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PESQUISA ORIGINAL publicado: 24 de maio de 2018 doi: 10.3389 / fnut.2018.00044 Células cancerosas colorretais aumentam a produção de gordura de cadeia curta Ácidos por Propionibacterium Freudenreichii Impacto na sobrevivência das células cancerosas Marta R. Casanova 1,2, João Azevedo-Silva 2, Ligia R. Rodrigues 1 † e ana preto 2 * † 1 Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Braga, Portugal, 2 Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Departamento de Biologia, Universidade do Minho, Braga, Portugal Propionibacterium freudenreichii é uma bactéria comercialmente relevante com potencial probiótico. Essa bactéria pode exercer efeitos protetores principalmente contra o câncer colorretal (CRC), por meio da produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), a saber, acetato e propionato. Neste trabalho, objetivamos avaliar o desempenho e capacidade de adaptação de P. freudenreichii a um estresse digestivo simulado usando diferentes meios de cultura, nomeadamente YEL, meio basal, imitando o conteúdo do meio do cólon humano (MCHC) e DMEM. O efeito do caldo de cultura fermentado na sobrevivência das células CRC e do meio condicionado das células CRC no desempenho das bactérias também foi avaliado. Meio basal foi considerado o melhor para P. freudenreichii para produzir SCFA. O meio MCHC, apesar de ser o meio no qual menores quantidades de acetato e propionato foram produzidas, apresentou maiores rendimentos de acetato e propionato quando comparado a outros meios. Observamos também que a presença de lactato no meio de crescimento condicionado das células CRC, resultante do metabolismo celular, leva ao aumento da produção de SCFA pelas bactérias. O caldo fermentado bacteriano inibiu com sucesso a proliferação de células CRC e aumentou a morte celular. Nossos resultados mostraram pela primeira vez que P. freudenreichii o desempenho pode ser estimulado pelo lactato extracelular produzido pelo interruptor metabólico do CRC, também conhecido como “efeito Warburg”, onde as células cancerosas “fermentam” a glicose em lactato. Além disso, nossos resultados sugerem que P. freudenreichii pode ser potencialmente usado como um probiótico na prevenção do CCR em estágios iniciais do processo de carcinogênese e pode ajudar nas abordagens terapêuticas do CCR. Editado por: Aldo Corsetti, Università di Teramo, Itália Revisados pela: Analia Graciela Abraham, Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), Argentina Giuseppe Conte, Università degli Studi di Pisa, Itália * Correspondência: Ana preto apreto@bio.uminho.pt † Esses autores contribuíram igualmente a este trabalho. Seção de especialidades: Este artigo foi submetido a Microbiologia Alimentar, uma seção do jornal Fronteiras em Nutrição Recebido: 29 de janeiro de 2018 Aceitaram: 03 de maio de 2018 Publicados: 24 de maio de 2018 Palavras-chave: câncer colorretal, Propionibacterium freudenreichii, probiótico, ácidos graxos de cadeia curta, acetato, propionato Citação: Casanova MR, Azevedo-Silva J, Rodrigues LR e Preto A (2018) Células de câncer colorretal aumentam a produção de ácidos graxos de cadeia curta por Propionibacterium freudenreichii Impacting on Cancer Cells Survival. Frente. Nutr. 5:44. doi: 10.3389 / fnut.2018.00044 INTRODUÇÃO O câncer colorretal (CCR) constitui uma grande preocupação nos países desenvolvidos por estar associado ao estilo de vida que surge como elemento crítico para sua prevenção ( 1 ) Evidências têm mostrado que dieta com baixo teor de gordura e alta fibra dietética pode ser protetora contra CRC ( 2 - 4 ) O principal impacto dos hábitos alimentares na prevalência de CCR desencadeou a concepção de um regime de dieta ideal e / ou Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 1 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#editorial-board https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#editorial-board https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#editorial-board https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#editorial-board https://doi.org/10.3389/fnut.2018.00044 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.3389/fnut.2018.00044&domain=pdf&date_stamp=2018-05-24 https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ mailto:apreto@bio.uminho.pt https://doi.org/10.3389/fnut.2018.00044 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2018.00044/full http://loop.frontiersin.org/people/552028/overview http://loop.frontiersin.org/people/128127/overview http://loop.frontiersin.org/people/47153/overview http://loop.frontiersin.org/people/158262/overview Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii o desenvolvimento de suplementos alimentares que reduzem especificamente o risco de câncer ( 5 - 7 ) Um crescente interesse no uso de probióticos como agentes de prevenção / tratamento do câncer foi registrado ( 8 , 9 ) Propionibacteria é uma importante classe de probióticos que é bem conhecida por sua longa história de consumo em queijos do tipo suíço ( 10 ) Durante o processo de fabricação do queijo, P. freudenreichii resiste aos estresses físicos e químicos severos exibindo uma alta resistência aos estresses digestivos que é essencial para sua sobrevivência no intestino e também para exercer seus efeitos benéficos ( 11 , 12 ) P. freudenreichii as propriedades benéficas à saúde são resultado da ampla variedade de seus metabólitos funcionais, incluindo acetato e propionato ( 10 , 13 - 15 ) Os ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), ou seja, acetato, propionato e butirato, estão naturalmente presentes no intestino humano. SCFA são necessários para equilibrar a produção equivalente redox no ambiente anaeróbio do intestino, bem como para manter a homeostase intestinal ( 5 , 16 ) Vários estudos têm mostrado uma variedade de efeitos biológicos do SCFA, e há um grande número de relatos, alguns deles do nosso grupo, mostrando novos mecanismos subjacentes aos efeitos dessas moléculas ( 17 - 23 ) SCFA pode ter efeitos opostos induzindo / inibindo a autofagia e, portanto, inibindo a proliferação de células cancerosas ou induzindo apoptose ( 24 - 26 ) Nesse sentido, nosso grupo demonstrou recentemente que o acetato induz a permeabilização da membrana lisossomal e a liberação de Catepsina D ( 22 ) Além disso, mostramos que a Catepsina D protege as células CRC da apoptose induzida por acetato através da degradação independente de autofagia de mitocôndrias danificadas ( 23 ) Os efeitos antineoplásicos de P. freudenreichii foram avaliados por vários grupos de pesquisa ( 11 , 12 , 15 , 17 , 27 , 28 ) Jan et al. ( 17 ) demonstrou que o Propionibacterium cepas induzem a morte celular em linhas de células de câncer humano, como células HeLa, HT29 e Caco2, aparentemente através da o SCFA produzido. Lan et al. ( 28 ) demonstrado em um na Vivo estudar que P. freudenreichii TL133, através da seus metabólitos, facilitam a eliminação de células danificadas por apoptose no cólon de ratos após insulto genotóxico e podem desempenhar um papel protetor contra o CRC. A manutenção de SCFA no intestino, em níveis que protegem as células normais da mucosa do cólon e matam as células CRC, é de extrema relevância para a prevenção e / ou terapia do CRC. Portanto, nosso objetivo foi avaliar a capacidade de produção de SCFA de P. freudenreichii subsp. freudenreichii, bem como estudar a capacidade das bactérias de se adaptarem ao estresse digestivo. Além disso, nosso objetivo foi avaliar a influência do meio de bactérias na sobrevivência das células CRC e, por outro lado, o efeito do meio condicionado das células CRC no desempenho das bactérias, a fim de compreender melhor o crosstalk entre P. freudenreichii e células CRC. a adaptação foi realizada expondoa bactéria a pH 5,0 (1 h), pH 2,0 (0,5 h) e finalmente a 0,1% (p / v) de sais biliares (2 h). O experimento foi realizado em 37 ◦ C sem agitação e sob condições anaeróbicas. o P. freudenreichii submetido a um desafio de estresse digestivo foi posteriormente inoculado em MCHC líquido, a fim de recuperar uma cultura bacteriana adaptada robusta. Depois de crescimento (até OD 650nm de 0,8-1,0), a cultura bacteriana adaptada foi transferida para meio líquido fresco MCHC para reativar seu metabolismo e foi caracterizada quanto ao crescimento e produção de SCFAs em diferentes meios. Culturas de normal e adaptado P. freudenreichii foram cultivadas sob condições anaeróbicas a 37 ◦ C sem agitação e monitorado em pontos de tempo de fi nidos (0, 16, 24, 40, 48, 64 e 72 h) medindo a absorbância de suspensões celulares a 650 nm em um espectrofotômetro (Hach, Alemanha). Os meios de cultura usados para cultivar as bactérias foram: meio YEL (triptona, 10 g L - 1; acetato de sódio, 8,4 g L - 1; extrato de levedura, 5 g L - 1; resazurina 0,5 mg L - 1; KH 2 PO 4, 0,5 g L - 1; N / D 2 HPO 4 H 2 O, 0,5 g L - 1; 1mL L - 1 de solução de elemento traço H +; 1mL L - 1 de traço elemento OH - solução; 50mL L - 1 de solução de sais e vitaminas; 50mL L - 1 de solução de bicarbonato). Solução de elementos traço H + contém HCl (1,8 g L - 1), H 3 BO 3 ( 61,8mg L - 1), MnCl 2 ( 61,3mg L - 1), FeCl 2 ( 1,0 g L - 1), CoCl 2 ( 64,5mg L - 1), NiCl 2 ( 12,9mg L - 1), e ZnCl 2 ( 67,7mg L - 1). Elementos traço OH - solução contém NaOH (0,4 g L - 1), N / D 2 SeO 3 ( 17,3mg L - 1), N / D 2 OS 4 (29,4 mg L - 1), e Na 2 MoO 4 ( 20,5mg L - 1). A solução de sais e vitaminas contém NH 4 Cl (24 g L - 1), NaCl (24 g L - 1), MgCl 2 6h 2 O (8 g L - 1), CaCl 2 2h 2 O (8,8 g L - 1), biotina (20mg L - 