microbiologia Prática

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Protocolos das Aulas Práticas 
MICROBIOLOGIA 
Curso de Enfermagem 
 
 
 
 
 
 
 Maria Letícia Miranda Fernandes Estevinho 
Ermelinda Pereira 
 
 
 
 
 
Ano Letivo 2020/2021 
http://www.essa.ipb.pt/pls/portal/url/page/essa/
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Considerações Gerais 
Ao iniciar os seus estudos em microbiologia deverá ter presente um conjunto de regras 
e conceitos elementares que o vão ajudar a realizar os trabalhos laboratoriais. As aulas práticas 
de microbiologia têm como objetivo ensinar ao estudante os princípios e os métodos utilizados 
num laboratório de microbiologia. 
Durante as aulas será utilizada uma grande variedade de microrganismos, cujas 
pequenas dimensões e necessidade de trabalhar com culturas celulares puras, por vezes com 
uma elevada densidade celular, exigem que o laboratório esteja sempre organizado, por forma 
a não comprometer a boa execução dos trabalhos. 
Assim, em qualquer espaço laboratorial, a conduta a seguir deve incluir o cumprimento 
de regras de funcionamento, de medidas de segurança obrigatórias e a manipulação correta e 
cuidadosa do material, dos reagentes químicos e do equipamento laboratorial. Cumprir estas 
regras contribui para a prevenção de acidentes e para evitar a contaminação dos estudantes, 
professores e funcionários. Descrevem-se, seguidamente, um conjunto de regras básicas 
estabelecidas em legislação própria (decreto de lei número 84/97 de 16 de Abril de 1997) cujo 
cumprimento é obrigatório num laboratório de microbiologia. 
 
Normas de segurança e de conduta no laboratório de microbiologia 
 Usar obrigatoriamente bata, que protege o vestuário da contaminação e de manchas 
provocadas pelos reagentes; 
 Manter a superfície de trabalho livre de vestuário, livros e outros objetos de uso pessoal 
não necessários à realização do trabalho prático; 
 Não comer, beber ou fumar no laboratório de microbiologia; 
 Não levar à boca o material de trabalho (lápis, canetas,..) e evitar colocar as mãos na 
boca, nos olhos e no nariz; 
 Lavar cuidadosamente as mãos antes e depois do trabalho prático; 
 Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminação microbiana; 
 Limpar as bancadas de trabalho com álcool a 70% antes e depois do trabalho prático; 
 Identificar todo o material utilizando para tal um marcador de vidro apropriado; 
 Transportar os meios de cultura nos suportes próprios; 
 Não pipetar produtos com a boca, usar sempre os dispositivos mecânicos; 
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 Evitar a contaminação das bancadas de trabalho, chão e cestos de papéis. O material 
contaminado nunca deve ser esquecido em locais desapropriados, nem colocado 
inadvertidamente em cima das bancadas de trabalho; 
 Não levar o material usado nas aulas práticas para fora do laboratório; 
 Colocar o material contaminado (pipetas, espátulas, ansas, fios retos, lâminas e lamelas) 
após a sua utilização em recipientes próprios contendo desinfetante; 
 Esterilizar no bico de Bunsen os utensílios (ansas e fios retos) antes e após a sua 
utilização; 
 Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto são necessários; 
 No manuseamento de compostos químicos considerados perigosos, evitar o contacto 
cutâneo ou a sua inalação, recorrendo ao uso de uma hote, de luvas, máscara ou óculos 
de proteção, consoante as características dos compostos; 
 Manusear com muita precaução certos materiais e aparelhos frágeis e/ou muito 
sensíveis e mantê-los devidamente limpos. É o caso dos termómetros, cabeças de 
aquecimento termostatizadas, aparelhos de medição de pH e balanças, entre outros; 
 Nunca usar aparelhos sem conhecer em pormenor o procedimento de utilização; 
 Relatar imediatamente ao docente qualquer acidente que provoque lesão corporal ou 
que origine derrame dos microrganismos para fora dos respetivos meios de cultura; 
 No final da sessão, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado. 
Verificar se o microscópio fica desligado, limpar as objetivas e colocar a capa protetora; 
 Verificar ainda se o gás ficou desligado, se todas as janelas se encontram devidamente 
fechadas e se todos os aparelhos (placas de aquecimento, bicos de Bunsen, lamparinas, 
autoclaves) se encontram desligados. 
 
Principais símbolos internacionais associados aos riscos em laboratórios 
 
 
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Materiais de utilização comum num laboratório de microbiologia 
 
1- Esguicho 
2- Micropipetas 
3- Tubos de cultura 
4- Tubos cónicos 
volumétricos 
5- Pontas de micropipetas 
6- Microtubos 
7- Caixas de Petri 
8- Termómetro 
9- Frasco de cultura 
10- Proveta 
11- Balão de vidro 
12- Balão de Erlenmeyer 
13- Gobelé 
14- Vareta de vidro 
15- Barra magnética 
16- Palitos 
17- Seringa e agulhas 
18- Pinça 
19- Espalhadores de vidro 
20- Pipeta Pasteur 
21- Ansa de inoculação 
22- Espátulas variadas 
23- Bisturi 
24- Tesoura 
25- Lamparina 
26- Marcador para vidro 
 
27 - Banho termostatizado 
28 - Estufa 
29 - Autoclave 
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30 - Microscópio ótico 31 - Centrífuga 
Procedimentos assépticos 
A assepsia é extremamente importante em microbiologia. Entende-se por assépsia todas as 
condições, gestos e atitudes que pretendem assegurar a ausência de microrganismos 
contaminantes no meio em que se trabalha. Há certas precauções que devem ser tomadas 
durante a inoculação de uma cultura microbiana de modo a evitar a contaminação das 
culturas, das pessoas ou do meio ambiente: 
 Certificar-se de que ao dar início às operações, todo o material necessário está ao 
alcance imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente possível; 
 Desinfetar e arrumar convenientemente a bancada de trabalho; 
 Os recipientes devem estar abertos o mínimo tempo possível e, enquanto abertos, 
todo o trabalho deve ser realizado junto à chama do bico de Bunsen; 
 Uma vez abertos os recipientes, como tubos, balões e frascos, o seu bocal deve ser 
flamejado de imediato; 
 A fim de evitar as contaminações durante as manipulações que envolvam caixas de 
Petri, a exposição das superfícies internas estéreis deve durar o mínimo de tempo 
possível; 
 A extremidade das pipetas estéreis que vai ser colocada em contacto com as culturas 
celulares, ou com os recipientes estéreis, não deve ser tocada nem entrar em contacto 
com superfícies não estéreis, como é o caso da roupa, superfície da área de trabalho, 
o exterior de tubos, de balões ou quaisquer outros materiais; 
 A utilização das ansas, pipetas e espalhadores, assim como a manipulação de frascos, 
balões e tubos de ensaio, em condições de assepsia, envolve alguns cuidados 
particulares. 
 
