapina 40 
1.6.2. Processo de desenvolvimento de fármacos 42 
1.6.3. Metabolismo de N-fenilpiperazínicos 43 
 
Capítulo 2. OBJETIVOS 44 
 
Capítulo 3. EXPERIMENTAL 
 
3.1. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA 46 
3.2. SOLVENTES E REAGENTES 46 
3.3. MEDICAMENTOS 47 
3.4. AMOSTRAS BIOLÓGICAS 47 
3.5. MATERIAIS 47 
3.6. EQUIPAMENTOS 47 
3.7. LIMPEZA DA VIDRARIA 48 
3.8. PREPARO DAS SOLUÇÕES 48 
3.8.1. Soluções padrão estoque 48 
3.8.2. Soluções padrão de trabalho 49 
3.8.3. Padrão interno (ISTD) 50 
3.8.4. Solução de D5-androsterona-glicuronídeo 50 
3.8.5. Solução de KOH 50 
3.8.6. Solução derivatizante 51 
3.8.7. Limpeza e silanização dos liners (encamisamento de vidro) de quartzo e / ou vidro 
borossilicato (método LADETEC n°5106) 51 
 xii 
3.9. MÉTODOS DE EXTRAÇÃO EM MATRIZES BIOLÓGICAS 52 
3.9.1. Extração de agentes anabólicos em urina humana 52 
3.9.1.1. Método de triagem (método LADETEC n°5070) 52 
3.9.2. Extração de LASSBio 581 em plasma de rato wistar 54 
3.10. CONDIÇÕES DE ANÁLISE CROMATOGRÁFICA (CGAR-EM) DAS AMOSTRAS 
BIOLÓGICAS 56 
3.10.1. Análise de agentes anabólicos em urina humana 56 
3.10.2. Análise de LASSBio 581 em plasma de rato Wistar 56 
3.11. METABOLISMO DO COMPOSTO LASSBio 581 57 
3.11.1. Animais 57 
3.11.2. Preparo e administração das doses 57 
3.11.3. Coleta das amostras de plasma e urina 57 
3.12. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS 58 
3.12.1. Recuperação do processo de extração 60 
3.12.2. Protocolo de validação para análise qualitativa 61 
3.12.2.1. Especificidade 61 
3.12.2.2. Limite de detecção 62 
3.12.2.3. Precisãointra-ensaio (repetitividade) 62 
3.12.2.4. Valores aberrantes 62 
3.12.3. Protocolo de validação para análise semi-quantitativa 63 
3.12.3.1. Especificidade 63 
3.12.3.2. Contaminação entre amostras (arraste) 63 
3.12.3.3. Limite de detecção (LD) 64 
3.12.3.4. Limite de quantificação (LQ) 64 
3.12.3.5. Precisão intra-ensaio (repetitividade) 64 
3.12.3.6. Valores aberrantes 65 
3.12.4. Protocolo de validação para análise quantitativa 65 
3.12.4.1. Especificidade 66 
3.12.4.2. Contaminação entre amostras (arraste) 66 
3.12.4.3. Valores aberrantes 66 
3.12.4.4. Homocedasticidade / Heterocedasticidade 66 
3.12.4.5. Curva de calibração / Linearidade 67 
3.12.4.6. Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) 68 
3.12.4.7. Precisão e exatidão inter-ensaio 68 
 xiii 
3.12.4.8. Cálculo da incerteza expandida (U) 69 
3.13. MONITORAMENTO DO TEMPO NECESSÁRIO PARA HIDRÓLISE DE AGENTES 
ANABÓLICOS 71 
 
Capítulo 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
4.1. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE ANÁLISE CROMATOGRÁFICA E DA 
DETECÇÃO DE AGENTES ANABÓLICOS 72 
4.1.1. Padronização interna e controle da qualidade do método 75 
4.2. IMPLEMENTAÇÃO DE AGENTES ANABÓLICOS A PARTIR DE URINAS DE 
EXCREÇÃO 76 
4.2.1. Metilnortestosterona 76 
4.2.2. Metasterona 81 
4.2.3. Hiperdrol 86 
4.3. IMPLEMENTAÇÃO DE AGENTES ANABÓLICOS E ESTUDO DA CINÉTICA DA 
HIDRÓLISE 89 
4.3.1. Clomifeno 90 
4.3.2. Tamoxifeno 93 
4.3.3. Ciclofenil 97 
4.3.4. Cinética da hidrólise 99 
4.4. IMPLEMENTAÇÃO DE AGENTES ANABÓLICOS A PARTIR DE PADRÕES DE 
REFERÂNCIA 100 
4.4.1. Validação qualitativa do método analítico 100 
4.4.1.1. alfa-Zeranol 102 
4.4.1.2. beta-Zeranol 105 
4.4.1.3. Tibolona 109 
4.4.1.4. Letrozol 111 
4.4.1.5. Formestano 115 
4.4.2. Validação semi-quantitativa do método analítico 118 
4.4.2.1. Determinação do método de análise por CGAR-ITD – VARIAN 4000 121 
4.4.3. Validação quantitativa do método analítico 126 
4.5. DERIVADOS N-FENILPIPERAZINAS 134 
4.5.1. Caracterização química dos derivados N-fenilpiperazinas 134 
4.5.2. Desenvolvimento de metodologia para análise do composto LASSBio 581 134 
 
 xiv 
Capítulo 5. CONCLUSÃO 136 
 
Capítulo 6. BIBLIOGRAFIA 137 
 
ANEXOS 145
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xv 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 Página 
 
Figura 1: Metabolismo no anel A dos EAA: redução 5α e 5β de esteróides 3-ceto-4-eno. 16 
 
Figura 2: Metabolismo no anel A dos EAA: redução do grupo 3-ceto-4-eno. 16 
 
Figura 3: Metabolismo no anel B dos EAA: 6β-hidroxilação. 17 
 
Figura 4: Metabolismo no anel D dos EAA: oxidação do grupo hidroxila em 17β. 17 
 
Figura 5: Metabolismo no anel D dos EAA: hidroxilação em C16 e 
formação de metabólitos 16-ceto. 18 
 
Figura 6: Estrutura química da testosterona (Androst-4-en-17β-ol-3-ona) 
e estrutura química geral dos esteróides. 19 
 
Figura 7: Estrutura de diferentes esteróides anabólicos. 21 
 
Figura 8: Principais metabólitos do estanozolol em humanos. 22 
 
Figura 9: Principais metabólitos da metandienona em humanos. 24 
 
 Figura 10: Principais metabólitos da nandrolona em humanos. 25 
 
Figura 11: Principais metabólitos da metiltestosterona em humanos. 26 
 
Figura 12: Estrutura química da metilnortestosterona. 26 
 
Figura 13: Estrutura química da metasterona. 27 
 
Figura 14: Estrutura química do clembuterol. 28 
 
Figura 15: Principais metabólitos da tibolona em humanos. 29 
 
Figura 16: Principais metabólitos do zeranol em humanos. 30 
 
Figura 17: Estrutura química de agentes com atividade anti-estrogênica. 32 
 
Figura 18: Principais metabólitos do tamoxifeno em humanos. 33 
 
Figura 19: Principal metabólito do clomifeno em humanos. 34 
 
Figura 20: Principal metabólito do ciclofenil em humanos. 35 
 
Figura 21: Principais metabólitos do letrozol em humanos. 35 
 
Figura 22: Estrutura química do formestano. 36 
 
Figura 23: Estrutura química do hiperdrol. 36 
 
Figura 24: Novas famílias de compostos heterocíclicos. 41 
 
Figura 25: Estrutura química da clozapina. 42 
 
Figura 26: Proposta do metabolismo de MeOPP em rato wistar. 43 
 
Figura 27: Fluxograma do método de extração de agentes anabólicos em urina humana. 53 
 
Figura 28: Fluxograma do método de extração de LASSBio 581 em plasma de rato wistar. 55 
 
 xvi 
Figura 29: Gaiola metabólica. 58 
 
Figura 30: Diagrama de causa-efeito (espinha de peixe). 70 
 
Figura 31: Fluxograma das condições de derivatização. 73 
 
Figura 32: Análise da metiltestosterona (PI) por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas da metiltestosterona-bis-TMS. 74 
 
Figura 33: Reação de derivatização da metiltestosterona. 75
 
Figura 34: Controle de derivatização. (A) Amostra de urina não derivatizadas, (B) Amostra 
de urina derivatizada. 76 
 