1), nicotamida (0,2 g L - 1), ácido p-aminobenzoico (0,1 g L - 1), tiamina (0,2 g L - 1), ácido pantotênico (0,1 g L - 1), piridoxamina (0,5 g L - 1), cianocobalamina (0,1 g L - 1), riboflavina (0,1 g L - 1), folato (50mg L - 1), e lipoato (50mg L - 1). O bicarbonato solução contém NaHCO 3 ( 80 g L - 1), e Na 2 S.9H 2 O (5 g L - 1). O meio basal (BM) é semelhante ao meio YEL, mas sem triptona e contendo 1 g L - 1 de extrato de levedura. O meio "imitando o conteúdo do cólon humano" (MCHC) ( 29 ) é composto por pectina (0,5 g L - 1), xilano (0,5 g L - 1), mucina (0,5 g L - 1), amido (0,5 g L - 1), peptona (0,5 g L - 1), triptona (2,5 g L - 1), extrato de levedura (0,5 g L - 1), sais biliares (0,05 g L - 1), K 2 HPO 4 ( 2,0 g L - 1), NaHCO 3 ( 0,2 g L - 1), NaCl (4,5 g L - 1), MgSO 4 7h 2 O (0,5 g L - 1), CaCl 2 2h 2 O (0,45 g L - 1), MnCl 2 (0,2 g L - 1), hemina (50mg L - 1), FeSO 4 7h 2 O (5,0 mg L - 1), CoCl 2 6h 2 O (50mg L - 1), entre 80 (2,0mL L - 1), lactato de sódio (2,3 g L - 1), tiamina HCl (4,0 µ g L - 1), pantotenato de cálcio (10 µ g L - 1), ácido nicorínico (5,0 µ g L - 1), p-aminobenzoico ácido (5,0 µ g L - 1), biotina (2.0 µ g L - 1), vitamina b 12 ( 0,5 µ g L - 1), e cisteína (0,8 g L - 1). Águia modificada de Dulbecco O meio (DMEM; Biowest, França) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS; Biowest, França) também foi usado para cultivar culturas de bactérias. As bactérias também foram cultivadas em meio condicionado de células CRC que consiste nos sobrenadantes coletados após o crescimento das células CRC. As células CRC foram cultivadas em 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos (TPP, alemão) a uma densidade de 20 × 10 4 célula mL - 1, usando meio DMEM sem antibiótico. O meio condicionado CRC foi recolhido após 72 h de incubação e foi então diluído (1: 1) em meio DMEM fresco. MATERIAIS E MÉTODOS Cepas bacterianas e condições de crescimento Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii O DSM 20271 foi adquirido na DSMZ (coleção alemã de microorganismos e culturas de células). Bactérias liofilizadas foram reativadas e rotineiramente cultivadas em meio de extrato de levedura-lactato (YEL) a 37ºC ◦ C sem agitação. UMA P. freudenreichii tolerante a um estresse digestivo simulado (bactérias adaptadas) também foi usado. P. freudenreichii a adaptação foi realizada conforme descrito por Lan et al. ( 12 ) com algumas modificações. Resumidamente, o estresse digestivo Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 2 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii Análise de ácidos graxos de pequena cadeia, glicose e biomassa lab ( 22 )], respectivamente. Ácidos puros na mesma concentração de acetato (0,79 g L - 1) e propionato (2,6 g L - 1) que foram detectados no caldo fermentado DMEM foram usados para tratar células CRC por 48 h. Peróxido de hidrogênio (1mM) foi usado como controle positivo, enquanto meio DMEM fresco foi usado como controle negativo. Ambas as condições de meio controle têm em sua composição 1% (v / v) de penicilina-estreptomicina. A ausência de contaminação por Mycoplasma foi avaliada regularmente nas linhagens celulares de acordo com o regulamento do laboratório. Avaliar o efeito do SCFA produzido por adaptado e normal (não adaptado) P. freudenreichii nas células CRC, as células foram tratadas com caldos fermentados BM e DMEM por bactérias adaptadas e normais diluídas (1: 1) em meio DMEM fresco. Caldos fermentados foram coletados após o crescimento bacteriano por centrifugação a 10.000 g por 20min (HERAEUS, Alemanha) e filtração usando filtros estéreis de 0,2 µ m. O pH do caldo fermentado foi ajustado para 7,10 - 7,40 e mantido em - 20 ◦ C com paradigma. Uma parte do caldo fermentado foi esterilizada (121 ◦ C; 15min; 1 bar) para obter caldo fermentado desproteinizado. Peróxido de hidrogênio (1 mM) foi usado como controle positivo; Meio DMEM diluído (1: 1) em meio BM estéril como controle negativo para o caldo fermentado BM e meio DMEM diluído (1: 1) em meio condicionado de células CRC como controle negativo para o caldo fermentado DMEM. O meio condicionado de células CRC usado neste contexto foi um meio DMEM depletado de nutrientes. Frasco de cultura de tecido de 25 cm 2 As culturas contendo CRC foram mantidas por uma semana sem substituir os meios de cultura, garantindo que todos os nutrientes do meio fossem consumidos. Após 1 semana em cultura, o meio condicionado RKO foi removido para um falcon de 15mL e o sobrenadante foi coletado por centrifugação a 1.000 g por 10min. Controles contendo o SCFA puro nas mesmas concentrações presentes em caldos fermentados também foram usados. O ensaio sulforhodamine B (SRB) foi usado para acessar a proliferação celular. Após os tratamentos, as células foram fixadas em metanol gelado contendo 