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9 @lilyfazvet O metabolismo microbiano consiste na soma de todas as reações químicas que liberam ou precisam de energia dentro de uma célula ou um organismo vivo; As reações envolvidas na liberação e na utilização de energia são traduzidas como a capacidade de realizar trabalho; Existem diferentes tipos de trabalho, como por exemplo: - produção de enzimas; - reparação de danos celulares; - síntese de parede celular e membrana citoplasmática. A fonte de energia utilizada por alguns organismos durante os processos metabólicos são as moléculas químicas (nutrientes) que são absorvidas pelas células; Quando as ligações químicas desses nutrientes são quebrados, a energia é liberada em sua forma química, que é armazenada pela célula e posteriormente utilizada para executar trabalho; Para outros organismos, a fonte de energia é a luz (fotossintetizantes) e, quando expostos à ela, eles convertem a energia luminosa em energia química, que é utilizada no metabolismo; Como as reações químicas tanto liberam quanto requerem energia, o metabolismo pode ser visto como um balanceamento de energia; O processo metabólico pode ser dividido em catabolismo e anabolismo. O catabolismo consiste no conjunto de reações químicas que liberam energia, ou seja, as reações que quebram compostos orgânicos complexos em compostos mais simples; Geralmente essas reações são de hidrólise - reações que usam água e nas quais ligações químicas são quebradas; As ligações químicas armazenam energia, entretanto, quando elas são quebradas, essa energia é liberada, como por exemplo: células que quebram açucares em dióxido de carbono e água; São exemplos de reações catabólicas: glicólise, respiração celular aeróbica e anaeróbica, fermentação e a quebra de lipídeos no tecido adiposo para liberação de ácidos graxos. molécula complexa molécula simples 10 @lilyfazvet O anabolismo é composto pelas reações que requerem energia e se baseia na construção de moléculas orgânicas compostas a partir de moléculas mais simples; Esses processos muitas vezes envolvem reações de síntese por desidratação (liberam água) e requerem energia para formar novas ligações, como a formação de proteínas a partir de aminoácidos; Toda célula viva requer energia para realizar diferentes tipos de trabalho, como: - mobilidade; - crescimento e multiplicação; - membrana ou apêndices externos; - biossíntese das partes estruturais da célula, como paredes celulares, - síntese de enzimas, ácidos nucleicos, polissacarídeos, fosfolipídios e outros componentes químicos da célula; - reparo de danos e manutenção da célula em boas condições; - armazenamento de nutrientes e excreção de produtos de escória. Essa energia é obtida através da quebra de moléculas orgânicas, armazenada na forma de ATP e utilizada na síntese de moléculas ou outras funções celulares; As vias metabólicas da célula (sequências de reações químicas) são determinadas por suas enzimas, que por sua vez são determinadas pela constituição genética da célula; As enzimas funcionam como catalisadores biológicos nas células, ou seja, elas aceleram as reações bioquímicas até uma temperatura que seja compatível com o funcionamento normal da célula; A enzima é constituída por duas partes: - apoenzima: porção proteica - cofator: porção não proteica (íon metálico ou uma molécula inorgânica “coenzima”) Quando a apoenzima se une ao cofator eles formam uma holoenzima ou enzima completa; Os reagentes em que as enzimas atuam são chamados de substratos; producao de energia A maioria dos microrganismos oxida carboidratos como sua fonte primária de energia celular, dessa forma, o catabolismo de carboidratos se torna importante para o metabolismo celular. moléculas simples molécula complexa 11 @lilyfazvet A glicose é o carboidrato fornecedor de energia mais comum utilizado pelas células, mas diversos lipídeos e proteínas podem ser catabolizados para a produção de energia; Para produzir energia partir da glicose, os microrganismos utilizam de dois processos gerais: a cadeia respiratória e a fermentação; Os microrganismos decidem qual das duas vias é mais pertinente, ou seja, qual delas que o garante uma aceitabilidade maior. Glicolise A glicólise consiste em um processo anaeróbico da oxidação da glicose até o ácido pirúvico; Ela também é a primeira etapa do catabolismo de carboidratos e ocorre na maioria das células vivas; Seu resultado final gera dois ATPs e duas moléculas de NADH para cada molécula de glicose. Cadeia Respiratoria Após a quebra da glicose em ácido pirúvico, esse ácido pode ser guiado à via da fermentação ou da respiração celular; A respiração celular, ou respiração, é um processo gerador de ATP no qual moléculas são oxidadas e o