Ansas 
As ansas são esterilizadas pela passagem na chama do bico de 
Bunsen, antes e depois de serem utilizadas. Devem ser aquecidas 
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até ficarem ao rubro para assegurar que todos os esporos são destruídos. Devem ser 
agarradas quase pelo topo num ângulo praticamente vertical. O dedo mindinho deve ficar 
livre para segurar a tampa do recipiente. 
 
Pipetas 
Para transferir culturas, meios e soluções estéreis devem utilizar-se pipetas graduadas ou 
pipetas de Pasteur estéreis de acordo com as normas a seguir descritas. 
 Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contém o tampão de 
algodão, tendo o cuidado para não tocar mais do que o necessário de modo a segurar 
firmemente; 
 Colocar a pompete; 
 Segurar a pipeta como uma caneta mas não apertar a 
pompete. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar na 
rolha de algodão/ tampa do tubo/ frasco; 
 Apertar a pompete com cuidado e retirar a quantidade de 
fluido necessária mas que não atinja nem molhe o tampão de algodão; 
 Colocar a pipeta usada num contentor de plástico com desinfectante, devidamente 
identificado para esse fim; 
 A pompete não deve ser retirada até a pipeta estar dentro do contentor de plástico, 
de modo a evitar que gotas de cultura contaminem a superfíciede trabalho. 
 
Frascos, balões e tubos de ensaio 
Quando se pretendem manipular frascos, balões ou tubos de ensaio 
em condições assépticas, deve proceder-se do seguinte modo: 
 Desapertar a tampa dos frascos/balões ou tubos de ensaio de 
modo a poder ser retirada facilmente; 
 Segurar o frasco/ tubo com a mão esquerda; 
 Retirar a rolha de algodão com o dedo mindinho direito; 
 Não pousar a tampa/ rolha de algodão; 
 Flamejar o gargalo do frasco/ tubo fazendo-o passar pela chama do bico de Bunsen; 
 Recolocar a tampa do recipiente. 
 
 
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Espalhadores 
Os espalhadores são usados para distribuir inóculos sobre a superfície de placas já preparadas 
com meios de cultura. Podem ser esterilizados em estufa uma vez empacotados, ou por 
flamejação com álcool. 
 
Esterilização com álcool 
A esterilização de espalhadores com álcool envolve os procedimentos que se encontram 
ilustrados nas figuras, nomeadamente: 
 Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de álcool a 70% (v/v) 
contido num recipiente com tampa ou coberto com papel de alumínio; 
 Passar rapidamente através da chama do bico de Bunsen - o álcool vai arder 
esterilizando o vidro; 
 Afastar o espalhador ligeiramente da chama até o álcool parar de arder; 
 Pousar o espalhador numa superfície estéril como uma caixa de Petri ou um copo 
graduado; 
 
 
 
 
Utilização da Micropipeta 
Para medir rigorosamente volumes pequenos, recorre-se ao uso de micropipetas. Para além 
do rigor na medição dos volumes, as micropipetas utilizam pontas descartáveis, o que 
também é importante para ter a certeza de que não vamos misturar resíduos ao que estamos 
a medir. 
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Mas as micropipetas só medem volumes corretos quando são bem utilizadas. A sua utilização 
correta é indispensável quer para que se mantenham em bom estado, quer para ter a certeza 
de que estamos a medir o volume certo. 
 
 
1. Selecionar a micropipeta correta para o volume a pipetar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Pressione o êmbolo até ao primeiro ponto de pressão. Aspire de 
modo controlado (se for demasiado rápido, poderão entrar bolhas de 
ar). 
4. Pressione o êmbolo até á 2ª posição para expelir todo o líquido. 
2. Ajustar para o volume desejado e escolher uma ponta adequada. 
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1. Princípios e métodos de esterilização 
A maioria dos trabalhos laboratoriais de Microbiologia exige que se trabalhe em 
condições de assepsia (esterilidade). Deste modo, no sentido de impedir a contaminação das 
culturas microbianas com que se pretendem desenvolver os trabalhos práticos de 
microbiologia, deve proceder-se à desinfeção e esterilização dos objetos necessários e do 
ambiente. Este aspeto da microbiologia, que tem por objetivo controlar os microrganismos, 
isto é matar, inibir ou remover microrganismo, é chamado de controlo microbiano. 
A desinfeção de um determinado objeto ou ambiente, consiste na destruição, inibição 
ou remoção de agentes microbianos causadores de doenças ou de outros problemas, como 
por exemplo a degradação de alimentos, com recurso a agentes físicos ou a agentes químicos. 
Neste processo são eliminadas as células vegetativas, mas não se promove a destruição de 
esporos. 
O termo esterilização de um determinado objeto ou ambiente, é utilizado para definir 
a destruição completa de toda e qualquer célula viva em crescimento ativo, numa forma 
vegetativa ou em latência, incluindo os esporos. 
Existem vários processos de controlo microbiano, e não há um método que seja adequado a 
todos os tipos de material. Os microrganismos podem ser controlados pelo uso de agentes 
físicos e químicos. Se estes agentes matam os 
microrganismos dizem-se microbicidas; se apenas inibem o 
crescimento são chamados microbiostáticos. 
Os métodos de esterilização mais frequentemente 
usados são a esterilização pelo calor seco (incineração, 
estufas de esterilização), e a esterilização pelo calor húmido 
(autoclavagem e fervura). Além destes tipos de esterilização 
pelo calor, existem ainda a esterilização por filtração, a 
esterilização por utilização de radiações e a esterilização por 
agentes químicos. 
 
 
Introdução 
Princípios e Métodos de Esterilização 
Meios de cultura 
10 
 
Métodos Físicos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Métodos Químicos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortes agentes oxidantes 
Promovem a desnaturação 
de proteínas e a 
solubilização de lípidos 
Atuam por alteração da 
tensão superficial na 
interface célula/meio 
Oxidam componentes 
celulares e proteínas 
Regras importantes na utilização de desinfetantes: 
- Usar a forma mais concentrada que cause o mínimo prejuízo ao tecido ou superfície inerte a desinfetar; 
- Em caso de utilização prolongada, aplicar uma combinação de agentes ou intercalar com outros agentes eficazes. 
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2. Meios de cultura 
A possibilidade de cultivar um determinado microrganismo em laboratório é essencial 
para o seu isolamento e caracterização do ponto de vista morfológico, fisiológico, bioquímico 
ou genético. Para a cultura de microrganismos é necessário existirem meios de cultura 
apropriados que simulem ou até melhorem as condições naturais do ambiente em que se 
desenvolvem. 
 Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o 
crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente 
biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de 
microrganismos em laboratório. 
 A sobrevivência e o crescimento dos microrganismos dependem de um adequado 
suprimento de nutrientes e de um ambiente físico favorável. No entanto, há uma grande 
diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e, por isso, só 
compreendendo as suas necessidades é que se consegue ter sucesso na cultura destes 
organismos no laboratório. 
Os meios de cultura podem ser de vários tipos, conforme o objetivo a que se destinam. 
Quanto ao estado físico, podem ser sólidos (1,5 a 2,0%), semi-sólidos ou líquidos (caldo). O 
agar é o agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extraído de algas marinhas, que liquefaz a 
100ºC e solidifica a 40ºC. Os meios sólidos são usados para a multiplicação, isolamento e 
conservação de estirpes e para a contagem de colónias de microrganismos. Utiliza-se meios 
líquidos para o enriquecimento de determinadas estirpes contidas numa população mista, 
para estudos de crescimento e nutrição, e para preparação de grandes volumes de uma 
cultura. Os meios semi-sólidos são usados para observar a mobilidade de algumas bactérias. 
Quanto à composição química, podem ser complexos (com composição química 
desconhecida) ou sintéticos (quimicamente definidos), dependendo do conhecimento que se 
tem sobre as exigências nutricionais dos microrganismos em estudo. 
Quanto ao seu objetivo funcional, os meios de cultura podem ser gerais (permitem o 
crescimento de vários tipos de microrganismos); meios de enriquecimento - formulados para 
permitirem o crescimento de microrganismos mais exigentes; diferenciais (formulados para 
distinguir microrganismos que possuam determinada característica bioquímica), seletivos 
(formulados para o crescimento de uns microrganismos em detrimento de outros), ou 
diferenciais e seletivos. 
 