1% de acetato e incubadas com SRB por 1,5 h a 37 ◦ C. Após lavagem com acetato a 1%, o SRB foi solubilizado (Tris 10 mM, pH 10) e a absorbância foi lida a 540 nm em um leitor de microplaca (Molecular Devices, EUA). Os resultados foram expressos em relação ao controle negativo, que foi considerado como 100% de proliferação celular. Lactato, acetato e propionato foram analisados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) equipada com um detector de UV (Jasco, Espanha) usando uma coluna Metacarb 67H (Varian, EUA) operado em 60 ◦ C com 0,01NH 2 TÃO 4 como a fase móvel em 0,6mL min - 1 taxa de fl uxo. Concentração de glicose foi medido usando o mesmo sistema de HPLC, mas equipado com uma coluna Metacarb 87H (Varian, EUA) e um detector RI (KNAUER, alemão) operado usando as mesmas condições de temperatura e fase móvel e uma taxa de fluxo de 0,7mL min - 1 As amostras para análise posterior foram centrifugadas a 10.000 g por 5 min (Eppendorf, Espanha), filtradas com 0,2 µ m fi ltros (GE Healthcare Life Science, Alemanha). Soluções padrão de acetato, propionato e glicose foram usadasem uma ampla gama de concentrações (0–10 g L - 1) foi utilizado para elaborar as curvas de calibração. Uma área de “x” representa (0,0034x - 0,0027; R 2 = 0,9988), (0,0032x - 0,0027; R 2 = 0,9991) e (0,0026x + 36,1222; R 2 = 0,9992) g L - 1 ( para x> 0) de acetato, propionato e glicose, respectivamente. A biomassa foi determinada a partir de uma curva padrão de densidade óptica vs. peso seco. Pesos secos para a curva padrão foram obtidos filtrando a cultura por meio de 0,2 µ filtros m. Após a filtração, os filtros foram secos e pesados. A curva padrão foi traçada a partir dos valores médios de duas determinações, e a biomassa foi obtida a partir da linha de regressão de mínimos quadrados. Todas as fermentações foram realizadas em triplicado, exceto a fermentação DMEM que foi realizada em duplicado. Condições de cultura de células CRC A linha celular RKO derivada de CRC humano (CRL-2577) foi gentilmente cedida por IPATIMUP. As células foram cultivadas como monocamadas a 37 ◦ C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2, em meio DMEM suplementado com 10% (v / v) de FBS e 1% (v / v) de penicilina- estreptomicina (Invitrogen, Portugal). As células RKO foram mantidas em fase de crescimento exponencial e subcultivadas uma ou duas vezes por semana. Para os ensaios, as células subconfluentes, em fase de crescimento exponencial, foram destacadas com tripsina / EDTA (Invitrogen, Portugal) e ressuspensas em meio fresco na densidade adequada. Ensaio de proliferação de células CRC Em todos os tratamentos realizados neste trabalho, as células em fase de crescimento exponencial foram cultivadas em placas de 24 poços a uma densidade celular de 1 × 10 5 célula mL - 1 em um volume final de 0,5 ml por poço, excluindo a análise do ciclo celular em que as células foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade celular de 1,5 × 10 5 célula mL - 1 em um volume final de 1,5mL por poço. As células foram incubadas a 37 ◦ C em 5% CO 2 atmosfera durante 24 h, para permitir a adesão celular. Após a adesão, o meio de cultura foi removido e substituído por diferentes condições de tratamento. Para avaliar o efeito do acetato puro (acetato de sódio; pH 7,1-7,4) e propionato (propionato de sódio; pH 7,1- 7.4) na proliferação de células CRC, as células foram tratadas com os ácidos puros, acetato e propionato, em diferentes concentrações, isoladamente ou combinados. A metade inibitória máxima concentração (IC 50) ( 6,6 g L - 1; 4,4 g L - 1) e 30% no máximo concentração inibitória (IC 30) ( 4,4 g L - 1; 2,9 g L - 1) de acetato e propionato [concentrações previamente determinadas em nosso Análise do Ciclo Celular Após 48 h de tratamento, as células foram colhidas por raspagem e o meio foi coletado e centrifugado a 500 g por 3min. O sedimento foi ressuspenso em 500 µ L PBS 1x e incubado em gelo por 15 min. Após este período, 1,5ml de etanol frio a 96% (v / v) (armazenado em - 20 ◦ C) foi adicionado ao pellet e incubado em gelo por 15min, para permitir a fi xação celular. As células foram então lavadas com 4ml de PBS 1x, centrifugadas a 500 g por 3 min a 4 ◦ C e o sedimento novamente lavado com PBS 1x. O pelete final foi ressuspenso em 500 µ L PBS 1x e foi incubado com 50 µ L de solução RNase A [200 µ g mL - 1 em citrato de sódio 1% (w / v)] a 37 ◦ C por 15 min. Após a incubação, 50 µ Solução de coloração com iodeto de propídio (PI) [0,5 mg mL - 1 em citrato de sódio 1% (p / v)] e as células foram misturadas em um vórtice e foram incubadas em temperatura ambiente por 30 min no escuro. Células com fl uorescência vermelha [canal FL-3 (488/620 nm)] foram analisadas Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 3 