Figura 35: Possível metabólito da metilnortestosterona. 77 
 
Figura 36: Proposta de possíveis metabólitos da metilnortestosterona. 77 
 
Figura 37: (A) cromatograma de íons totais, 
(B) espectro de massas do metabólito da metilnortestosterona-bis-TMS. 79 
 
Figura 38: Análise do fragmentograma da metilnortestosterona e dos dez brancos 
de urina avaliados. 81 
 
Figura 39: Possíveis metabólitos da metasterona. 81 
 
Figura 40: Análise da metasterona e seu metabólito por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) e (B1) espectro de massas da metasterona-bis-TMS e 
Metasterona-met.-bis-TMS. 83 
 
Figura 41: Análise do fragmentograma da metasterona e dos dez brancos 
de urina avaliados. 86 
 
Figura 42: Análise do hiperdrol por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas do hiperdrol-bis-TMS. 87 
 
Figura 43: Análise do fragmentograma do hiperdrol e dos dez brancos 
de urina avaliados para cada substância. 88 
 
Figura 44: Proposta de possíveis metabólitos do clomifeno. 90 
 
Figura 45: Análise do clomifeno por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas do hidroxi-clomifeno-mono-OTMS. 91 
 
Figura 46: Análise do fragmentograma do hidroxiclomifeno e dos dez brancos 
de urina avaliados para cada substância. 93 
 
Figura 47: Análise do tamoxifeno por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B1) espectro de massas do Metoxi-hidroxi- 
tamoxifeno-mono-OTMS (possível metabólito), (B2) espectro de massas do 
carboxi-tamoxifeno-mono-OTMS (possível metabólito). 94 
 
Figura 48: Análise do fragmentograma dos metabólitos do tamoxifeno e dos dez brancos 
de urina avaliados. 97 
 
Figura 49: Análise de ciclofenila por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas de ciclofenila-mono-OTMS. 98 
 
Figura 50: Análise do fragmentograma do metabólito de ciclofenila e dos dez brancos 
de urina avaliados. 99 
 
Figura 51: Análise do alfa-zeranol por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas do alfa-zeranol-tris-TMS. 105 
 xvii 
Figura 52: Análise do beta-zeranol por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas do beta-zeranol-tris-TMS.108 
 
Figura 53: Análise de hidroxi-tibolona por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas de hidroxi-tibolona. 111 
 
Figura 54: Análise do letrozol por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas de letrozol-bis-TMS. 114 
 
Figura 55: Análise do formestano por CGAR-EM (varredura linear). 
(A) cromatograma de íons totais, (B) espectro de massas de formestano-mono-TMS. 117 
 
Figura 56: Cromatograma de íons (A) Clembuterol, (B) Norandrosterona, (C) Epimetendiol, 
(D) 3α,5β-Metiltestosterona, (E) Metiltestosterona (PI) e (F) 3’OH-estanozolol. 125 
 
Figura 57: Curva de calibração de 3’OH-estanozolol. 130 
 
Figura 58: Curva de calibração de 3’OH-estanozolol. 130 
 
Figura 59: Cromatograma de íons totais de 3’OH-estanozolol na concentração de 0,2 ng/mL. 132 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xviii 
ÍNDICE DE TABELAS 
 
 Página 
 
Tabela 1: Histórico da cromatografia gasosa de alta resolução. 1 
Tabela 2: Histórico da espectrometria de massas. 4 
Tabela 3: Histórico do uso de agentes anabólicos no esporte. 12 
Tabela 4: Medicamentos utilizados para estudos de excreção. 47 
Tabela 5: Composição da solução de padrão interno. 50 
Tabela 6: Protocolo para a validação do método. 66 
Tabela 7: Cinética da hidrólise após adição de enzima. 100 
Tabela 8: Valores de G crítico para identificação de 1 valor aberrante pelo teste de Grubbs 
em diferentes níveis de confiança. 102 
Tabela 9: Resultados da recuperação para o alfa-zeranol. 103 
Tabela 10: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 104 
Tabela 11: Resultados da recuperação para o beta-zeranol. 106 
Tabela 12: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 107 
Tabela 13: Resultados da recuperação para o 3α-hidroxi-tibolona. 109 
Tabela 14: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 110 
Tabela 15: Resultados da recuperação para o letrozol. 112 
Tabela 16: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 113 
Tabela 17: Resultados da recuperação para formestano. 115 
Tabela 18: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 116 
Tabela 19: Valores estimados de LD e LQ. 118 
Tabela 20: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 119 
Tabela 21: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 119 
Tabela 22: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 120 
Tabela 23: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 120 
Tabela 24: Valores para determinação do limite de detecção e repetitividade. 120 
Tabela 25: Parâmetros de CG-EM-EM utilizados para fragmentação do íon pai. 122 
Tabela 26: Tempo de retenção e fragmentos gerados a partir do EM-EM. 122 
Tabela 27: Valores para o teste de Grubbs. 127 
Tabela 28: Valores de C crítico para nível de confiança de 0,05. 128 
Tabela 29: Valores para o teste de Cochran. 129 
Tabela 30: Precisão e exatidão inter-ensaio do 3’OH-estanozolol para 1ª curva. 131 
Tabela 31: Precisão e exatidão inter-ensaio do 3’OH-estanozolol para 2ª curva. 131 
Tabela 32: Valores de recuperação do composto LASSBio 581. 133 
 
 
 
 
 
 
 xix 
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS 
 
 
11-OHA 11β-hidroxiandrosterona 
11-OHE 11β-hidroxietiocolanolona 
a Inclinação da reta 
Adiol 5α-androstano-3α,17β-diol 
b Intercepto com o eixo y 
Bdiol 5β-androstano-3α,17β-diol 
BSTFA N,O-bis-Trimetilsililtrifluoracetamida 
CG Cromatografia Gasosa 
CGAR Cromatografia Gasosa de Alta Resolução 
CGARAT Cromatografia Gasosa de Alta Resolução e Alta Temperatura 
CGAR-EM Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada a 
Espectrometria de Massas 
CGAR-EM-IE Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada a 
Espectrometria de Massas por impacto de elétrons 
CGAR-EM-IQ Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada a 
Espectrometria de Massas por ionização química 
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
CLAE-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a 
Espectrometria de Massas 
CLAE-EM-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a 
Espectrometria de Massas acoplada a Espectrometria de 
Massas 
COI Comitê Olímpico Internacional 
CV% Coeficiente de variação 
 xx 
Da Daltons, unidade de massa atômica 
DIC Dissociação induzida por colisão 
DQO / IQ / UFRJ Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
EC Energia de colisão 
EFS Extração por fase sólida 
ELL Extração líquido-líquido 
EM Espectrometria de Massas 
EMAR Espectrometria de massas de alta resolução 
EMn Espectrometria de massas em tandem; Espectrometria de 
massas acoplada a espectrometria de massas 
Epit Epitestosterona 
EUA Estados Unidos da América 
FA Fortificado antes 
FD Fortificado depois 
FDA Food and Drug Administration-USA, Administração para Drogas 
e Alimentos dos EEUU 
IE Ionização por impacto de elétrons 
IQ Ionização química 
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade 
Industrial 
IP Identification Point, Ponto de identificação 
IQ / UFRJ Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro 
LIQ Limite inferior de quantificação 
LD Limite de detecção 
LMR Limite máximo de resíduo permitido 
 xxi 
LMDR Limite mínimo de desempenho requerido 
M Molar 
m/z Razão massa / carga 
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento 
MeOH Metanol 
MRM Multiple reaction monitoring, monitoramento de reações 
múltiplas 
MSTFA N-metil-N-trimetilsililtrifluoracetamida 
OMS Organização Mundial de Saúde 
PI Padrão interno 
ppb Parte por bilhão 
ppt Parte por trilhão 
RBC Rede Brasileira de Calibração 
r Coeficiente de correlação 
r2 Coeficiente de determinação 
RSD Desvio padrão relativo 
rpm Rotação por minuto 
S / R Razão sinal / ruído 
SIM Single reaction monitoring, monitoramento de reação única 
t1/2 Tempo de meia-vida 
tmax Tempo em que Cmax é alcançada 
WADA World Anti-doping Agency, Agência Mundial Antidopagem, 
AMA 
WHO World Health Organization, Organização Mundial da Saúde, 
OMS 
 
 xxii 
 
ESTRUTURAS DOS COMPOSTOS CITADOS 
 
 
 