12 
 
 
1. Introdução 
Os microrganismos estão presentes, permanente ou transitoriamente, na atmosfera, 
no solo (em qualquer parte do globo terrestre) nas águas, na superfície interna do organismo 
animal (pele, boca, estômago, intestino), na superfície externa de vegetais, e, em certos casos 
no interior de seus tecidos. Multiplicam-se logo que as condições ambientais (nutrientes, 
humidade e temperatura) sejam favoráveis ao seu crescimento. A ubiquidade dos 
microrganismos basea-se em três características principais: tamanho reduzido, que permite 
uma grande capacidade de dispersão (e.g.vento, água, animais);variabilidade e flexibilidade 
metabólica, que permite a adaptação rapida às condições ambientais desfavoráveis; e a sua 
grande capacidade de transferência horizontal de genes, que lhes permite recombinar e 
adquirir caracteres positivos e persistir durante muito tempo adaptando-se às condições 
ambientais instáveis. Por exemplo, no fragmento de DNA recebido podem existir genes que 
conferem resistência a algum antibiótico ou a altas temperaturas. Por todos esses motivos é 
possível observar crescimento de colónias bacterianas e fúngicas em placas inoculadas com 
amostras de diferentes ambientes. 
 
2. Objetivos 
 Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos. 
 
3. Material necessário 
Placas de Petri com meio de Agar Nutritivo, Placas de Petri com meio de Y Malte Agar 
Pipetas; 
 Estufa; 
Zaragatoas. 
 
4. Procedimento experimental 
4.1. Pesquisa de microrganismos do ar 
1.Retire a tampa de várias placas de Petri com Agar Nutritivo e Y Malte Agar e manter 
abertas durante 5 e 15 minutos; 
2.Identifique a placa com o nome do operador e a data; 
Trabalho Prático nº 1 
Ubiquidade dos Microrganismos 
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3.Incube as placas de Agar Nutritivo a 30ºC durante 3 dias e as de Y Malte Agar à 
temperatura ambiente durante 7 dias. 
 
4.2. Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas 
1. Passe uma zaragatoa estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua 
desinfeção com lixivia; 
2. Passe a zaragatoa sobre a superfície do meio de cultura; 
3. Identifique a placa com o nome do operador e a data; 
4. Incube as placas a 30ºC durante 3 dias. 
 
4.3. Pesquisa de microrganismos da água 
1. Pipete 0,1ml da água e coloque numa placa de Petri com o meio de cultura. 
2. Espalhe a solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. 
3. Identifique a placa com o nome do operador (grupo) e a data. 
4. Incube as placas a 37ºC durante 3 dias. 
 
4.4. Pesquisa de microrganismos do solo 
1. Pipete 0,1ml da solução de solo (num tubo de ensaio misture 1g de solo com 5 ml de 
água) e coloque numa placa de Petri com o meio de cultura. 
2. Espalhe a solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. 
3. Identifique a placa com o nome do operador e a data. 
4. Incube as placas a 37ºC durante 3 dias. 
 
Resultados 
 Conte o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em cada placa; 
 Descreva o tipo de colónias com base em: 
 
 
Forma 
 
 PUNCTIFORME CIRCULAR FILAMENTOSA IRREGULAR RIZOIDE FUSIFORME 
 
Elevação 
 
 PLANA ELEVADA CONVEXA PULVINADA UMBUNADA 
 
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Margem 
 
INTEIRA ONDULADA LOBADA ERUDIDA FILAMENTOSA ENCRESPADA 
 
 
Outras características: Cor, brilho, opacidade, consistência, tamanho,... 
 
 Registe os resultados nas seguintes tabelas: 
Características das colónias 
Dimensão (mm) Cor Forma Elevação Margem 
 
 
 
 
 
 
 
 Escolha 2 ou 3 colónias diferentes; 
 Coloque numa lâmina, uma gota de água e uma porção de colónia, homogenize e em 
seguida cubra com uma lamela; 
 Observe ao microscópio. Desenhe cada uma das suas observações na tabela: 
Observação das células 
Colónia 1 Colónia 2 Colónia 3 
 
 
Selecione uma placa com colónias isoladas, vede com parafilme e guarde no frigorífico 
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1. Introdução 
1.1. Isolamento de culturas 
Na natureza os microrganismos encontram-se em comunidades mais ou menos 
complexas. Por isso, uma técnica essencial em Microbiologia é a obtenção de culturas puras, 
a partir das quais são possíveis estudos morfológicos, bioquímicos e serológicos das espécies, 
conducentes à sua identificação. 
Estes organismos são demasiado pequenos para poderem ser isolados um a um, a não 
ser por métodos envolvendo uma manipulação complicada e equipamento dispendioso. 
Contudo, poderemos separá-los numa placa de Petri contendo meio sólido. Para obter uma 
cultura pura utiliza-se, em geral, um meio de cultura que favoreça o crescimento do 
microrganismo que pretendemos isolar e simultaneamente iniba o crescimento de outros. 
Cada célula que se desenvolver nesse meio irá originar uma colónia. Dado que todas as 
células de uma colónia têm origem numa só célula, torna-se desnecessário estudá-las 
individualmente, dado que todas elas têm características genéticas idênticas. Deste modo, 
microrganismos com diferentes características genéticas originarão diferentes tipos de 
colónias. Na maioria das vezes, é fácil distinguir colónias puras de colónias mistas pela 
aparência das colónias que crescem no meio de cultura (dimensão, forma, existência de 
diferentes pigmentos e/ou diferença que apresentam na velocidade de crescimento). No 
entanto, um aspeto que não devemos descurar é que a aparência de uma colónia por si só 
não pode servir para determinar se estamos perante uma cultura pura. É necessário continuar 
a testar as colónias isoladas a partir de uma placa contendo uma cultura mista. Para isso é 
necessário: 
1. Transferir as colónias obtidas numa placa primária para uma segunda placa, 
recorrendo à técnica do riscado; 
2. Incubar a segunda placa; 
3. Examinar a consistência das colónias obtidas; 
4. Examinar as células de colónias representativas ao microscópio. 
Do ponto de vista prático, uma colónia é considerada pura quando, tendo início numa 
única colónia, todas as culturas subsequentes, feitas a partir desta colónia pela técnica do 
Trabalho Prático nº 2 
Isolamento, manutenção e conservação de culturas puras 
 
16 
 
riscado apresentem apenas um tipo de colónia, e desde que as células apresentem sempre o 
mesmo tamanho e forma. Convém salientar que, a capacidade de manter no laboratório 
culturas puras, é fundamental para uma boa prática microbiológica. A concretização eficaz 
deste método é crucial por razões de segurança e manutenção da qualidade dos trabalhos a 
desenvolver. 
 