aceptor final de elétrons é (quase sempre) uma molécula inorgânica; Uma característica essencial da respiração é a ação de uma cadeia transportadora de elétrons; Classificação das enzimas com base no tipo de reação química catalisada 12 @lilyfazvet Existem dois tipos de respiração: a respiração aeróbica, que utiliza oxigênio como aceptor final de elétrons; e a respiração anaeróbica, que não utiliza oxigênio e tem como aceptor final de elétrons uma molécula inorgânica que não seja o oxigênio ou, raramente, uma molécula orgânica. Respiração Aeróbica A respiração aeróbica é dividida em três partes: a glicólise, o ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa; A glicólise ocorre no citoplasma e consiste na quebra parcial da glicose em duas moléculas de ácido pirúvico; Durante esta quebra, uma parte da sua energia é liberada em quatro parcelas, permitindo a produção de quatro moléculas de ATP; Como duas moléculas são gastas para ativar a glicose, o saldo final dessa etapa é de 2ATPs; Além disso, também ocorre a desidrogenação (eliminação de hidrogênio), com a formação de NADH+ H+; O ciclo de Krebs ocorre na matriz das mitocôndrias; Antes de o ciclo se iniciar, há uma etapa preparatória, na qual o ácido pirúvico é desidrogenado e descarboxilado, resultando em uma molécula de NADH + H+ e uma de CO2, formando assim a acetila; A acetila liga-se à coenzima A e passa a ser chamada de Acetil-Coenzima-A, ou Acetil- CoA; Após a produção de acetil-CoA ocorre realmente o aproveitamento das substancias produzidas; O saldo final do ciclo de Krebs para cada molécula de piruvato é de 1 ATP, 3 NADH e 1 FADH2; A fosforilação oxidativa, também conhecida como cadeia transportadora de elétrons, ocorre na crista da membrana interna mitocondrial; Esse processo consiste na adição de um grupo fosfato a uma molécula de ADP para efetivar a produção de ATP; Os átomos de hidrogênio retirados pelo NAD das cadeias de carbono durante a glicólise e o Ciclo de Krebs são transportados por várias moléculas intermediárias até o oxigênio, formando água e grandes quantidades de ATP; Na realidade não são transportados átomos de hidrogênio, mas sim seus elétrons, que são obtidos da quebra do hidrogênio em elétron e H+ Durante a respiração aeróbica a glicose é completamente quebrada em dióxido de carbono e água, e ATP é gerado; Esse processo possui três fases principais: a glicólise, o ciclo de Krebs e a cadeia de transporte de elétrons; A etapa preparatória está entre a glicólise e o ciclo de Krebs; O evento essencial na respiração aeróbica équando os elétrons são extraídos dos intermediários da glicólise e do ciclo de Krebs por NAD+ ou FAD e carreados por NADH ou FADH2 até a cadeia de transporte de elétrons; A maioria do ATP gerado pela respiração aeróbica é produzido durante a fosforilação oxidativa. 13 @lilyfazvet Respiração Anaeróbica Respiração anaeróbia é o processo metabólico celular condicionado em ambientes caracterizados pela ausência de gás oxigênio (O2); O aceptor final de elétrons dessa reação é uma substância inorgânica diferente do oxigênio, como por exemplo: algumas bactérias, como Pseudomonas e Bacillus, podem utilizar o íon nitrato como um aceptor final de elétrons, que é reduzido a íon nitrito, óxido nitroso ou nitrogênio gasoso; Outras bactérias, como Desulfovibrio, utilizam o sulfato como aceptor final de elétrons para formar sulfeto de hidrogênio (H2S); A respiração anaeróbica por bactérias utilizando nitrato e sulfato como aceptores finais é essencial para os ciclos do nitrogênio e do enxofre que ocorrem na natureza; A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia de acordo com o microrganismo, mas o rendimento de nunca é tão elevado quanto na respiração aeróbica. Consequentemente, os organismos anaeróbicos tendem a crescer mais lentamente que os aeróbicos. Fermentacao A fermentação é o processo de obtenção de energia pelo qual a molécula orgânica metabolizada não é completamente oxidada; Os produtos dos processos fermentativos dependem do substrato inicial (os mais comuns são açúcares e aminoácidos) e incluem ácidos orgânicos, como os ácidos acético e lático, álcoois, como etanol, metanol e butanol, cetonas como a acetona e gases como dióxido de carbono e hidrogênio molecular. Muitos processos fermentativos conduzidos por bactérias são essenciais para a economia, como: - iogurtes (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus) - queijos (bactérias láticas em geral) - vinagre (Acetobacter). Fotossintese A fotossíntese é realizada por organismos autotróficos, como por exemplo as plantas; 14 @lilyfazvet Ela permite a conversão da energia luminosa em energia química, a qual é então utilizada para a conversão do CO2 da atmosfera em compostos de carbono