H
H 
Estrano (3) 
 H
H
H
 Gonano (2) 
 
 
 
 
 
 
 
OH
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13
14 15
16
17
18
19
A B
C D
 
Testosterona (1) 
 
H
 
H
 
 
 
 
 
 H
 
 
 
 
 
Androstano (4) Pregnano (5) Colestano (6) 
 
Clostebol (8) 
O
OH
Cl H
OH
O
H3C
O
O
OH
H
Oxandrolona (12)
OH
O
Nandrolona (11) 
Drostanolona (9) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OH
CH3
CH3O 
Bolasterona (7) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OH
O
H
CH3
Metenolona (10) 
 
 
 xxiii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O
OH
OH
N
N
CH3
CH3
OH
CH3
H
H
HO
3’OH-estanozolol (15) 
H
OH
CH3
N
NH
Estanozolol (14) Oximesterona (13) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4β-OH-estanozolol (16) 3’OH-17-epiestanozolol (17) 16α-OH-estanozolol (18) 
N
N
CH3
CH3
OH
CH3
H
H
OH
N
N
CH3
CH3
OH
CH3
H
H
OH
N
N
CH3
CH3
CH3
OH
H
H
HO
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16β-OH-estanozolol (19) 
N
N
CH3
CH3
OH
CH3
H
H
OH
O
CH3
O
SO3H
Metandienona 17β-sulfato (21)Metandienona (20) 
OH
CH3
O
 
 
 
CH3
OH
O
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O
CH3
CH3
OH
CH3
O
H
 
 
 
 
18-nor-17,17-
dimetilandrosta-1,4,13-trien-3-ona (22) 17-Epimetandienona (23) 17β-hidroxi-17α-metil-5β-
androst-1-eno-3-ona (24)
 
 
 
 xxiv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17α-metil-5β-androst-1-
eno-3α,17β-diol (25) Epimetendiol (26) 18-nor-17,17-dimetil-5β-
androstano-1,13-dien-3α-ol (27)
17α-metil-5β-androstano-
3α,17β-diol (28) 
OH
CH3
HO
H
CH3
OH
HO
H
CH3
CH3
HO
H
OH
CH3
HO
H
H
HO
O
H
O
HO
3β-hidroxi-5α-estran-17-ona (30) Norandrosterona (29)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Noretiocolanolona (31) 
H
HO
O
Metiltestosterona (32) 
OH
CH3
H
HO
OH
CH3
O
17α-metil-5α-androstano-3α,17β-diol (33) 
 
 
OH
CH3
HO
H
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
H3C
O
CH3
CH3 OHCH3
H
Metasterona (36) 
OH
CH3
O
7α-metil-5β-androstano-3α,17β-diol (34) Metilnortestosterona (35)
 
 
 
 xxv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
N
OH
Cl
H2N
Cl
H
Clembuterol (37) Tibolona (38) 3α-OH-tibolona (39)
7α-metil-noretisterona (40) 3β-OH-tibolona (41)
O
OH OH
HO
OH
HO
O
O
OOH
HO
Zearalanona (42) 
O
OH
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O
N
H3C
α-Zeranol (43) 
O
OOH
HO OH
O
OOH
HO OH
β-Zeranol (44) Tamoxifeno (45) 
Cl
O
N
CH3
CH3
Clomifeno (46) 
 
N
N
N
CN
CN
Letrozol (47)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O
O
OH
CH3 H
HH
CH3
 
 Formestano (48)
 xxvi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
S
O
N
O
OH
HO
N
NH2
O
O
CH3
H
N
N
N
CH3
CN
CH3
H3C CH3
NC
Aminoglutetimida (49) Anastrozol (50) Raloxifeno (51) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O
N
H3C
O
Toremifeno (53)
O
N
CH3
CH3
Cl
O
O
CH2
Examestano (52) 
 
 
Tamoxifeno-N-óxido (54) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
N-demetiltamoxifeno (55) 4-OH-Tamoxifeno (56) N-dedimetiltamoxifeno (57) 
O
N
H
H
H3C
O
N
H3C
OH
O
N
H
H3C
 
 
 xxvii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4-OH-clomifeno (59)
Cl
O
N
CH3
CH3
HO Ciclofenil (60)
O
N
H
H3C
OH
4-hidroxi-N-demetiltamoxifeno (58) 
CN
CN
HO
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OH
OH
Hidroxi-bis-desacetil-ciclofenil (61)
N
NH
N
Triazol (62) Bis-4-cianofenil-metanol (63) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 N
 
 
 
 
 
 
 
Hiperdrol (65) 
O
Br
O
N
N
N
N
N
H
N
N
CH3
N
N
H
Cl
Clozapina (68)
LASSBio 580 (66)
Formestano (64) 
O
O
OH
CH3 H
HH
CH3
N
N
N
N
Cl
LASSBio 581 (67) 
 xxviii 
 
 
 
 
1-(4-metoxifenil)piperazina (69) 1-(4-hidroxifenil)piperazina (70) N-(4-metoxifenil)etilenodiamina (71)
4-metoxianilina (72) 4-hidroxianilina (73) 
N
NH
O
N
NH
HO
N
O
NH2
NH2
O
NH2
HO
N
HO
O
N-acetil-4-hidroxianilina (74)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 1 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
Introdução -1- 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1. CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO 
 
A cromatografia em coluna foi inicialmente desenvolvida pelo químico de petróleo D. 
T. Day em 1900. M. S. Tswett, o botânico polonês, usou em 1906, as colunas de adsorção 
nas suas investigações de pigmentos de plantas. Ele criou o termo cromatografia, não se 
sabe se por ter separado pigmentos de colorações diferentes ou porque Tswett significa 
“cor” em russo. Até 1930, esse método não tinha sido extensivamente estudado pelos 
químicos. No início da década de 50, James e Martin introduziram a cromatografia gasosa 
(Aquino Neto & Souza Nunes, 2003) (Tabela 1). 
 
Tabela 1: Histórico da cromatografia gasosa de alta resolução*. 
Ano Fato relevante 
1951 Desenvolvimento da cromatografia gás-sólido. 
1952 Desenvolvimento da cromatografia gás-líquido. 
1956 1° Simpósio de cromatografia gasosa da American Chemical Society. 
1957 Desenvolvimento das colunas capilares de metal. 
1959 Coluna capilar de vidro, o desenvolvimento tinha o objetivo de reduzir o custo de obtenção 
do capilar; mas Desty abandonou os esforços após dois anos de tentativas de recobrir o 
vidro com a fase estacionária. 
1961 K. Grob reinicia na Suíça os esforços de Destsy. 
1978 É dominada a confecção de colunas capilares (inertes), além das técnicas de introdução de 
amostras, principalmente devido aos esforços da família Grob. 
1979 Surgimento das colunas capilares de sílica fundida. 
1983/84 Imobilização de fases estacionárias com OH terminal. 
1985 Sistematização da confecção de colunas capilares de alta resolução e alta temperatura. 
* Tabela retirada na íntegra de Pereira & Aquino Neto, 2000. 
 
Dentre os modernos métodos de análise, a cromatografia ocupa, sem dúvida, um 
lugar de merecido destaque no que concerne à separação, identificação e quantificação de 
espécies químicas. 
Cromatografia é um método físico de separação, no qual os componentes a serem 
separados são distribuídos entre duas fases: uma fase fixa de grande área superficial 
denominada fase estacionária, e a outra um fluido que percola através dela sendo, por isso, 
denominada fase móvel. Portanto, a cromatografia gasosa é um processo utilizado para 
separar uma amostra em seus componentes individuais. 
Introdução - 2 - 
 