1.2. Conservação e manutenção de culturas 
É conveniente manter uma cultura pura em stock. A maioria das culturas que são 
consideradas apropriadas para uso, são também facilmente mantidas, em condições de 
refrigeração (4º a 8ºC) por subcultura em meio de cultura para crescimento. Para evitar os 
sub-cultivos, as culturas devem ser mantidas em crio tubos contendo meio líquido ao qual se 
adiciona glicerol (30%, p/v, concentração final), e congeladas a -70°C. Na 
ausência deste equipamento, podem manter-se a -20ºC. O laboratório 
deve organizar a sua coleção de microrganismos, elaborando para isso um 
registo de cada uma das espécies, bem como da sua origem. 
Para retirar um novo inóculo basta remover um pouco da cultura 
(por exemplo com uma ansa ou palito estéril), e inocular pelo método do 
riscado numa placa de Petri com o meio de cultura adequado. 
 
2. Objetivos 
 Compreender os testes necessários para verificar a pureza de uma cultura; 
 Obter culturas puras a partir de culturas mistas através da técnica de estriamento em 
placa; 
 Compreender os métodos de conservação e manutenção de microrganismos. 
 
3. Material necessário 
Placas de Petri com meio de cultura sólido (agar nutritivo) estéril 
Ansa de inoculação 
 
4. Procedimento experimental 
1. Observe atentamente as placas de Petri obtidas na aula anterior (guardadas no 
frigorifico); 
2. Selecione duas colónias bem individualizadas e marque-as com caneta de acetato; 
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3. Para cada colónia selecionada, remova assepticamente uma pequena porção de 
células com uma ansa estéril e, usando um movimento contínuo, faça estrias na área 1 
de uma placa de Petri contendo agar nutritivo. Tenha cuidado para não perfurar o 
agar; 
4. Esterilize a ansa à chama e deixe arrefecer; 
5. Rode a placa 90º e, com a ansa, arraste um pouco do inóculo da área 1 e repitao 
estriamento na área 2; 
6. Repita o processo fazendo estrias nas áreas 3 e 4. A este procedimento chama-se 
estriamento em quadrantes; 
7. Incube a placa de Petri à temperatura ambiente até à próxima aula; 
8. Observe o crescimento em placa e em particular a zona onde as colónias começam a 
diferenciar-se; 
9. Confirme se todas as colónias obtidas são iguais entre si, macroscópica e 
microscopicamente, ou seja, se obteve uma cultura pura. No caso de ter várias 
colónias diferentes, repita o procedimento de obtenção de culturas puras 
(estriamento em quadrantes) tantas vezes quantas as necessárias. 
 
 
18 
 
 
 
1. Introdução 
1.1. Morfologia bacteriana 
As bactérias são organismos unicelulares procariontes com um tamanho médio de 
5μm. Podem apresentar basicamente três formas: esféricas (cocos), cilíndricas (bacilos) e 
espirais (espirilos). Reproduzem-se por divisão binária. As células podem ou não separar-se 
umas das outras. Os cocos podem formar diferentes arranjos, de acordo com a sua divisão 
celular (em plano único, ou em mais planos): diplococos – cocos agrupados dois a dois 
(divisão num único plano); estreptococos - cocos dispostos em cadeia (divisão num único 
plano); tétrades-grupos de quatro cocos unidos (divisão em dois planos); sárcinas - grupos de 
oito cocos unidos (divisão em três planos); estafilococos - cocos agrupados de forma 
aleatória, semelhante ao formato de um cacho de uvas (divisão em muitos planos).Os 
bastonetes (ou bacilos) não se dispõem em tantos arranjos como os cocos, sendo que, na sua 
grande maioria, se apresentam de forma isolada. Porém, ocasionalmente podem ocorrer aos 
pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos). Dependendo do gênero, fase de 
crescimento ou da composição do meio de cultura, estas bactérias podem também 
apresentar arranjos diferenciados, como crescimento em paliçada ou letras chinesas. 
Os espirilos ocorrem, predominantemente, como células isoladas. Podem, no entanto, 
apresentar diferenças em relação ao comprimento, largura, número e amplitude das espirais. 
 
Trabalho Prático nº 3 
Morfologia bacteriana e Técnicas de coloração 
 
19 
 
1.2. Técnicas de coloração 
As células microbianas vivas, observadas a fresco, são difíceis de visualizar por 
apresentarem um baixo contraste, com o meio aquoso circundante. Portanto, é técnica 
frequente em microbiologia o uso de corantes que permitem obter esse contraste e facilitar o 
estudo morfológico das células microbianas por microscopia ótica. 
 A coloração citológica das células vivas faz-se habitualmente após a sua fixação por 
métodos químicos ou pelo calor, como é o caso da fixação de algumas bactérias. Os métodos 
de fixação têm como objetivo matar rapidamente as células, reduzindo deste modo o período 
em que ocorrem processos autolíticos, os quais provocam profundas alterações da morfologia 
celular. A fixação oferece também a vantagem de facilitar a penetração dos corantes nas 
células. 
 A maior parte das soluções usadas em Microbiologia são anilinas sintéticas derivadas 
do benzeno. Os corantes são geralmente sais (um ião orgânico e um ião inorgânico), que em 
solução se dissociam em iões com carga elétrica, cuja deposição nas células surge como 
pigmento colorido (cromóforo) reconhecível por microscopia de luz. Se o cromóforo for um 
ião positivo, a coloração é considerada básica, ou catiónica, de que são exemplo o azul-de-
metileno, o cristal de violeta e a safranina; se o cromóforo for um ião negativo, a coloração é 
ácida ou aniónica, de que é exemplo a eosina. Existem três tipos de técnicas de coloração, 
que se classificam em simples, diferencial e estrutural. 
 
2. Objetivos 
 Proceder à observação de células bacterianas recorrendo a diferentes tipos de 
colorações: 
 A – Coloração simples; 
 B – Coloração negativa; 
 C – Coloração de Gram; 
 D - Coloração vital com azul-de-metileno 
 E – Coloração de estruturas; 
 
3. Material necessário 
Culturas de microrganismos: Escherichia coli; Staphylococcus sp, Pseudomonas sp; Bacillus 
Ansas 
20 
 
Microscópio 
 
4. Procedimento Experimental 
A. Coloração vital com azul-de-metileno 
A coloração vital com azul-de-metileno é um método simples que não necessita de fixação e é 
ideal para observar a morfologia celular e alguns aspetos vitais das células, como por exemplo 
a sua mobilidade e divisão. 
Material e Reagentes 
Solução de azul – de –metileno 
Cultura da Escherichia coli 
 Lâmina de vidro 
 Microscópio 
 
Procedimento experimental 
1. Coloque uma gota de azul-de-metileno sobre uma lâmina; 
2. Misture uma ansada da cultura, retirada de uma placa, na solução de azul-de-metileno 
e incube durante 1 minuto; 
3. Cubra com uma lamela e observe ao microscópio. 
 