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii no citômetro de fl uxo Epics XL (Beckman Coulter, EUA) com uma média de 20.000 contagens por amostra. Os dados foram analisados com o programa de software Flowing (Perttu Terho, Finlândia) para gerar histogramas de frequência de conteúdo de DNA e quantificar a quantidade de células no ciclo celular individual, incluindo a população sub-G1 considerada como células mortas. desempenho de adaptado P. freudenreichii foi avaliada e os resultados obtidos são apresentados em Tabela 1. Adaptado P. freudenreichii apresentaram aumento na concentração de biomassa e na taxa de crescimento, em meios DMEM e MCHC, quando comparados ao desempenho dos não adaptados P. freudenreichii. No entanto, a produção de SCFA, particularmente a produção de propionato, foi afetada negativamente pelo desafio do estresse digestivo. Diferenças estatísticas significativas podem ser observadas entre o meio YEL e BM ( p < 0,001) ao comparar os resultados obtidos para as bactérias normais e adaptadas (bactérias desafiadas pelo estresse digestivo). Este efeito também foi observado para a produção de acetato. Curiosamente, o adaptado P. freudenreichii os rendimentos de acetato em meio MCHC foram positivamente afetados pelo desafio do estresse digestivo mostrando um ligeiro aumento ( Tabela 1). Análise Estatística Os resultados correspondem à média ± erro padrão da média (SEM) de pelo menos três experiências independentes. Os dados foram analisados por meio de uma análise de variância (ANOVA one-way) seguida do Teste de Tukey para comparar todos os experimentos ou do teste de Dunnett para avaliar as diferenças entre o controle e as diferentes condições testadas. O intervalo de confiança usado foi de 95% e p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente signi fi cativos. Todos os testes estatísticos foram realizados usando o software Graphpad Prism 5. Efeito do meio extracelular de câncer colorretal no desempenho de propionibactérias RESULTADOS Produção de ácidos graxos de cadeia curta por O efeito da co-cultura de células CRC com bactérias probióticas na produção de SCFA em animais normais e adaptados P. freudenreichii foi estudado através de simulação usando meio onde as células CRC foram cultivadas (meio condicionado). O meio condicionado diluído e não diluído contendo 2,7 e 1 g L - 1 de glicose, respectivamente, foram usados para simular o efeito das células CRC no crescimento de células normais (não adaptadas) P. freudenreichii e na produção de SCFAs. Meio condicionado diluído e não diluído contendo 3,2 e 1,8 g L - 1 de glicose, respectivamente, foram usados com o mesmo propósito para as bactérias adaptadas. Como controles, foi utilizado meio DMEM fresco com as mesmas concentrações de glicose presente no meio condicionado. Os resultados apresentados em Figura 2 mostraram que o crescimento da bactéria foi negativamente afetado pelo meio condicionado das células CRC (simulando seu contato indireto). Um crescimento lento com uma longa fase estacionária foi observado, embora a concentração de biomassa final fosse semelhante ao controle. Adaptado e não adaptado P. freudenreichii o crescimento em meio condicionado exibiu comportamentos semelhantes. Os parâmetros de crescimento e produção de SCFA são resumidos em Mesa 2. Pudemos observar diferenças estatisticamente significativas para bactérias cultivadas em meio condicionado em comparação com os controles. Os parâmetros de rendimento e produtividade de acetato e propionato também mostram aumento estatisticamente significativo entre o meio condicionado e os respectivos controles. No geral, o meio condicionado levou a um melhor desempenho das bactérias em relação à produção de SCFA. O aumento da produção de SCFA em meio condicionado pode ser devido à presença de alguns metabólitos produzidos pelas células CRC que são assimilados positivamente pelas bactérias. A fim de identificar tais compostos, presentes em meio condicionado que poderia explicar a produção melhorada de SCFA, omeio condicionado de células CRC diluído e não diluído com meio DMEM fresco foi analisado por HPLC. A HPLC analisada mostrou que o lactato foi detectado no meio condicionado, mas não nos controles, o que está de acordo com a produção de lactato pelas células CRC metabolismwitch, também conhecido como "efeito de warbourg", onde as células cancerosas "fermentam" glicose em lactato. Não diluído e diluído P. freudenreichii Propionibacterium freudenreichii foi cultivado e caracterizado quanto à produção de biomassa e SCFA em diferentes meios de cultura. Os resultados obtidos são ilustrados em Figura 1. Produção de biomassa alcançada ∼ 0,86 ± 0,02; 0,53 ± 0,01; 0,25 ± 0,01 e 1,55 ± 0,01 g L - 1 em mídia YEL, BM, MCHC e DMEM, respectivamente. A produção de acetato foi