A separação entre dois, ou mais, componentes, resultará da diferença de suas 
constantes de equilíbrio de distribuição (KD) entre as duas fases. Simplificando, quando mais 
tenazmente um componente é preso pela fase estacionária, mais alta é a porcentagem das 
moléculas daquele componente que nela ficam retidas provocando um retardamento na 
migração da mesma. Um segundo componente menos retido na fase estacionária terá uma 
porcentagem mais alta de moléculas na fase móvel em relação ao primeiro componente. 
Assim na média, o conjunto das moléculas do componente que está menos fortemente 
preso se moverá através do sistema (na direção do fluxo) a uma velocidade mais alta que o 
outro, resultando na migração dos componentes em regiões separadas (bandas) da fase 
estacionária. Essa migração dos analitos através do leito de fase estacionária, pela 
passagem da fase móvel, recebe o nome de eluição (LANÇAS & McNAIR, 1983). 
Devido a grande diversidade de fases líquidas disponíveis, a cromatografia gás-
líquido (fase estácionária é um filme delgado líquido, o qual recobre um suporte sólido inerte) 
torna-se a mais versátil e seletiva forma de cromatografia em fase gasosa. Isto permite que 
sejam analisadas amostras sólidas, líquidas ou gasosas desde que sejam voláteis ou 
possam ser volatilizadas sem sofrerem decomposição no cromatógrafo (AQUINO NETO & 
CARDOSO, 1985). 
Na CGAR a introdução de amostra é crucial para garantir a alta resolução. Como o 
processo cromatográfico só tende a alargar picos, quanto menor for a largura inicial, melhor 
será a resolução no final do cromatograma. A escolha apropriada das condições de injeção 
(tais como o volume de amostra, temperatura do injetor e tipo de injeção) dependem em 
larga escala, do estado físico da amostra. A grande maioria das amostras líquidas requer, 
para sua rápida volatilização, que a temperatura do injetor esteja 20 a 30ºC acima da 
temperatura de ebulição do componente menos volátil. O elevado coeficiente de expansão 
dos líquidos, quando vaporizados, permite que sejam injetados pequenos volumes, o que 
maximiza a resolução do sistema e confere uma forma ideal aos picos eluídos. A câmara de 
vaporização deverá estar suficientemente quente para vaporizar rapidamente a amostra, 
evitando perda da eficiência devido à injeção, mas de tal forma a evitar que haja 
decomposição térmica ou rearranjos na amostra. A seleção da técnica de injeção mais 
adequada para trabalho com colunas capilares é função exclusivamente da amostra, sua 
natureza e concentração. São três as principais técnicas de introdução de amostras em 
colunas capilares: injeção a quente em vaporizadores (com ou sem divisão de fluxo) e 
injeção daamostra “a frio” diretamente no interior da coluna (CARDOSO & AQUINO NETO, 
1989; AQUINO NETO & CARDOSO, 1992). 
Introdução - 3 - 
 
A separação efetiva dos componentes da amostra é efetuada na coluna 
cromatográfica, onde a natureza do tubo, do suporte sólido, o tipo e a quantidade da fase 
líquida, o método de recheio, o comprimento e a temperatura são fatores importantes para 
se ter à resolução desejada (AQUINO NETO & CARDOSO, 1985). 
 Foram desenvolvidos muitos tipos de colunas tubulares abertas para a cromatografia 
gasosa. O material dos tubos é geralmente sílica fundida, cobre, aço inoxidável, alumínio e 
vidro borossilicato. O material usado como suporte inerte deve ter granulometria uniforme, 
ter boas características operacionais (resistência suficiente para não quebrar durante a 
operação) e ser capaz de constituir um leito uniforme na coluna. A área específica do 
material deve ser elevada a fim de promover a distribuição pelicular da fase líquida e 
assegurar o rápido equilíbrio entre as fases estacionária e móvel (AQUINO NETO & 
CARDOSO, 1985). 
Nas colunas capilares, a fase estacionária é depositada na forma de um filme fino e 
uniforme na parede interna do tubo, deixando a parte central oca. São denominadas colunas 
tubulares abertas. As características principais das colunas capilares atuais são: capilares 
de vidro ou sílica fundida com diâmetro interno menor do que 0,3 mm, expessura de filme de 
fase estacionária (df) menor do que 0,5 mm e desativados com agentes silanizantes ou 
similares, que permitem a compatibilização do filme da fase estacionária com o suporte. 
A CGAR, já é uma das técnicas mais populares e poderosas para separação de 
misturas, podendo ser utilizada em diversos campos da ciência como por exemplo: na 
química de polímeros, na geoquímica orgânica, na química de alimentos, de produtos 
naturais, na arqueologia, no controle de qualidade de produtos industriais, na química 
ambiental e medicinal, na toxicologia dentre outras. A grande versatilidade da técnica é 
baseada intrinsecamente no grande poder de resolução e extrema inércia química das 
colunas capilares, além da facilidade de utilização de vários sistemas de detecção e de 
contar com sistemas de transferência de amostra não discriminatórios (PEREIRA & AQUINO 
NETO, 2000; PEREIRA et. al., 2004). 
 
1.2. ESPECTROMETRIA DE MASSAS 
 
A espectrometria de massas teve início no final do século XIX. A espectrometria de 
massas é uma técnica analítica poderosa utilizada para identificar compostos 
desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades químicas e 
estruturais de moléculas; pode ser realizada com quantidades bem pequenas (ao nível do 
picograma) e a concentrações bem baixas em misturas quimicamente complexas (ng/L) 
Introdução - 4 - 
 
(James Barker, 1999). A tabela 2, apresenta um breve histórico do desenvolvimento da 
espectrometria de massas. 
 
Tabela 2: Histórico da Espectrometria de Massas. 
Ano Fato relevante 
1886 Descobrimento de íons positivos por Eugene Goldstein. 
1898 Wilhelm Wien analizou íons positivos por deflecção magnética (W. Wien em 1911 ganhou o 
Prêmio Nobel de Física pela descoberta das leis de irradiação do calor – Lei de Wien. 
1901 Walther Kaufmann analizou raios catódicos usando campos eletromagnéticos paralelos. 
1911 Joseph John Thomson descobre duas massas diferentes do Neônio (20 e 22), um ano mais 
tarde obteve o espectro de massas de O2, N2, CO, CO2 e COCl2. Para muitos cientistas que a 
espectrometria de massas teve início de fato com os trabalhos de J. J. Thomson, que em 1906 
ganhou o Prêmio Nobel de física. 
1913 J. J. Thomson observa pela primeira vez a dissociação de íons moleculares. 
1918 A. J. Dempster desenvolve o primeiro espectrômetro de massas com setor magnético com 
formato de 180° em direção ao foco, servindo este setor magnético como analisador de 
massas. 
1919 Francis William Aston (estudante de Thomson) desenvolve o primeiro espectrômetro com 
seleção de velocidade. Nesse mesmo ano, F. W. Aston confirma que os íons de Neônio 
descobertos por Thomson eram realmente isótopos usando o primeiro espectrômetro de 
massas (na época chamado espectrógrafo de massas). A confirmação dos dois isótopos é tida 
como o primeiro experimento de relação isotópica de um gás por espectrometria de massas. 
Em 1922, F. W. Aston ganha o Prêmio Nobel de física. 
1930 R. Conrad aplica pela primeira vez a espectrometria de massas a química orgânica. 
1940 A. O. Nier mostra que o U253 é fissionável (separa U235 e U238). Fato decisivo para o projeto 
Manhattan, que envolveu o desenvolvimento de separação isotópica e a construção de um 
reator nuclear. 
1948 Cameron descobre a medida de tempo de vôo de íons como princípio de análise. 
1952 As teorias de “quasi-equilibrium” (QET – sobre velocidade de reação em condições de 
pressões infinitamente baixas) e RRKM (descreve quantitativamente as velocidades das 
reações como função das energias internas das espécies envolvidas) formularam modelos 
que explicam a fragmentação monomolecular de íons. O acrônimo RRKM vem das iniciais dos 
nomes Rice, Ramsperger, Kassel e Marcus, sendo que este último em 1992 recebeu o Prêmio 
Nobel. 
1953 Wolfgang Paul e H. S. Steinwedel desenvolvem o analisador de massas do tipo quadrupolar, 
que usa campo elétrico para focalizar e separar íons. Pouco tempo depois descreveram o “Íon 
trap”, na época conhecido como quadrupolo tridimensional. Em 1989, W. Paul ganha o Prêmio 
Nobel de física. 
1956 McLafferty fez o primeiro acoplamento entre um cromatógrafo a gás e um espectrômetro de 
massas. 
1966 Munson e Field descobrem a ionização química. 
1968 Primeiro CGEM comercial com colunas capilares. Equipamento rapidamente difundido na 
Introdução - 5 - 
 
maioria dos laboratórios de análise de compostos orgânicos no mundo inteiro. 
1969 Malcom Dole ionização por ESI 
1973 G. Cooks desenvolveu o Tandem MS/MS ou espectrometria de massas seqüencial de duplo 
estágio, onde um íon precursor tem sua massa selecionada e é tipicamente fragmentado por 
CID seguido por análise de massas dos produtos resultantes. 
1978 Yost e Enke desenvolvem o primeiro triplo quadrupolo. 
1979 Comisarow e Marshall adaptaram os métodos de transformada de Fourier à ICRMS e 
construíram o FTMS. 
1981 Barber desenvolve o FAB. 
1983 Blakely desenvolve o Termospray. 
1985 Hillenkamp e Karas desenvolvem a técnica de MALDI-MS. 
1988 Fenn desenvolve o eletrospray ligado ao espectrômetro de massas. 
 