B. Coloração simples com fixação 
Nestas colorações o esfregaço é corado com um só reagente, deste modo todas as estruturas 
ficam coradas da mesma cor. Os corantes básicos, com o cromogéneo carregado 
positivamente, são os preferidos, pois ligam-se aos ácidos nucleicos e a certos componentes 
da parede celular. 
Os objetivos desta coloração são elucidar sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células 
microbianas. 
Os corantes básicos mais usados são o azul-de-metileno (cora de azul), o cristal violeta (cora 
de roxo), a fucsina (cora de vermelho), o roxo de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquita 
(cora de verde). 
 
Material necessário 
Bico de Bunsen 
21 
 
Ansa 
Microscópio 
Cultura de Escherichia coli 
Cristal violeta, azul-de-metileno ou safranina 
 
Preparação do esfregaço 
1. Limpe e flameje uma lâmina de vidro; 
2. Marque na parte inferior da lâmina uma pequena área onde irá fazer a preparação; 
3. Coloque uma gota de água destilada na zona delimitada (na observação de 
microrganismos provenientes de uma suspensão não deve utilizar água, basta colocar 
na lâmina uma amostra de cultura); 
4. Esterilize a ansa e, depois de arrefecer, retire um pouco de cultura da placa de agar; 
5. Emulsione a amostra na gota de água e espalhe de forma a ficar uma camada fina; 
6. Deixe secar a preparação ao ar; 
7. Segure a lâmina com uma pinça e passe rapidamente, duas ou três vezes, pela chama 
para fixar a preparação. 
 
Coloração 
1. Aplique uma gota de corante sobre o esfregaço. Deixe atuar durante 30 segundos, no 
caso de usar cristal violeta, e 1 minuto, se usar azul-de-metileno; 
2. Retire o excesso de corante e deixe secar. Pode limpar o excesso de líquido com papel 
absorvente; 
3. Observe ao microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
C. Coloração negativa 
Trata-se de uma coloração especial que requer o uso de um corante ácido, como a eosina e 
nigrosina, ou de tinta-da-china (suspensão de partículas de carbono). Este tipo de corante, 
como é carregado negativamente, não vai penetrar na parede celular que também está 
carregada negativamente. Assim, as células não são coradas, mas distinguem-se facilmente do 
fundo corado da preparação. 
 A aplicação da coloração negativa permite observar a dimensão e forma naturais das 
células, pois não é necessária a fixação do esfregaço pelo calor nem sujeitar as células aos 
efeitos agressivos dos químicos. 
 
Material e Reagentes 
Solução de nigrosina 
Duas lâminas de vidro 
Microscópio 
Cultura de Staphylococcus sp 
Cultura de Pseudomonas sp 
 
Coloração 
1. Coloque uma gota de solução de nigrosina sobre uma extremidade da lâmina; 
2. Emulsione uma pequena quantidade de cultura sobre a solução de nigrosina; 
3. Arraste uma lâmina limpa ao longo da lâmina contendo a suspensão celular, para que 
esta fique espalhada por toda a lâmina; 
4. Deixe secar ao ar e observe ao microscópio. 
23 
 
 
 
 
 
D. Coloração de Gram 
Envolve mais do que um corante permitindo distinguir diferentes estruturas e tipos de células 
microbianas pois, coram de cores diferentes. 
Permite separar os microrganismos em grupos, pois distingue pelo menos doistipos de 
comportamento diferente, ou seja, microrganismos com características de coloração 
diferentes. 
 Serve também para corar especificamente certas estruturas microbianas como 
flagelos, endósporos, cápsula, gorduras, etc. 
Esta técnica baseia-se na aplicação do corante primário, cristal violeta, cuja função é 
transmitir a sua cor a todas as células da preparação, seguido da adição de um mordente, 
substância que aumenta a ligação do corante ao microrganismo (solução de Lugol). O iodo da 
solução de Lugol reage com o cristal violeta formando um complexo insolúvel no interior da 
célula. Após este procedimento, a preparação é lavada com um agente descolorante (que 
pode ser álcool), que remove a cor apenas das células Gram negativas. Neste estádio, as 
células Gram positivas apresentam uma cor violeta, enquanto as Gram negativas não 
mostram qualquer coloração. Por fim, é aplicado um último corante de contraste, safranina, 
que vai corar as células Gram negativas de vermelho. 
 
Material necessário 
Solução de cristal violeta 
24 
 
Solução de Lugol 
Solução de safranina 
Etanol 95% 
Lâmina de vidro 
Microscópio 
Cultura de Escherichia coli 
Cultura de Bacillus spp. 
 
Procedimento Experimental 
1. Faça uma preparação fixa numa lâmina; 
2. Deite uma gota de cristal violeta e deixe atuar durante cerca de 20 segundos; 
3. Lave a preparação com água e retire a água com solução de Lugol; 
4. Aplique novamente o Lugol e deixe atuar durante 1 minuto; 
5. Adicione etanol durante 15 segundos; 
6. Lave o etanol com água; 
7. Core com safranina, durante 20 segundos; 
8. Lave, enxague e retire o excesso de líquido com papel 
absorvente e observe ao microscópio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
E. Coloração de esporos 
Há determinados géneros de bactérias (ex. Clostridium, Bacillus) que têm capacidade para 
existir como células vegetativas metabolicamente ativas ou como células altamente resistentes, 
mas metabolicamente inativas, chamadas esporos. 
 Quando as condições ambientais se tornam desfavoráveis para a atividade das células 
vegetativas, estas células têm a possibilidade de sofrer esporogénese e formar uma nova 
estrutura intracelular - endósporo. Se as condições continuam adversas o endósporo é 
libertado da célula vegetativa degenerativa e torna-se uma célula independente - esporo. 
Quando as condições voltam a ser favoráveis o esporo livre pode-se reverter numa célula 
metabolicamente ativa, mas menos resistente através da germinação. 
 
Material necessário 
Solução de verde malaquite 
Solução de safranina 
Cultura de Bacillus spp. (com mais de 24 horas) 
Lâmina de vidro; água destilada; microscópio 
 
Procedimento Experimental 
1. Faça uma preparação fixa numa lâmina; 
2. Coloque um pequeno papel absorvente sobre a preparação para evitar a evaporação do 
corante (o papel deve ser mais pequeno do que a lâmina); 
3. Cubra o papel com verde malaquite e deixe atuar durante 5 minutos, aquecendo a 
preparação com vapor de água; 
4. Remova o papel e lave a 
preparação com água; 
5. Core com safranina 
durante 30 segundos; 
6. Lave com água, enxague e 
retire o excesso de líquido 
com papel absorvente; 
7. Observe ao microscópio 
com uma objetiva de 40x. 
26 
 
 
 
1. Introdução 
Os fungos constituem um grande grupo de seres vivos que podem ser encontrados em 
quase todos os nichos ecológicos. São organismos eucariontes, não fotossintéticos que podem 
apresentar uma forma unicelular (leveduras) ou filamentosa (fungos filamentos). Dependendo 
das condições de crescimento, alguns fungos podem ser dimórficos, apresentando uma 
estrutura micelial ou unicelular. 
 