reduzidos, especialmente açúcares. Neste processo, os elétrons são obtidos a partir dos átomos de hidrogênio da água. A fotossíntese pode ser dividida em duas etapas: fase clara e fase escura. Na fase clara a energia luminosa é utilizada na conversão de ADP em ATP e na redução de NADP em NADPH; Já na fase escura, os elétrons são utilizados, juntamente com o ATP, para reduzir o CO2 a compostos orgânicos. As reações luminosas correspondem à fotofosforilação, onde a energia luminosa é absorvida pelos pigmentos (clorofila, bacterioclorofila), excitando os elétrons, que passam para a primeira de uma série de moléculas transportadoras, semelhante à cadeia de transporte de elétrons; Esse processo garante a passagem de prótons pela membrana, com a conversão de ADP em ATP; A fotofosforilação pode ser de dois tipos: cíclica e acíclica (imagens I e II); No processo cíclico, o elétron retorna à clorofila, enquanto na acíclica, processo mais comum, os elétrons liberados não retornam à clorofila, sendo incorporados ao NADPH; Os elétrons perdidos são substituídos por outros, provenientes da água ou outro composto oxidável, tal como H2S; Já as reações escuras não necessitam de luz para que ocorram e incluem o ciclo de Calvin-Benson, onde o CO2 é fixado. Os organismos podem ser classificados metabolicamente de acordo com seu padrão nutricional: - fonte de energia: fototróficos (usam luz como fonte de energia primária) e quimiotróficos (dependem de reações de oxidação-redução de compostos orgânicos e inorgânicos); - fonte de carbono: autotróficos (nutrição própria) e heterotróficos (nutrição dependente de outros); 15 @lilyfazvet Combinando as fontes de energia e carbono, surgirão as seguintes classificações para os organismos: - fotoautotróficos - foto-heterotróficos - quimioautotróficos - quimio-heterotróficos Fotoautotroficos São os organismos que utilizam a luz como fonte de energia e o dióxido de carbono como sua principal fonte de carbono; Eles incluem as bactérias fotossintéticas (bactérias do enxofre verdes - Chlorobium) e bactérias do enxofre púrpura (Chromatium) e cianobactérias), algas e plantas verdes. Foto-heterotroficos Os organismos foto-heterotróficos utilizam a luz como fonte de energia e compostos orgânicos, como álcoois, ácidos graxos, outros ácidos orgânicos, e carboidratos, como fonte de carbono; São exemplos desses organismos: bactérias verdes, tal como Chloroflexus, e as bactérias púrpuras, tal como Rhodopseudomonas. Quimioautotroficos Os organismos quimioautotróficos utilizam os elétrons de compostos inorgânicos reduzidos como fonte de energia e utilizam o CO2 como sua principal fonte de carbono; Servem como fontes inorgânicas de energia para estes microrganismos: - sulfeto de hidrogênio para Beggiatoa; - enxofre elementar para Thiobacillusthiooxidans; - amônia para Nitrosomonas; - íons nitrito para Nitrobacter; - gás hidrogênio para Hydrogenomonas; - íons ferro para Thiobacillusferrooxidans. Quimio-heterotroficos Os organismos quimio-heterotroficos utilizam especificamente os elétrons a partir de átomos de hidrogênio em compostos orgânicos como sua fonte de energia; 16 @lilyfazvet Eles são melhor classificados de acordo com sua fonte de moléculas orgânicas: os saprófitas vivem em matéria orgânica morta e os parasitas obtêm nutrientes do hospedeiro vivo, como a maioria das bactérias, todos os fungos e os protozoários. O termo crescimento microbiano, na microbiologia, refere-se ao aumento no número de células; Os microrganismos que crescem estão aumentando em número e se acumulando em colônias de centenas ou milhares de células ou populações de bilhões de células; Apesar de cada célula poder dobrar de tamanho durante o processo, essa mudança não é muito significativa em comparação ao aumento de tamanho durante o desenvolvimento das plantas e dos animais; Os fatores necessários para o crescimento microbiano podem ser divididos em duas categorias principais: - fatores físicos: incluem temperatura, pH e pressão osmótica; - fatores químicos: incluem fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio, elementos traços e fatores orgânicos de crescimento. Fatores Fisicos Temperatura: - a maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos; - existem três tipos de temperaturas: a temperatura de crescimento mínima, a temperatura de crescimento ótima e a temperatura de crescimento máxima; - a temperatura de crescimento mínima consiste na temperatura onde a espécie é capaz de crescer - a temperatura de crescimento ótima é onde a espécie apresenta melhor taxa de crescimento; - já a temperatura de crescimento máxima é maior do que a temperatura ideal, mas onde ainda é possível o crescimento; - além disso, os microrganismos são classificados em 3 grupos: os