O espectrômetro de massas é um instrumento analítico, através do qual os íons 
produzidos a partir de uma amostra, são separados por campos elétricos e / ou magnéticos 
de acordo com a razão massa-carga (m/z) dos constituintes da amostra. Todas as moléculas 
ionizadas a princípio são passíveis de serem analisadas por espectrometria de massas, 
tornando esta uma técnica universal para análise química. 
Vários tipos de espectrômetros de massas tem sido descritos incluindo analisadores 
por setor de massas (único ou duplo foco), analisadores tipo quadrupolo, analisadores por 
aprisionamento de íons (Ion trap), analisadores por tempo de vôo, dentre outros. Quadrupolo 
e aprisionamento ou armadilha de íons (Ion trap) são os tipos mais utilizados. A grande 
maioria dos experimentos descritos neste trabalho foi realizada nesses dois tipos de 
espectrômetros. 
É possível atingir um elevado grau de certeza na identificação molecular pelo 
acoplamento de sistemas cromatográficos ou afins, a diversos espectrômetros. As técnicas 
combinadas principais sãoa cromatografia gasosa com a espectrometria por infravermelho 
com transformada de Fourier e as cromatografias gasosa ou líquida e eletroforese capilar 
acopladas com a espectrometria de massas. O efluente do sistema de separação é 
transferido através de uma interface para a fonte de íons. A extração das espécies iônicas é 
efetuada de acordo com o analisador de íons e em seguida ocorre a detecção pelo 
“multiplicador de elétrons” (Aquino Neto & Souza Nunes, 2003). 
 
 
 
 
 
Introdução - 6 - 
 
 
1.2.1. Analisadores do tipo “armadilha de íons”- Ion trap 
 
A armadilha de íons consiste de dois eletrodos idênticos (endcap), o eletrodo de 
entrada e o eletrodo de saída, e o eletrodo intermediário (ring electrode). Os eletrodos são 
isolados por espaçadores de quartzo, criando uma cavidade na qual os íons são 
aprisionados. Os íons passam para dentro (ion injection) e para fora da armadilha (trap) 
através de um orifício presente nos eletrodos endcaps. Na teoria os íons podem permanecer 
indefinidamente dentro do trap através da oscilação do campo elétrico. Entretanto, para ser 
detectado, o íon precisa ser varrido pelo sistema de detecção, ou seja, o íon precisa ser 
ejetado. Para tanto aumenta-se a freqüência do eletrodo intermediário fazendo com que os 
íons sejam ejetados do trap para o detector (VARIAN, 2004). 
 
1.2.1.1. Modos de operação no Ion trap 
 
 O espectrômetro de massas do tipo aprisionamento (armadilha) de íons pode ser 
operado nos diferentes modos: 
Varredura linear (Full scan): Todos os íons são coletados e depois ejetados, resultando em 
um espectro que apresenta cada massa que inicialmente entrou no trap. 
Monitoramento de íons selecionados (MIS): Neste caso, os íons também são coletados, mas 
durante o tempo em que os íons são mantidos no trap, voltagens são alteradas para isolar 
um único íon ou janela de íons, assim somente o íon ou os íons de interesse são retidos. No 
momento da ejeção, somente o(s) íon(s) isolado é então escaneado(s). 
MS2: Neste modo, os íons são coletados e um único íon é isolado, assim como em MIS. Em 
seguida, aplica-se uma voltagem para excitar e fragmentar o íon precursor em íons produto 
que então serão escaneados. Uma característica importante do Ion trap é que esta técnica 
permite múltiplos estágios de espectrometria de massas (MSn). Um íon precursor pode ser 
fragmentado sequencialmente. 
 
1.3. TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRA 
 
As técnicas mais comumente utilizadas na extração e purificação de fármacos em 
matrizes biológicas, para a análise por cromatografia gasosa ou líquida acoplada a 
detectores universais ou específicos, são a extração líquido-líquido (ELL) e a extração por 
fase sólida (EFS). A escolha do solvente ideal para essas técnicas pode ser feita 
Introdução - 7 - 
 
empiricamente, com base em observações práticas, ou teoricamente, com base nas 
propriedades termodinâmicas do solvente e do soluto. Entretanto, a avaliação teórica da 
solubilidade de uma substância – especialmente quando está presente em níveis residuais 
(5 ng/mL a 1 pg/mL) – pode ser pouco prática, ou até mesmo impossível, dada a 
complexidade de certas matrizes. Desta forma, a escolha empírica do solvente de extração 
tem sido bastante utilizada. O objetivo principal do pré-tratamento da amostra é viabilizar a 
extração dos compostos de interesse presentes na matriz ou fluido biológico. Para isto, 
estes fluidos biológicos são submetidos a vários procedimentos individuais ou combinações 
de diferentes procedimentos de pré-tratamento. 
 
1.3.1. Precipitação 
 
A técnica de precipitação é usada para a remoção de proteínas por desnaturação das 
mesmas, em amostras de plasma ou sangue total. A precipitação de proteínas ocorre pela 
adição de ácidos (ácido tricloroacético, ácido perclórico, etc.), solventes orgânicos (acetona, 
metanol, etanol, acetonitrila), dentre outros, seguido da filtração ou centrifugação. 
Entretanto, essa técnica apresenta certas desvantagens: analitos fortemente ligados às 
proteínas podem precipitar resultando em uma recuperação baixa e pouco reprodutível; 
alguns interferentes não-protêicos podem permanecer na solução (McDOWALL, 1989). 
 
1.3.2. Extração por fase sólida 
 
A extração por fase sólida é uma técnica de isolamento amplamente empregada em 
diversos campos, como no controle de qualidade de produtos farmacêuticos, no 
monitoramento terapêutico de drogas, em estudos farmacocinéticos, na quantificação de 
compostos endógenos para fins de diagnóstico de abuso de drogas, análise forense, entre 
outros (KRISHNAN & IBRAHAM, 1994; MOORS et. al., 1994; HENNION, 2000). 
Os princípios da EFS são semelhantes aos da ELL, envolvendo a partição dos 
compostos entre duas fases. Na EFS a amostra para ser extraída é dividida entre a fase 
sólida e a líquida (como se fosse entre dois líquidos imiscíveis na ELL). O material de 
interesse da amostra terá maior ou menor afinidade pela fase sólida, sendo adsorvido. 
Posteriormente é extraído por um outro solvente que tenha maior afinidade com o material 
de interesse do que com a fase sólida; ou ainda, o material pode não ser retido, eluindo 
imediatamente pela fase sólida, enquanto que a maioria dos interferentes ficam presos na 
resina. Os mecanismos de retenção e eluição ocorrem através de forças intermoleculares 
Introdução - 8 - 
 
entre a amostra e a superfície das fases, envolvendo interações tipo Van der Waals, 
interações tipo eletrostáticas, dipolo induzido - dipolo permanente, dipolo permanente - 
dipolo permanente, íons – dipolo induzido, dipolo permanente – íons, íons – íons e 
interações como ligação de hidrogênio. 
Na extração por fase sólida, o adsorvente ou absorvente (fase sólida) é fixado num 
cartucho de polietileno, entre dois discos compactando essa fase, na extremidade superior e 
inferior. A fase líquida é eluída sob pressão ou vácuo. O processo consiste de 5 etapas: 1) 
Ativação do adsorvente através da passagem de um solvente que condicione a superfície da 
fase sólida. 2) Remoção do solvente responsável pela ativação. 3) Aplicação da amostra. 
3.a) A substância de interesse e a matriz ficam retidas na fase sólida. 3.b) A substância de 
interesse fica retida e parte da matriz passa pela fase sólida. 3.c) A substância de interesse 
passa pela fase sólida e a matriz fica retida. Nesse caso, a fração de interesse é 
imediatamente coletada. 4) Etapa de lavagem: 4.a) a fase sólida é lavada com um solvente 
adequado retirando a matriz ou parte dela, sem eliminar os compostos de interesse. 4.b) A 
substância de interesse continua na fase sólida enquanto ocorre a lavagem com um solvente 
apropriado, eliminando o que restou da matriz ou parte dela. 5) Eluição da substância de 
interesse do adsorvente, com um solvente apropriado, que será utilizado no próximo passo 
da análise geral (HENNION, 2000). 
As fases sólidas usadas em EFS são semelhantes às utilizadas nas colunas para 
cromatografia líquida. De acordo com o grupo funcional preso à sílica ou ao polímero, a fase 
resultante é classificada como polar, não polar ou de troca iônica. 
O processo de EFS pode ser utilizado tanto “on-line” quanto “off-line”. Na 
configuração em linha, a substância de interesse eluída do cartucho é introduzida no 
cromatógrafo líquido através de uma válvula de injeção. O módulo do cartucho de extração é 
inserido como parte do equipamento cromatográfico, conectado diretamente na linha que a 
fase móvel percorre. A extração por fase sólida em linha é uma técnica de pré-tratamento 
usada principalmente associada à cromatografia líquidade alta eficiência. 
 