1.1. Fungos filamentosos 
As colónias dos fungos filamentosos são formadas por hifas, que no seu conjunto 
constituem um micélio que adere ao agar (micélio vegetativo) e pelo micélio aéreo, onde se 
encontram as hifas especializadas para a reprodução. A identificação dos fungos filamentosos 
depende do aspeto macroscópico do micélio, do aspeto microscópica das hifas vegetativas 
(septadas ou não septadas), das estruturas reprodutivas e do tipo de esporos (sexuados e 
assexuados). 
 
1.2. Leveduras 
As leveduras passam a maior parte do seu ciclo de vida na fase unicelular. As maiorias 
são saprófitas, conhecendo-se, no entanto, alguns casos de parasitismo. Reproduzem-se 
assexuadamente por gemulação ou por divisão binária e sexuadamente mediante a formação 
de ascósporos ou basidiósporos. Em algumas espécies, as gémulas não se separam da célula 
mãe formando pseudomicélio. Outras, quando cultivadas em determinadas condições formam 
verdadeiro micélio. A morfologia das leveduras é muito variada: células esféricas, ovais, 
cilíndricas, em forma de limão, triangular e em forma de garrafa. 
 
2. Objetivos 
Observação das estruturas de vários fungos – hifas, micélio, células e estruturas de reprodução. 
 
 
 
 
 
 
Trabalho Prático nº 4 
Morfologia e estrutura dos fungos 
 
27 
 
3. Material necessário 
3.1. Fungos filamentosos 
Culturas de bolores: Aspergillus niger, Penicillium sp., Colletotrichum gloeosporioides, Rhizopus 
sexualis, Mucor sp., Zygorhynchus sp. 
Lupa; agulhas de dissecção 
Corante azul de algodão 
Lâminas e lamelas 
Fita adesiva 
 
3.2. Leveduras 
Placas de Petri com meio Saboraud inoculadas com leveduras - Saccharomyces cerevisiae, 
Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces bailii, Candida albicans e Dekkera 
bruxellensis; 
Ansa de inoculação; 
Microscópio, lâminas e lamelas. 
 
4. Procedimento experimental 
4.1. Observação de fungos filamentosos 
A. Observação macroscópica e a fresco 
1. Observe e caracterize macroscopicamente (olho nu ou lupa) as colónias de bolores em 
placa; 
2. Para observação ao microscópio, coloque uma gota de água (fungos com pigmentação) 
ou de azul de algodão (fungos hialinos) no centro da lâmina; 
3. Com ajuda de uma agulha, remova cuidadosamente uma pequena porção de micélio da 
periferia da colónia e coloque na gota. Se necessário, espalhe o micélio com a ajuda de 
outra agulha; 
4. Cubra com a lamela e retire o excesso de corante pressionando a preparação contra 
papel absorvente; 
5. Observe ao microscópio, com as objetivas de baixa ampliação, e caracterize os fungos 
microscopicamente. 
28 
 
 
29 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
4.2. Observação de leveduras 
1. Faça a caracterização macro morfológica das leveduras; 
2. Faça uma montagem a fresco (em água ou em corante) de cada levedura; 
3. Cubra com a lamela e retire o excesso de corante pressionando a preparação contra 
papel absorvente; 
4. Observe ao microscópio; 
5. Caracterize as leveduras quanto à forma, tipo de divisão celular e forma dos esporos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Dekkera bruxellensis 
Candida albicans 
 C Zygosaccharomyces bailii 
32 
 
 
 
 
1. Introdução 
O crescimento dos organismos pode ser encarado individualmente ou coletivamente. 
Nos seres superiores geralmente, é dedicada maior relevância ao crescimento individual. Nos 
microrganismos, porém, dadas as suas reduzidas dimensões, leva a que se dê , como regra, 
mais atenção ao crescimento das populações. 
A maior parte dos microrganismos divide-se por fissão binária ou por gemulação, dando 
uma célula origem a duas ao fim de determinado período de tempo. Durante este período, se 
as condições ambientais se mantiverem constantes, a duplicação do número de células é 
acompanhada pela duplicação de biomassa e de outros componentes celulares mensuráveis 
(proteínas, DNA, etc). De facto, em condições fisiológicas adequadas, os microrganismos 
multiplicam-se rapidamente, passando por uma fase de adaptação, por uma fase de 
crescimento exponencial, por uma fase estacionária de crescimento e por uma fase de mortecelular. 
 
A avaliação do crescimento microbiano, em determinado momento, pode ser efetuada 
através de determinação de biomassa (peso seco), de densidade óptica, de massa de um 
componente celular, quantidade de substrato consumido ou produto formado, de taxas 
metabólicas, contagens de células totais e de unidades viáveis. 
 
2.Objectivos 
 Comparação de métodos de avaliação do crescimento microbiano; 
Trabalho Prático nº 5 
Crescimento Microbiano 
 
33 
 
 Compreender o conceito de UFC (unidade formadora de colónias). 
 
3. Material necessário 
3.1. Avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem em câmara 
Culturas de microrganismos 
Microscópio 
Câmara de contagem 
 
3.2. Determinação do número de células viáveis - Contagem em placas 
Culturas de microrganismos (Saccharomyces cerevisiae) 
Tubos de ensaio com 9 ml de água estéril (solução salina) 
Placas de Petri com meio apropriado à cultura 
Agitador de tubos 
Pipetas esterilizadas de 1 ml 
Espalhador 
 
 
 
4. Procedimento experimental 
4.1. Avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem em câmara 
Neste método são contadas células viáveis e não viáveis, por contagem direta ao microscópio 
usando uma câmara de contagem, ou por contagem eletrónica. 
1. Coloque na câmara uma gota da suspensão de microrganismos; 
2. Cobra com a lamela; 
3. Conte o número de células por quadrado (na zona central estão gravadas duas grelhas 
que são constituídas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um 
com uma área de 1/400 mm2); para que o valor seja mais preciso fazer contagens em 
diferentes quadrados e determinar a média; Aplicar a seguinte fórmula: 
1000
quadrado do Área x Prof.
1
 quadradopor m.o. medioNm.o./mL deN 00  
Profundidade = 0,100 mm; Área = 0,0025 mm2; Nº de m.o./mL = média por quadrado x 4x106 
 
34 
 
 
 
4.2. Determinação do número de células viáveis - Contagem em placas 
Neste método recorre-se às diluições decimais progressivas do inóculo e sua incorporação em 
meio sólido em placa. São contadas colónias em placa (placas com 15-150 colónias) e o 
resultado é expresso em unidades formadoras de colónias (UFC), que corresponderão a células 
viáveis. Embora moroso, é o método de referência, dada a sua elevada sensibilidade. É um 
método particularmente utilizado em Microbiologia Alimentar e Microbiologia de Águas. 
 