psicrófilos, que crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 °C); os mesófilos, que crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 °C); os termófilos, que crescem em altas temperaturas (40 a 70 °C); e os termófilos extremos, que crescem em temperaturas aindamais elevadas (68 a 110 °C). Área de Alimentos Psicrófilos: são encontrados em oceanos e regiões da Ártica e não causam problemas na preservação de alimentos. Sua temperatura ótima é de 15 °C Psicrotróficos: crescem em temperatura de refrigeradores (4 °C) e são encontrados em alimentos estragados. Sua temperatura ótima é de 20 a 30 °C Mesófilos: são os mais encontrados, pois habitam o corpo de animais (temperatura da pele). Sua temperatura ótima é de 25 a 40 °C Termófilos: habitam ambientes de águas termais (não crescem a < 45 °C) e materiais estocados, como a compostagem. Sua temperatura ótima vai de 50 a 60 °C. 17 @lilyfazvet pH: - o pH refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma solução; - a maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 – 7,5) e poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como pH 4,0); - as bactérias capazes de sobreviver à altos níveis de acidez são chamadas de acidófilas (Thiobacillus – pH de 0,5 a 6,0 com ótimo crescimento entre 2 e 3,5); - já as bactérias capazes de viver em ambientes com uma taxa de acidez muito baixa são chamadas de alcalifílicas (Bacillus e Archaea - pH 10 – 11); - vale ressaltar que os fungos tendem a ser mais acidófilos do que as bactérias (pH <5). Pressão Osmótica: - os microrganismos retiram da água a maioria dos nutrientes solúveis; - a pressão osmótica consiste na retirada de H2O de dentro da célula; - durante reações hipertônicas há perda de H2O do meio intracelular para o extracelular, através da membrana plasmática (meio com concentração de sais). - já durante a plasmólise ocorre a diminuição da membrana plasmática da célula devido à perda de H2O por osmose. Fatores Quimicos Água: - a água é essencial para os microrganismos; - ela possui uma disponibilidade variável no ambiente; - ambientes com menor concentração de água fazem os microrganismos desenvolverem mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos). Fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo: - Carbono: - é essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico para os seres vivos); - os organismos quimio-heterotróficos obtém carbono a partir de materiais orgânicos, como proteínas, carboidratos e lipídeos. - Nitrogênio: - o nitrogênio é utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos aminoácidos; - ele é obtido a partir da decomposição de materiais orgânicos, da amônia (NH4+) e do nitrato (NO3-); - vale ressaltar que algumas bactérias são capazes de utilizar o nitrogênio Taxa de crescimento vs. Concentração de sal - Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a sua presença no meio; - Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a sua presença no meio; - Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada; - Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. 18 @lilyfazvet gasoso diretamente da atmosfera (fixação de N); - alguns microrganismos do solo utilizam este processo para obtenção de nitrogênio tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas – soja, feijão); - Importante: o cultivo de leguminosas aumenta fertilidade do solo sem a necessidade da implementação de fertilizantes químicos. - Enxofre: - o enxofre é utilizado na síntese de aminoácidos que contém S e de vitaminas (tiamina e biotina); - ele pode ser encontrada nos íons de sulfato (SO4-2), no sulfito de hidrogênio e nos aminoácidos. - Fósforo: - o fósforo é essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídios componentes da membrana celular; - ele pode ser encontrado nos íons de fosfato (PO4-3), no DNA, no RNA e no ATP. - Potássio, Magnésio e Cálcio: - também são elementos essenciais para os microrganismos; - eles são frequentemente encontrados como co-fatores para as reações enzimáticas. - Elementos Traços: - os elementos traços são o ferro, o cobre, o molibdênio e o zinco; - eles são utilizados como co-fatores essenciais para atividade de algumas enzimas; - utilizar a água destilada para meio de cultura garante que todos os elementos traços estejam contidos no ambiente microbiano. Oxigênio: - o oxigênio é extremamente importante no desenvolvimento microbiano - os organismos podem ser classificados em: aeróbios, quando necessitam de O2, e anaeróbios, quando não necessitam de O2; A divisão bacteriana consiste no aumento do número de indivíduos e não do tamanho celular; Ela pode acontecer de maneiras diferentes: brotamento e fissão binária. Brotamento O brotamento é um tipo de reprodução assexuada no qual