1.3.3. Extração líquido-líquido 
 
A extração líquido-líquido (ELL) é uma técnica simples, rápida, de baixo custo e muito 
útil para separar analitos de interferentes presentes na matriz através da partição da amostra 
entre dois líquidos imiscíveis ou duas fases. A ELL tem sido o método tradicional para o 
isolamento de fármacos de matrizes biológicas, principalmente para métodos que utilizam a 
cromatografia gasosa como técnica analítica. 
Introdução - 9 - 
 
Na ELL, uma das fases é geralmente aquosa e a segunda fase constituída por um 
solvente orgânico. Analitos extraídos na fase orgânica são facilmente recuperados pela 
evaporação do solvente. 
Uma vez que a extração é um processo de equilíbrio com eficiência limitada, 
quantidades significativas do analito podem permanecer em ambas as fases. O equilíbrio 
químico envolve mudanças no pH, no pareamento iônico, na concentração, e pode ser 
usado para aumentar a recuperação do analito e / ou a eliminação de interferentes. Um bom 
solvente para ELL, deve ter as seguintes características: baixa solubilidade em água (inferior 
a 10%), volatilidade que permita fácil remoção e concentração após a extração, polaridade e 
propriedades que permitam a formação de ligações de hidrogênio a fim de aumentar a 
recuperação do analito na fase orgânica e alta pureza para minimizar a contaminação da 
amostra (CARDOSO, 2002). 
Qualquer espécie será distribuída entre dois solventes imiscíveis, sendo a razão entre 
a concentração do analito entre as duas fases uma constante. O processo pode ser 
traduzido pela equação: KD = Co / Caq, onde KD é a constante de distribuição, Co a 
concentração do analito na fase orgânica e Caq a concentração do analito na fase aquosa. 
Os solventes orgânicos ou mistura de, mais utilizados são terc-butilmetiléter, acetato 
de etila, acetona:clorofórmio (1:1), tolueno, diclorometano:acetona (2:1), tolueno:acetato de 
etila (4:1), diclorometano:isopropanol:acetato de etila (1:1:3), 
clorofórmio:isopropanol:heptano (60:14:26), clorofómio, acetato de butila e éter etílico 
(DRUMMER, 1999). Existem algumas diferenças em relação ao poder extrativo de cada um 
desses solventes ou mistura de solventes, entretanto é preciso enfatizar que a escolha por 
sistemas mais polares freqüentemente gera grande ruído de fundo (“background”) na 
cromatografia. 
 
1.3.4. Derivatização 
 
O desenvolvimento, nos últimos anos, de espectrômetros de massas de baixo custo, 
promoveu um aumento significativo na aplicação de sistemas de CG-EM na análise de 
substâncias ilícitas para uso em humanos. Drogas e / ou xenobióticos são metabolizados in 
vivo através de um caminho que os torne mais polares. Dessa forma a derivatização desses 
metabólitos é praticamente inevitável para viabilizar sua análise por CG-EM (SEGURA et. 
al., 1998). 
Avanços nas técnicas de derivatização empregadas em testes para o controle de 
dopagem no esporte, tem sido relevantes particularmente para os agentes anabólicos, 
Introdução - 10 - 
 
diuréticos e glicocorticóides. Nesse sentido, têm sido aplicados métodos como a metilação, 
alquilação e acilação, de forma que a volatilidade e estabilidade térmica sejam garantidas 
para análise por CG-EM (PEREIRA, 2004). 
 
1.4. CONTROLE DE DOPAGEM NO ESPORTE – UM BREVE HISTÓRICO 
 
Durante toda a história, atletas têm procurado alimentos e poções para aumentar o 
desempenho físico. Os gladiadores romanos faziam uso de uma mistura de estimulantes 
com álcool para superar a fadiga e injúrias, os guerreiros escandinavos comiam cogumelos 
halucinógenos para se prepararem para as batalhas (DELBEKE, 2000). Os primeiros atletas 
acusados de doping, foram nadadores em uma competição em Amsterdam no ano de 1860. 
No final do século XIX, ciclistas europeus estavam usando substâncias como a cafeína 
revestida por açúcar, na forma de cubos, com o objetivo de reduzir a dor e retardar a fadiga, 
infelizmente isto ocorreu quarenta anos antes do primeiro teste para controle de dopagem 
ser introduzido (VERROKEN, 2000). Este teste pode ser considerado simples, tratava-se de 
CGAR acoplada a detector de nitrogênio e fósforo e imunoensaios, se comparado com as 
técnicas disponíveis atualmente. Dessa forma, atletas não tinham medo de serem pegos no 
exame antidopagem o que fez com que o uso de métodos e substâncias proibidas com o 
intuito de aumentar a performance durante uma competição fosse difundido mundialmente. 
Pouco tempo depois da segunda guerra mundial, estimulantes e drogas contra a 
fadiga, desenvolvidos para o exército soviético, se popularizaram, resultando em vários 
casos fatais. Uma das vítimas mais conhecidas desse período foi o ciclista inglês Tom 
Simpson que morreu em 1967 em função do uso da combinação de anfetamina, álcool e 
diurético. Tom Simpsom foi a primeira vítima fatal do uso excessivo de doping na história do 
Tour de France. O abuso exagerado de estimulantes na década de 60, com a 
disponibilidade das anfetaminas sintéticas, preparadas durante a segunda grande guerra, 
levou ao estabelecimento, pelo Comitê Olímpico Internacional (COI), do controle de 
dopagem em 1967. Em 1968 atletas foram testados pela primeira vez, por ocasião dos jogos 
olímpicos na cidade do México (AQUINO NETO, 2001). Embora nesse primeiro teste o foco 
principal fossem os estimulantes, a detecção de outros compostos também se fez 
necessária. Nos anos de 1950 e 1960, em função do avanço da química orgânica, uma 
grande variedade de compostos farmacologicamente ativos, incluindo diuréticos, beta-
bloqueadores, corticosteróides e esteróides anabólicos foram sintetizados. Estes compostos 
foram extensivamente utilizados por atletas durante os anos 70. No final dos anos 70 e 
principalmente durante os anos 80 a biotecnologia avançou significativamente. A reação de 
Introdução - 11 - 
 
polimerização em cadeia (PCR) e modificações genéticas in vitro, permitiram a produção em 
quantidade razoável de proteínas para uso na medicina, dentre elas o hormônio do 
crescimento (GH), insulina e seus derivados, hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e 
eritopoetina, também conhecida como EPO (LASNE et. al., 2002). Essas proteínas, 
utilizadas na prática médica para auxiliar a terapia de doenças diversas, passaram a ser 
também empregadas na dopagem. Em relação ao GH, sua detecção ainda está sob 
investigação. A EPO já está sendo monitorada desde os jogos olímpicos de Sydney em 
2000. Em função do sucesso na batalha contra o doping, aumentando o risco para os atletas 
serem flagrados, estes passam a tentar “velhas” formas para se doparem, e.g. a transfusão 
sangüínea usada por ciclistas na volta ciclística da França de 2004. 
Outro caminho para tentar burlar o exame foi a utilização de esteróides projetados, 
que nada mais são que esteróides anabólicos quimicamente modificados, que foram 
desenvolvidos entre os anos de 1960 e 1970 (RIVIER, 2002). Estas substâncias não eram 
detectadas pelos laboratórios responsáveis pelo controle de dopagem até 2003, quando o 
esteróide projetado tetrahidrogestrinona (THG) foi encontrado através de informação 
anônima (MARQUES et. al., 2007, CATLIN et. al., 2002, CATLIN et. al. 2004, SEKERA et. 
al., 2005). 
No passado recente cientistas obtiveram sucesso com a terapia genética para 
tratamento de doenças ligadas ao enfraquecimento muscular. Dessa forma, a terapia 
genética pode também ser usada por atletas na tentativa de aumentar a força muscular em 
músculos específicos. Embora nenhuma aplicação no controle de dopagem tenha sido 
avaliada até hoje, a agênciamundial anti-dopagem (AMA), incluiu o doping genético na lista 
de métodos proibidos desde janeiro de 2003. 
É difícil prever quais novas substâncias serão utilizadas no futuro com o intuito de 
dopagem. O abuso das mesmas ou de métodos com esse intuito é alertado pelas 
autoridades do controle de dopagem, através de rumores ou informações anônimas. No 
entanto as autoridades do controle de dopagem estão cuidadosamente observando e 
avaliando os avanços científicos a fim de identificar o que pode vir a ser usado com a 
finalidade de dopagem no futuro. 
 