encontrada em cerca de 1,65 ± 0,01; 1,81 ± 0,01; 0,58 ± 0,02 e 0,79 ± 0,02 g L - 1 em YEL, BM, MCHC e DMEMmedia, respectivamente; enquanto a produção de propionato foi em torno de 4,69 ± 0,01; 4,81 ± 0,02; 1,37 ± 0,03 e 2,60 ± 0,05 g L - 1 em mídia YEL, BM, MCHC e DMEM, respectivamente. Esses resultados mostraram que maiores quantidades de produção de biomassa não foram correlacionadas com maiores quantidades de produção de SCFA. Por exemplo, no DMEM, as bactérias exibiram maiores quantidades de produção de biomassa; entretanto, menores quantidades de SCFA foram produzidas. No MCHC, a bactéria apresentou menores quantidades de produção de biomassa e SCFA. A maior produção de SCFA foi obtida com BM, seguido do meio YEL. As taxas de crescimento, rendimentos e produtividades foram determinados para todos os meios de cultura testados e estão resumidos em Tabela 1. As bactérias cultivadas em DMEM exibiram a maior produção de biomassa quando comparadas aos outros meios de cultura avaliados, mas apresentaram menor produtividade de acetato e propionato. Embora as menores quantidades de produção de acetato e propionato por P. freudenreichii foram obtidos em meio MCHC, os rendimentos de acetato e propionato são altos em comparação com outros meios. P. freudenreichii Adaptação ao estresse digestivo simulado A eficiência probiótica de P. freudenreichii depende de sua capacidade de sobreviver aos estresses do trato digestivo e de permanecer metabolicamente ativo no intestino. A fim de obter bactérias tolerantes a este tipo de estresse, foi realizado um desafio de estresse digestivo. P. freudenreichii foi exposto a pH ácido por 1,5 he concentrações de sais biliares por 2 h, mimetizando o processo de digestão. o Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 4 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii FIGURA 1 | Perfis de produção de biomassa, acetato e propionato por Propionibacterium freudenreichii na mídia YEL, BM, MCHC e DMEM, em 37 ◦ C. Cada condição foi executada em triplicado e os resultados correspondem à média ± erro padrão da média. meio condicionado usado para cultura normal P. freudenreichii era composto por 2,4 e 0,9 g L - 1 de lactato, respectivamente, enquanto 1,6 e 0,8 g L - 1 de lactato foi quantificado em meio condicionado não diluído e diluído usado para cultura adaptada P. freudenreichii. A presença de lactato em meio condicionado de células CRC diluído e não diluído com DMEM fresco pode explicar a melhora do desempenho de biotransformação por bactérias probióticas, visto que o lactato é a fonte de carbono preferida para essas bactérias. e 17%, respectivamente. Uma concentração de acetato de 0,79 gl - 1 levou a uma diminuição da proliferação celular de 7% sem diferença estatística quando comparado ao controle negativo. Uma concentração de propionato semelhante à detectada no caldo fermentado DMEM por P. freudenreichii ( 2,6 g L - 1) levou a uma diminuição de 12% na proliferação celular quando comparado ao controle negativo. A combinação de acetato e propionato exibiu uma maior Efeito na proliferação celular. O IC 50 de acetato e propionato juntos inibiram a proliferação celular quase completamente. O IC 30 de acetato e propionato juntos reduziram a proliferação celular por ∼ 80%, sendo superior ao efeito do IC30 dos ácidos isoladamente. Proliferação de células CRC incubadas com 0,79 g L - 1 de acetato puro e 2,6 g L - 1 de propionato puro (ou seja, as concentrações de SCFA presentes no caldo fermentado DMEM por P. freudenreichii) foi reduzido por ∼ 21% sendo significativamente diferente do controle negativo. A fim de avaliar o efeito do SCFA produzido por adaptado e normal P. freudenreichii nas células CRC, a influência do caldo fermentado também foi analisada. Entre os quatro caldos fermentados usados, BM e DMEM foram selecionados por não apresentarem efeito tóxico para as células CRC ( dados não mostrados). BM diluído em meio DMEM fresco e meio condicionado de células CRC diluídas em meio DMEM fresco foram usados como controle negativo de caldos fermentados de BM e DMEM, respectivamente. Efeito dos ácidos graxos de cadeia curta produzidos por propionibactérias na proliferação de células cancerosas colorretais Para avaliar o efeito do acetato e propionato produzido por bactérias na proliferação de células CRC pelo ensaio SRB, as células foram tratadas com concentrações semelhantes às obtidas no meio de bactérias. O IC 50 e IC 30 valores de acetato (4,4; 6,6 g L - 1) e propionato (2,9; 4,4 g L - 1) sozinhos antes determinado em nosso laboratório ( 22 ) Como comparação, as células foram incubadas com acetato e / e propionato (entre pH 7,1-7,4) no IC 50 e IC 30 concentrações por 48 h ( Figura 3). O IC 50 concentração de acetato e propionato reduzida proliferação celular por ∼ 53 e 46%, respectivamente. IC 30 de acetato e propionato levou a uma redução na proliferação celular de 19 Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 5 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii TABELA 1 | Cinética das fermentações conduzidas com bactérias não adaptadas e adaptadas (bactérias desafiadas ao estresse digestivo) Propionibacterium freudenreichii. Não adaptado P. freudenreichii Adaptado P. freudenreichii YEL BM MCHC DMEM YEL BM MCHC DMEM Biomassa (g L - 1) Taxa de crescimento (h - 1) 0,86 ± 0,02 0,08 ± 0,00 0,53 ± 0,01 0,07 ± 0,00 0,25 ± 0,01 0,04 ± 0,00 1,55 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,80 ± 0,02 0,11 ± 0,00 *** 0,53 ± 0,03 0,06 ± 0,01 0,39 ± 0,01 *** 0,05 ± 0,00 1,67 ± 0,01 *** 0,08 ± 0,00 Concentração (g L - 1) Rendimento (gg - 1) Produtividade (g L - 1 h - 1) 1,65 ± 0,01 0,18 ± 0,00 0,03 ± 0,00 1,81 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,04 ± 0,00 0,58 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,79 ± 0,02 0,18 ± 0,00 0,01 ± 0,00 1,53 ± 0,07 0,18 ± 0,01 0,03 ± 0,00 1,11 ± 0,03 *** 0,13 ± 0,00 ** 0,02 ± 0,00 *** 0,61 ± 0,02 0,23 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,73 ± 0,01 0,18 ± 0,00 0,01 ± 0,00 Concentração (g L - 1) Rendimento (gg - 1) Produtividade (g L - 1 h - 1) 4,69 ± 0,01 0,53 ± 0,00 0,09 ± 0,00 4,81 ± 0,02 0,55 ± 0,01 0,10 ± 0,00 1,37 ± 0,03 0,57 ± 0,01 0,03 ± 0,00 2,60 ± 0,05 0,57 ± 0,00 0,03 ± 0,00 3,13 ± 0,10 *** 0,37 ± 0,01 *** 0,07 ± 0,00 *** 2,91 ± 0,13 *** 0,35 ± 0,02 *** 0,06 ± 0,00 *** 1,35 ± 0,05 0,57 ± 0,02 0,03 ± 0,00 2,72 ± 0,05 0,66 ± 0,02 0,04 ± 0,00 Diferentes meios foram usados para cultivar as bactérias adaptadas e não adaptadas por 72 h a 37 ◦ C sem agitação. Na-Lactato foi a fonte de carbono em todos os meios a uma concentração inicial de 8,4g L - 1 ( YEL e BM) e 2,3g L - 1 ( MCHC), exceto para o meio DMEM em que a glicose foi usada em vez de uma concentração inicial de 4,1g L - 1 Cada condição foi executada em triplicado e os resultados correspondemà média ± erro padrão da média. YEL, meio de extrato de levedura-lactato; BM, meio basal; MCHC, Mimicking the Content of the Human Colon medium; DMEM, Dulbecco's Modi fied Eagle's Medium; ** p <0,01; *** p <0,001, valores significativamente diferentes entre o mesmo meio. Os caldos fermentados foram desproteinizados (121 ◦ C; 15min; 1 bar) para eliminar qualquer possível efeito citotóxico de proteínas contaminantes. Os caldos fermentados diluídos continham 0,9 g L - 1 de acetato e 2,4 g L - 1 de propionato para P. freudenreichii e caldo fermentado de adaptado P. freudenreichii, contendo 0,6 g L - 1 de acetato e 1,5 g L - 1 de propionato foram usados para tratar células de câncer colorretal. As células também foram tratadas com SCFA puro nas concentrações descritas anteriormente (controle de SCFA). Os resultados do caldo fermentado BM e DMEM por bactérias adaptadas e normais e os respectivos controles são representados em Figura 4. A inibição da proliferação das células CRC foi observada apenas com uma significância estatística ( p < 0,01) em caldo fermentado BM do normal P. freudenreichii. Todas as condições do caldo fermentado DMEM ( Figura 4B) mostrou uma inibição da proliferação celular em torno de 10–20%. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre o caldo fermentado BM, o caldo fermentado BM desproteinizado e o controle com SCFA puro, indicando que o efeito dos caldos fermentados na proliferação de células CRC é devido à citotoxicidade de SCFA bacteriano. A distribuição do ciclo celular de CRC tratado com caldos fermentados (BM e DMEM) e os respectivos controles também foi estudada por medição de citometria de fluxo do conteúdo de DNA de células coradas com PI ( Figura 5). SCFA produzido por normal e adaptado P. freudenreichii causou um acúmulo de células CRC na fase sub-G1 e uma diminuição nas fases S e G2 / M, sendo significativamente diferente em relação ao controle negativo. Além disso, um maior acúmulo de células CRC na fase sub-G1 (50-70%) foi observado quando as células foram tratadas com caldo fermentado BM do que quando as células foram tratadas com caldo fermentado DMEM (20-35%). As células tratadas com caldo fermentado DMEM também parecem ser interrompidas na fase G2 / M do ciclo celular (10-30%). de epitélio colônico normal a pólipos adenomatosos e, em última instância, câncer invasivo ( 1 ) Fatores ambientais, nomeadamente dieta e estilo de vida, foram relatados em estudos epidemiológicos como responsáveis pelo aumento da incidência de CCR ( 2 - 4 , 6 ) SCFA, particularmente propionato e acetato, são conhecidos por terem efeitos pró-apoptóticos ( 31 , 32 ) Estes SCFA são o produto final da fermentação por bactérias probióticas fisiológicas, como P. freudenreichii, que estão presentes