Nota: Antes de começar a efetuar as diluições, identifique os tubos de diluição e as placas com 
os fatores de diluição apropriados. Nas placas, identifique ainda a turma, o grupo e a data. 
 
1. Faça 5 diluições decimais em série da cultura fornecida, da seguinte forma: 
1.1. Pipete 1 mL da cultura original para o tubo marcado para a 1ª diluição (10-1) e 
agite, de forma a homogeneizar a 
suspensão de microrganismos; 
1.2. A partir desta diluição, faça as 
restantes diluições de forma 
sequencial (10-2, 10-3, 10-4 e 10-5), 
sempre retirando 1 mL da suspensão 
anterior; 
2. Após efetuar as 5 diluições, inocule 0,1 mL 
da suspensão celular correspondente a 
cada diluição nas respetivas placas de Petri 
contendo meio de leveduras e espalhe 
imediatamente (de outro modo, o agar 
pode absorver o fluido da amostra e 
provocar uma alta concentração de células 
nesse ponto da placa); 
3. Incube as placas em posição invertida, a 25ºC durante 48 horas; 
35 
 
4. Escolha o número de placas que contenham 15 a 150 colónias e efetuar a contagem. 
5. Determine o valor médio de colónias por placa e multiplicar pelo fator de diluição. O 
resultado será expresso em UFC/ml. 
 
5. Resultados 
1. Relacione os valores obtidos por contagem direta ao microscópio e por contagem em 
placa, para a mesma suspensão de células; 
 
 
36 
 
 
 
 
1. Introdução 
Os microrganismos efetuam as suas variadas atividades bioquímicas utilizando 
nutrientes obtidos a partir do ambiente que os rodeia. Essas reações bioquímicas que ocorrem 
dentro ou fora dos microrganismos são catalisadas por enzimas. 
 No laboratório, é possível demonstrar algumas das atividades bioquímicas através da 
observação da capacidade dos microrganismos usarem enzimas para degradar hidratos de 
carbono, lípidos, proteínas e aminoácidos. Geralmente, a metabolização destas moléculas 
orgânicas origina produtos finais cuja deteção pode ajudar na caracterização e identificação dos 
microrganismos. 
 
2. Objetivos 
 Conhecer princípios e procedimentos de diversas provas bioquímicas usadas na 
identificação de microrganismos; 
 Analisar as provas bioquímicas realizadas (leituras diretas e indiretas). 
 
A) Prova do indol 
O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido 
triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol. 
O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades 
enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é 
mediada pela enzima triptofanase. 
Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e 
acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como 
marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem 
metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol. 
Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água peptonada, 
para fazer a inoculação. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o 
reagente de Kovac’s (amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com 
o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. 
Trabalho Prático nº 6 
Identificação de microrganismos por testes bioquímicos 
 
37 
 
As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente 
são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato 
triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa. 
 
Material necessário 
Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis 
Tubos com água peptonada 
Reagente de Kovac’s 
 
Procedimento experimental 
1. Inocule separadamente cada uma das culturas nos tubos com água peptonada; 
2. Identifique cada um dos tubos com a espécie inoculada; 
3. Incube a 37ºC durante 24 h; 
4. Adicione o reagente de Kovac’s. 
 
Resultados 
Observe a formação de anel avermelhado. 
 
B) Hidrólise do amido 
As moléculas de amido são constituídas por amilose e amilo pectina que são 
rapidamente hidrolisadas por algumas bactérias, usando as suas -amilases (enzimas 
extracelulares), que quebram as ligações glicosídeas originando dextrinas, glicose e maltose. 
Utiliza-se uma solução de iodo para indicar a presença de amido. Quando o iodo 
contacta com o amido, forma um complexo azul acastanhado. O amido hidrolisado não produz 
alteração de cor. Se aparecer uma zona clara após adição de iodo a um meio que contenha 
amido e crescimento bacteriano é porque a -amilase foi produzida pela bactéria. Se não 
ocorrer uma zona clara, o amido não foi hidrolisado. 
 
Material necessário 
Placa de Petri com meio de cultura contendo amido 
Cultura de Bacillus subtilis 
Cultura de Escherichia coli 
Solução de Lugol 
38 
 
 
Procedimento Experimental 
1. Com uma caneta de acetato, divida a placa de Petri em três secções; 
2. Inocule Bacillus subtilis e E. coli na placa (utilizando a técnica do estriamento), uma em 
cada secção marcada. Use a 3ª secção como controlo negativo; 
3. Incube a 30 °C durante 5 dias; 
4. Ao fim desse período, adicione às culturas solução de Lugol; 
5. Classifique as bactérias de acordo com o seguinte critério: 
Cor castanha – amilase + 
Cor azul-escuro – amilase – 
Nota: O amido reage com o iodo, resultando na alteração da cor da solução de iodo de 
castanho para azul-escuro. As áreas de hidrólise apresentam manchas nítidas de iodo 
(castanho); amido não hidrolisadoadquire cor azul muito escuro. 
 
C) Prova da urease 
O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a 
ureia através da enzima urease. 
 A urease é uma enzima produzida por alguns microrganismos, mas é especialmente 
importante para identificar espécies de Proteus relativamente a bactérias entéricas lactose 
negativas. É uma enzima hidrolítica que ataca a ligação entre o azoto e o carbono em 
compostos como a ureia, formando o produto final alcalino, amónia, além de CO2 e H2O. 
A presença de urease deteta-se quando o microrganismo cresce num meio com ureia 
(meio de ureia de Christensen) que contém também o indicador de pH, vermelho de fenol. 
Quando a ureia é desdobrada pela urease, a amónia acumula-se no meio tornando-o alcalino 
(pH 8,2). Este aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a rosa, sendo 
uma reação positiva para a presença de urease. A ausência da coloração rosa indica uma reação 
negativa. 
 No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se 
considerar a reação positiva; apenas os microrganismos que produzem precocemente urease 
têm capacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte. 
 
Material necessário 
Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli 
39 
 
Tubos com Agar de ureia 
 
Procedimento experimental 
1. Inocule um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli; 
2. Incube a 37 °C durante 24 horas. 
 
Resultados 
Verifique a alteração da cor do meio e preencha o quadro: 
Espécie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease 
 
 
 
 
D) Prova da catalase 
O objetivo desta prova é determinar a capacidade dos microrganismos de produzir a 
enzima catalase para degradar o peróxido de hidrogénio. 
 Durante a respiração aeróbia, os microrganismos produzem peróxido de hidrogénio 
(H2O2) e, em alguns casos, o ião superóxido (O2-). A acumulação destas substâncias leva à morte 
das células, a não ser que aquelas possam ser enzimaticamente degradadas. Essas substâncias 
são produzidas quando aeróbios, anaeróbios facultativos e microaerófilos usam o oxigénio 
como recetor final de eletrões. Os microrganismos com capacidade para produzir catálase ou 
peroxidase degradam o peróxido de hidrogénio a água e oxigénio. 
 A produção de catalase pode ser determinada adicionando o substrato H2O2 a uma 
cultura, em meio em rampa, incubada previamente. Se a catálase foi produzida pelo 
microrganismo ocorre libertação de bolhas de gás (oxigénio livre) e a prova é positiva. A 
ausência de formação de bolhas de gás é uma prova negativa. 
 Um procedimento alternativo consiste em determinar a produção de catalase 
adicionando uma porção de bactérias, previamente colocadas numa lâmina, umas gotas de 
peróxido de hidrogénio. Se a bactéria produzir esta enzima (catalase positiva) ocorre o 
desdobramento do peróxido de hidrogénio com libertação imediata de bolhas de gás 
(oxigénio); a ausência deste borbulhar é uma prova negativa. 
 