o broto é formado e pode soltar-se do organismo que o gerou, formando um novo indivíduo; Tem-se como exemplos de organismos que se reproduzem por brotamento os fungos, as hidras, as esponjas e até certas plantas. Aeróbios: - estritos: necessitam de O2; - facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2; - microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores. Anaeróbicos: - aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2; - estritos: não toleram O2 (letal) 19 @lilyfazvet Fissao Binaria Durante a fissão binária, ou divisão binária, ocorre a divisão do organismo ao meio, originando outro ser idêntico ao que foi dividido; O processo ocorre da seguinte maneira: - a célula se alonga e o seu DNA cromossomal é replicado; - início da invaginação da parede celular e da membrana plasmática; - as duas seções da parede celular se encontram; - produção de duas células individuais idênticas à célula mãe. Esse processo é comum em protozoários, bactérias e também em planárias; O tempo necessário para uma célula se dividir é chamado de tempo de geração; Esse tempo varia de acordo com o organismo e depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura, etc), mas na maioria das bactérias:1–3 h. Fases de Crescimento A curva de crescimento demonstra o crescimento das células durante um certo período de tempo; Essa curva é obtida pela contagem da população em intervalos de tempo após um inoculo de um número pequeno de bactérias em meio de cultura; Existem quatro fases de crescimento, sendo elas: - fase lag: pouca ou ausência de divisão celular (estado de latência, com intensa atividade metabólica) - ≥ 1 hora; - fase log: início do processo de divisão (reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças ambientais – efeitos de antibióticos); - fase estacionária: a velocidade de crescimento diminui e o número de células vivas se iguala ao de células mortas - fase de morte celular: o número de células mortas excede o de células novas. Metodos para quantificar o crescimento Existem duas formas de quantificar o crescimento bacteriano: a quantificação direta e a quantificação indireta; Quantificação Direta: Contagem de placas: - é a técnica mais utilizada na determinação do tamanho do população bacteriana; - sua vantagem é a qualificação de células viáveis, mas, em contra partida, tem como desvantagem o tempo necessário para o aparecimento das colônias (24). Filtragem: - a filtragem é utilizada para a contagem de números pequenos de bactérias; - ela consiste na concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito20 @lilyfazvet pequenos após a passagem de um volume de 100 mL de água. - esse filtro, posteriormente, é transferido para uma placa de petri contendo um meio sólido. Método do número mais provável (NMP): - é utilizado para a contagem de microrganismos que não crescem bem em meio sólido; - esse processo consiste na realização de diluições: diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL); diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL); diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL); - a partir da contagem do número de tubos positivos é possível ter uma estimativa do no de células/mL de bactérias. Contagem direta ao microscópio: - nesse método, um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio; - se utiliza de câmeras de contagem para a realização do processo e a amostra pode ser corada ou analisada a fresco; - suas desvantagens são: não conseguir separa as células mortas das vivas e a chance de haver um erro na contagem. Quantificação Indireta Turbidimetria: - há o monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez; - quanto maior o número de bactérias, menor a luz refletida; - esse processo é realizado a partir de um espectrofotômetro (660 nm). Atividade metabólica: - a quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas; - a quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao número de bactérias presentes; Peso seco: - esse método é utilizado principalmente para fungos filamentosos; - nele, o fungo é removido do meio por filtração, seco em dessecador e posteriormente submetido a pesagem. ADP: significa difosfato de adenosina; ATP: significa trifosfato de adenosina (nucleotídeo formado por uma base nitrogenada- a adenina; um açúcar – a ribose e três moléculas de ácido fosfórico) e sua função é armazenar energia; NAD: a sigla significa nicotinamida-adenina dinucleotídeo e a sua função no organismo é transportar hidrogênios; NADH2: significa nicotinamida-adenina dinucleotídeo; FAD: significa flavina-adenina dinucleotídeo e a sua função no organismo é transportar hidrogênios; FADH2: significa flavina-adenina dinucleotídeo.
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