1.5. AGENTES ANABÓLICOS NO CONTEXTO DO CONTROLE DE DOPAGEM NO 
ESPORTE 
 
Com o intuito de aumentar seu desempenho físico, atletas são encorajados a fazer uso 
de substâncias químicas sintéticas ou meios artificiais proibidos no esporte. O controle de 
Introdução - 12 - 
 
dopagem mundial está sob a supervisão da Agência Mundial Anti-dopagem (AMA), a qual 
mantém o código mundial anti-dopagem que inclui uma lista de substâncias e métodos não 
lícitos à prática do esporte. O abuso de drogas é controlado pela análise em laboratórios 
acreditados pela AMA, amostras de urina ou sangue dos atletas são coletadas antes ou 
durante uma competição. 
Esteróides anabólicos androgênicos (EAA) são um grupo de substâncias naturais e 
sintéticas que são quimicamente similar e mimetizam a ação da testosterona endógena. EAA 
têm sido usados por uma grande variedade de atletas por mais de cinqüenta anos, com o 
objetivo de aumentar sua capacidade de treinamento, resistência e desempenho. O uso de 
EAA por atletas foi proibido desde meados dos anos 70, mas ainda são a principal classe de 
substâncias utilizada no esporte (MARCOS, et. al., 2002). Já nos anos 20, amostras de tecido 
de testículos de macaco eram enxertados em atletas e, em conseqüência da “organoterapia” 
no final dos anos 80 difundiu-se o consumo de urina de mulheres grávidas como fonte de 
anabolizantes (CATLIN & HATTON, 1991). A tabela 3 apresenta um breve histórico do uso de 
agentes anabólicos no esporte. 
 
Tabela 3: Histórico do uso de agentes anabólicos no esporte. 
Ano Fato relevante 
1953 Anabolizantes sintéticos entram no mercado. 
1964 Olimpíadas de Tóquio apresentaram atletas com musculatura surpreendente, lançando a suspeita 
de abuso de anabolizantes. 
1976 Nadadoras alemães nitidamente “fabricadas” por doping, nas olimpíadas de Montreal. 
1980 Novamente as nadadoras alemães se destacaram. 
1984 Martti Vainio (atletismo) é flagrado pelo uso de metenolona. 
1986 Salviano Domingues (atletismo) é flagrado pelo uso de nandrolona. 
1988 Ben Johnson é flagrado pelo uso de estanozolol, um anabolizante sintético de última geração. 
Florence Griffith-Joyner, nitidamente moldada por anabolizantes, não é flagrada. 
1988 Andor Szanyl (Levantamento de peso) é flagrado pelo uso de estanozolol. 
Anos 90 Internet banaliza o acesso e uso de anabolizantes e “complementos nutricionais”. 
1992 Berenice Pereira (atletismo) é flagrada pelo uso de nandrolona. 
1994 Sueli Pereira dos Santos (lançamento de dardo) é flagrada pelo uso de nandrolona. 
1994 Maureen Maggi (salto triplo) é flagrada pelo uso de Clostebol. 
1996 Iva Prandzheva (salto triplo) é flagrada pelo uso de metandienona. 
 
A detecção de EAA no contexto do controle de dopagem no esporte é historicamente 
realizada por Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada a Espectrometria de Massas 
(quadrupolo único). Esta análise tem a urina como fluido biológico de escolha e exige a 
Introdução - 13 - 
 
detecção de grande número de esteróides diferentes e seus metabólitos em baixa 
concentração (10 ng/mL - 2 ng/mL). 
 
1.5.1. Mecanismo de ação e uso clínico 
 
EAA são derivados sintéticos da testosterona, hormônio natural masculino responsável 
pelos efeitos anabólicos e androgênicos observados nos homens durante a adolescência e a 
vida adulta. Nos homens a testosterona é sintetizada nas células de Leyding e testículos, 
enquanto nas mulheres está presente em pequenas quantidades sendo sintetizada nos 
ovários e glândula adrenal (SCHANZER, 1996). 
A principal importância fisiológica da testosterona se dá a partir da sua ligação com 
receptores citoplasmáticos, promovendo assim a transcrição do gene e a tradução em 
proteína. O principal alvo para ação anabólica da testosterona são o músculo esquelético, o 
tecido muscular do osso e a hematopoiese. Além disso, alguns efeitos anabólicos são 
mediados também indiretamente: EAA são antagonistas de glicocorticóides endógenos e 
inibem processos protéicos catabólicos. Também podem estimular a formação do hormônio 
de crescimento e do fator de crescimento semelhante a insulina. 
EAA tem muitas indicações clínicas. Por muito tempo foram usados por homens para o 
tratamento de hipergonadotrofia. Outras terapias onde são utilizados incluem a contracepção 
e o tratamento de doenças crônicas como a doença pulmonar obstrutiva e a infecção por HIV. 
EAA tem sido usados para promover a deposição muscular depois de queimaduras, cirurgia e 
terapia com radiação. Eles também podem ser usados no tratamento da osteoporose, 
doenças hepáticas, na cura de ferimentos, anemia e algumas desordens psiquiátricas. As vias 
de administração de EAA são: oral, intramuscular, nasal, transdérmica ou ainda absorvido 
pela boca. 
 
1.5.2. Abuso de esteróides 
 
EAA têm sido usados por décadas pelos atletas. Entretanto o abuso não é limitado a 
atletas profissionais, uma grande parte da população que freqüenta academias de ginástica 
também utiliza EAA. A incidência do abuso por atletas tem sido estudada intensivamente 
durante competições ou fora de competição. Os resultados encontrados dependem do 
esporte, do gênero e idade dos atletas. De acordo com estatísticas oficiais da AMA, em 2004 
cerca de 0,7% das 170.000 amostras apresentaram resultado analítico adverso para agentes 
Introdução - 14 - 
 
anabólicos, onde em 86% dos casos os esteróides utilizados foram: testosterona, estanazolol 
e metandienona (AYOTTE, 1996, WADA, 2007). 
Estudos recentes mostram que doses supraterapêuticas de EAA combinadas com 
treinamento intenso, têm um efeito saudável no homem. O mecanismo de ação ainda não foi 
totalmente esclarecido, mas postula-se ser mediado indiretamente. Altas doses de EAA 
podem também aumentar o número de receptores androgênios nas células. Uma parte dessa 
ação pode ser psicológica uma vez que com o abuso de esteróides atletas sentem-se com 
mais energia e assim treinam mais intensamente. 
O abuso de EAA difere significativamente de seu uso clínico. Essas drogas vêm 
freqüentemente do mercado negro e algumas são somente para uso na medicina veterinária. 
A dose total utilizada é geralmente supraterapêutica e são tomadas em ciclos de um até três 
meses com completa abstinência da medicação entre os ciclos, para tentar minimizar os 
efeitos colaterais. Mais que um esteróide é usado simultaneamente como um “stack” para 
evitar tolerância. A dosagem é inicialmente pequena, depois é gradativamente aumentada e 
no final do ciclo é descendente para evitar os sintomas da retirada da droga (abstinência). A 
maioria dos usuários de EAA usam concomitantemente outras drogas para prevenir os efeitos 
indesejáveis dos EAA. 
 Os efeitos adversos dos EAA estão geralmente associados com o abuso dos mesmos, 
principalmente por longos períodos de tempo em doses supraterapêuticas. EAA em homens 
podem reduzir a fertilidade (azoospermia), provocar a diminuição dos testículos, a impotência, 
ginecomastia e o estreitamento da uretra;em mulheres podem provocar a masculinização 
(para alguns efeitos irreversível), como por exemplo a excessiva pilosidade corporal, calvície 
de padrão masculino, hipertrofia de clitóris, irregularidade ou ausência do ciclo menstrual, voz 
rouca e acne. Outros efeitos adversos incluem: problemas cardiovasculares (infarto agudo do 
miocárdio e cardiopatias), disfunção hepática (icterícia), tumores no fígado (adenona, 
carcinoma), desordens psiquiátricas (aumento da agressividade, psicose, disforia, depressão), 
acidente vascular cerebral e embolia pulmonar (KUHN, 2002). Casos de dependência química 
também são conhecidos. 
 