 
40 
 
Material necessário 
Lâminas 
Culturas de Bacillus sp 
Culturas de Lactobacillus sp. 
Água oxigenada (3%) 
 
Procedimento Experimental 
1. Com a ajuda de uma ansa, transfira uma porção de células para uma lâmina de vidro; 
2. Sobre as células coloque uma gota de peróxido de hidrogénio; 
3. Observe a formação de bolhas durante 5 minutos; 
4. Classifique as bactérias de acordo com o seguinte critério: 
Formam-se bolhas – catalase + 
Não se formam bolhas – catalase – 
 
E) Prova das oxídases 
 Esta prova permite distinguir grupos de microrganismos tendo como base a atividade da 
enzima citocromo oxídase. 
 As oxídases têm um papel importante no sistema de transporte de eletrões durante a 
respiração aeróbia. A citocromo oxídase catalisa a oxidação de um citocromo reduzido pelo 
oxigénio molecular, resultando na formação de H2O e de um citocromo oxidado. As bactérias 
aeróbias e algumas anaeróbias facultativas e microaerófilas exibem atividade da oxídase. 
 Esta prova é importante para distinguir grupos de bacilos Gram negativo patogénicos. 
 A capacidade das bactérias produzirem esta enzima pode ser determinada pela adição 
do reagente das oxídases (dihidrocloreto de tetrametil p-fenilenodiamina). Este reagente de cor 
rosa age como um substrato artificial, fornecendo eletrões e consequentemente ficando 
oxidado, tornando-se um composto escuro (castanho-negro) na presença de oxídase e de 
oxigénio livre. 
 Após a adição do reagente o desenvolvimento da coloração rosa depois castanha e 
finalmente negra na superfície das colónias é indicativo da produção de citocromo oxídase e 
representa uma prova positiva. Se não houver mudança de cor ou se as colónias apresentarem 
uma coloração rosa ligeira é indicativo da ausência de atividade da oxídase e é uma prova 
negativa. 
 
41 
 
Material necessário 
Culturas de Escherichia coli e de Bacillus subtilis 
Papel de filtro 
Dihidrocloreto tetrametil-p-fenildiamina.HCl (1% W/V em água) 
 
Procedimento Experimental 
1. Adicione uma gota de reagente de oxidase sobre uma colónia; 
2. Observe a mudança de cor para cor-de-rosa e depois para púrpura durante 1 minuto; 
3. Classifique as bactérias de acordo com o seguinte critério: 
Mudança de cor de rosa → castanho → violeta→ negro – oxidase + 
Não se regista mudança de cor – oxidase – 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
 
 
 
1. Introdução 
 Os antibacterianos são um grupo de substâncias de origem bacteriana, fúngica, semi-
sintética ou sintética, que provocam a morte bacteriana (bactericidas) ou inibem a 
multiplicação bacteriana (bacteriostáticos). 
O comportamento dos microrganismos aos agentes quimicos é muito heterógeneo. Nestas 
condições a realização de ensaios in vitro, o antibiograma, assume grande importância, pois 
permite determinar o comportamentos de estirpes bacterianas face aos divesos antibióticos. 
Com o objetivo de obter resultados reprodutiveis de laboratório para laboratório, estas 
técnicas seguem regras rigidas, recomendadas pelo National Committee for Clinical Laboratory 
Standards. 
Os métodos mais utilizados para determinar a sensibilidade microbiana a estes agentes são: a 
difusão em agar (antibiograma), a difusão em gradiente e a diluição em caldo ou agar. 
 
2. Objetivos 
 Conhecer os princípios dos vários métodos de executar TSA; 
 Conhecer os procedimentos práticos das técnicas; 
 Executar e analisar TSA (método de difusão em agar); 
 Saber interpretar TSA; 
 Saber como determinar as concentrações mínima inibitória e minima bactericida; 
 Compreender a importância dos TSA em microbiologia. 
 
A) Método de difusão em agar 
Este método é muito utilizado, é de prática muito simples e rápida, mas só dá resultados 
qualitativos. Baseia-se na propriedade de difusão, segundo um gradiente de concentração, do 
antibiótico que está impregnado num papel de filtro, em agar nutritivo - agar Mueller-Hinton. A 
bactéria semeada não crescerá numa área concêntrica à volta de um disco com antibiótico, se 
aí existirem concentrações do antibiótico igual ou superiores à concentração inibitória mínima. 
Haverá um halo de inibição à volta do disco, maior ou menor conforme a sensibilidade da 
estirpe bacteriana. É de notar que outros fatores podem intervir nas dimensões dos halos de 
Trabalho Prático nº 7 
Teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos (TSA) 
 
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inibição bacteriana, a referir: propriedades físico-químicas do antibiótico; natureza do meio de 
cultura e inóculo. 
 
Material necessário 
 Placas de Petri com meio de cultura Mueller-Hinton; 
 Tubos com 5 mL soro fisiológico; 
 Zaragatoas; 
 Discos de antibióticos; 
 Pinça; 
 Régua; 
 Culturas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis. 
 
Procedimento experimental 
1. Inocule 3 a 4 colónias das bactérias em 5 mL de soro fisiológico; 
2. Com uma zaragatoa, retire uma pequena porçãodo inoculo e espalhe uniformemente 
em placa contendo meio Müeller-Hinton, passando a zaragatoa em toda a superfície em 
três direções; 
3. Deixe secar durante 5 minutos; 
4. Coloque os discos de antibióticos 
sobre a superfície do agar 
utilizando uma pinça estéril, 
pressionando ligeiramente no 
agar. Os discos devem ser 
colocados a 15 mm do rebordo 
da placa e bastante separados 
entre si, para que não haja 
sobreposição das zonas de 
inibição (aproximadamente 20 
mm); 
5. Deixe as placas 15 minutos à 
temperatura ambiente, para que 
se inicie a difusão dos 
antibióticos; 
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6. Incube a placa em posição invertida a 37 ºC durante 18 a 24 horas; 
7. Meça o diâmetro das zonas de inibição com uma régua. Para facilitar a medição, as 
placas devem ser colocadas numa superfície de fundo escuro. 
 
Interpretação dos Resultados: 
Os diâmetros dos halos de inibição traduzem as categorias de resistente (R), 
intermédio (I), moderadamente sensível (MS) ou sensível (S), de acordo com os critérios 
interpretativos do Quadro: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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