1.5.3. Metabolismo 
 
O metabolismo dos EAA é extenso e segue o caminho usualmente evidenciado para a 
testosterona. Dessa forma, o metabolismo da testosterona pode ser discutido como base para 
a rota metabólica de todos os EAA sintéticos. As enzimas que convertem testosterona em 
seus diferentes metabólitos também são ativas para conversão de EAA com grupos e 
Introdução - 15 - 
 
configurações similares àquelas do principal androgênio endógeno. O metabolismo da 
testosterona foi investigado em diversos tecidos in vivo e in vitro em vários modelos animais e 
através de estudos clínicos com humanos. Vários desses estudos foram feitos utilizando 
testosterona deuterada para permitir a identificação de forma inequívoca de seus possíveis 
metabólitos. Os principais metabólitos da testosterona excretados na urina são: androsterona 
(3α-hidroxi-5α-androstan-17-ona), etiocolanolona (3α-hidroxi-5β-androstan-17-ona), 
epiandrosterona (3β-hidroxi-5α-androstan-17-ona), 5α-androstano-3α,17β-diol, 5β-
androstano-3α,17β-diol e 5α-androstano-3β,17β-diol (KUHN, 2002). 
A rota de metabolização dos EAA inclui oxidação, redução, hidroxilação e epimerização 
(reações de fase I), e reações de conjugação formando glicuronídeos e sulfatos (reações de 
fase II). Os metabólitos formados são excretados na urina e nas fezes (SCHANZER & 
DONIKE, 1993). 
Os principais alvos para o metabolismo de fase I são os anéis A, B e D. Similarmente 
ao perfil evidenciado para a testosterona, a ligação dupla entre C4 e C5 dos EAA é reduzida 
produzindo os isômeros 5α e 5β. Essa redução é o passo limitante no metabolismo de 
esteróides do tipo 3-ceto-4-eno. A redução produz um centro assimétrico em C5, podendo 
apresentar configuração 5α e 5β (Fig. 1). As enzimas que catalisam este processo, 5α-
redutase e 5β-redutase, estão localizadas principalmente no fígado. A 5α-redutase se localiza 
no retículo endoplasmático e a 5β-redutase no citoplasma. Ambas as enzimas necessitam de 
NADPH como cofator. A proporção dos diferentes isômeros produzidos depende do padrão 
estrutural do esteróide. EAA que possuem em sua estrutura 1,4-dieno, como a metandienona, 
não produzem o isômero 5α. Em geral, a estrutura 1,4-dieno confere ao anel A alguma 
resistência às reduções metabólicas, uma vez que o grupo 1-eno é estável. Quando a dupla 
ligação é reduzida, o grupo 3-ceto é imediatamente transformado (BASARIA et. al., 2001, 
KICMAN, et al., 2003, SCHANZER & DONIKE, 1993, SCHANZER, 1996). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introdução - 16 - 
 
Isômero 5β Isômero 5α 
O
H
O O
H
5β-redutase5α-redutase
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Metabolismo no anel A dos EAA: redução 5α e 5β de esteróides 3-ceto-4-eno.
 
O grupo ceto em C3 é também facilmente reduzido, pelas enzimas 3α-hidroxiesteróide 
desidrogenase e 3β-hidroxiesteróide desidrogenase, produzindo predominantemente o 
isômero 3α-hidroxila (Fig. 2). Dependendo dos substituintes no anel A, outros metabólitos 
podem também ser bio formados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 HO
 
H
O O
H H
O O
H
H H
HO
H
HO H
HO
3β-hidroxi esteróide 
desidrogenase 
3α-hidroxi esteróide 
desidrogenase 
Metabólitos 3α-hidroxila Metabólitos 3β-hidroxila 
 
Figura 2: Metabolismo no anel A dos EAA: redução do grupo 3-ceto. 
 
A modificação mais comum no anel B é a 6β-hidroxilação que ocorre para muitos 
esteróides que têm em sua estrutura 1,4-dieno (Fig. 3). Para alguns esteróides como a 
 
Introdução - 17 - 
fluoximesterona, que possui um átomo de flúor em C9 a 6β-hidroxilação também ocorre 
preferencialmente. 
 
O
O
OH
O
F
O
F
OH
6β-hidroxilação
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Metabolismo no anel B dos EAA: 6β-hidroxilação. 
 
No anel D, o oxigênio na posição C-17 é muito sensível a reações de oxiredução. 
Muitos 17β-hidroxiesteróides são oxidados para 17-cetoesteróides, pela enzima 17β-hidroxi 
esteróide desidrogenase. Entretanto o grupo 17α-alquila impede esta reação. A oxidação do 
grupo 17β-hidroxila é reversível e a extensão do equilíbrio depende de outras reações 
metabólicas, como a conjugação na hidroxila 17β e a redução do anel A. A conversão 
enzimática para 17α-hidroxi não é comum e ocorre somente menos frequentemente em 
alguns esteróides. 
 OH
H
O H
OH
17α-hidroxi 
esteróide 
desidrogenase
17β-hidroxi 
esteróide 
desidrogenase
 
 
 
 
 
Figura 4: Metabolismo no anel D dos EAA: Oxidação do grupo hidroxila em 17β. 
 
EAA também podem ser metabolizados através da hidroxilação de C16, gerando os 
isômeros 16α e 16β, cuja proporção da formação dos dois isômeros difere de acordo com os 
diferentes EAA. Não existe uma regra geral, e em alguns casos somente um dos isômeros é 
excretado. Para o estanozolol, o isômero 16β-hidroxi é um dos principais metabólitos. 
 
 
Introdução - 18 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OH
R
OH
R
OH
OH
R
O
OH
CH3
OOH
O
16α/16β hidroxila 16-ceto
16α e 16β hidroxila 
R = H
16α/16β-hidroxilação 
R = H, CH3
17-oxidação para R=H 
Hidroxilação 16α/16β 
 
Figura 5: Metabolismo no anel D dos EAA: Hidroxilação em C16 e formação de metabólitos 
16-ceto. 
 
Muitos dos metabólitos de fase I, são posteriormente metabolizados por reações de 
fase II. A conjugação com ácido glicurônico uridinadifosfato e fosfoadenosina fosfosulfato 
produzem glicuronídeos e sulfatos, respectivamente. No homem, a glicuronidação parece ser 
mais importante que a sulfatação. A conjugação ocorre principalmente para os anéis A e D. 
3α-hidroxiesteróides são principalmente conjugados com ácido glicurônico e 3β-
hidroxiesteróides com sulfato. Por sua vez, 17β-hidroxiesteróides podem ser conjugados com 
ácido glicurônico e sulfato. No caso do estanozolol, n-glicuronidação também pode ocorrer. A 
glicuronidação do grupo 17β-hidróxi dos 17α-metilesteróides não é comum em função do 
impedimento estérico. 17-metilesteróides são capazes de formar conjugados com sulfato. 
Entretanto, 17-sulfatos são entretanto, instáveis e decompõem-se resultando na formação dos 
epímeros 17α-hidroxi-17β-metil e 18-nor-17,17-dimetil-13(14)-esteróides. Muitos esteróides 
17-alquilados e seus metabólitos são parcialmente resistentes ao metabolismo de fase II e 
são excretados na urina na forma livre. 
 
 
 
 
Introdução - 19 - 
 
1.5.4. Estrutura química 
 
EAA sintetizados quimicamente são estruturalmente relacionados com a molécula da 
testosterona. Eles são desenhados para aumentar o efeito anabólico protêico da testosterona 
com redução dos efeitos androgênicos indesejados, e para melhorar as propriedades 
farmacológicas da molécula. São compostos lipídicos com um sistema de anel peridro-1,2-
ciclopentanofenantreno, sendo classificados em