em vários produtos lácteos frequentemente consumidos ( 10 , 33 ) Uma dieta e fi ciente para aumentar o conteúdo colônico de SCFA pode ajudar a prevenir ou tratar o CCR, como dieta preventiva ou como complemento à terapia do câncer, respectivamente. Em um relatório anterior, nosso grupo mostrou que o acetato per se inibe a proliferação e induz a apoptose, levando à permeabilização da membrana lisossomal com a liberação de Catepsina D do lisossoma em células CRC ( 22 ) Da mesma forma, mostramos que as células CRC são protegidas pela Catepsina D da apoptose induzida por acetato através da degradação independente da autofagia de mitocôndrias danificadas ( 23 ) Essas observações sugerem que o propionato e o acetato, metabólitos da propionibactéria, podem torná-lo um nutracêutico potencial contra o CRC, atuando como um probiótico, e apontando para um papel útil do SCFA como agentes poderosos para a prevenção ou terapia do CRC. Embora a propionibactéria possa ser vista como um agente probiótico, a adaptação ao ambiente do lúmen do cólon é crítica para con fi rmar seu potencial. É importante que as propionibactérias sobrevivam e ainda produzam os metabólitos benéficos sob condições de estresse, como mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo variações de pH, peristaltismo, peptídeos antimicrobianos e ácidos biliares ( 34 ) A competição com a microbiota residente pela aquisição de nutrientes e por nichos de crescimento também deve ser levada em consideração ( 35 ) No entanto, a influência desse estresse digestivo na produção de acetato e propionato nunca foi investigada. Neste trabalho objetivamos estudar a capacidade da propionibacterium de se adaptar às condições de estresse digestivo e avaliar sua capacidade anticancerígena. DISCUSSÃO O câncer colorretal é uma das principais causas de mortalidade na Europa ( 30 ), e sua ocorrência é comumente atribuída à transformação Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 6 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. P r o p i o n a t o A c e t a t o https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii FIGURA 2 | Perfis de produção de biomassa, acetato e propionato por não adaptados ( A) e adaptado ( B) Propionibacterium freudenreichii em pH 7,0 e 37 ◦ C em meio condicionado de células de câncer colorretal não diluídas e diluídas [com DMEM (1: 1)] fresco e os respectivos controles. Meio condicionado consiste no sobrenadantes coletados após o crescimento de células de câncer colorretal em meio DMEM sem antibiótico por 72 h a 37 ◦ C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Cada condição foi executada em duplicata e os resultados são representados pela média ± erro padrão da média. Propionibacterium freudenreichii tem um grande potencial quanto à produção de acetato e propionato como produtos finais, embora com desempenhos diferentes quando cultivado em meios diferentes. Os resultados da produção de SCFA por bactérias normais mostraram claramente que o meio BM proporcionou as melhores produções de acetato e propionato, embora tenha apresentado rendimento e produtividade em propionato semelhantes ao meio YEL. Além disso, também observamos que o meio MCHC não era apropriado para o crescimento de bactérias, sendo desfavorável para a produção de SCFA. Essas condições mimetizam o cenário real do trato gastrointestinal (TGI) e, portanto, indicam que o estresse digestivo afeta a capacidade probiótica das propionibactérias, embora o rendimento de produção apresentado para o acetato seja alto em comparação a outros meios. Assim, novos desenvolvimentos e Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 7 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii TABELA 2 | Cinética das fermentações realizadas com adaptados e não adaptados Propionibacterium freudenreichii. Não adaptado P. freudenreichii Adaptado P. freudenreichii CCM ½ CM ½ CCM CM CCM ½ CM ½ CCM CM Biomassa (g L - 1) Taxa de crescimento (h - 1) 1,34 ± 0,01 1,35 ± 0,04ns 0,10 ± 0,01 0,07 ± 0,00 * 0,66 ± 0,02 0,84 ± 0,03 * 0,10 ± 0,00 0,04 ± 0,00 *** 0,11 ± 0,00 1,53 ± 0,00 1,65 ± 0,02ns 0,10 ± 0,01ns 1,14 ± 0,05 0,13 ± 0,00 1,20 ± 0,02ns 0,04 ± 0,00 *** Concentração (g L - 1) Rendimento (gg - 1) Produtividade (g L - 1 h - 1) 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,00ns 0,009 ± 0,000 0,02 ± 0,00 *** 0,01 ± 0,00 0,66 ± 0,01 1,11 ± 0,06 ** 0,24 ± 0,01 0,40 ± 0,02 *** 0,56 ± 0,01 1,26 ± 0,01 *** 0,23 ± 0,00 0,53 ± 0,02 1,32 ± 0,02 *** 0,74 ± 0,00 1.07 ± 0,00 *** 0,62 ± 0,00 0,33 ± 0,00 ** 0,36 ± 0,02 0,02 ± 0,00ns 0,011 ± 0,001 1,19 ± 0,02 *** 0,66 ± 0,01 *** 0,02 ± 0,00 *** Concentração (g L - 1) Rendimento (gg - 1) Produtividade (g L - 1 h - 1) 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 ** 0,020 ± 0,001 0,04 ± 0,00 *** 0,04 ± 0,00 2,21 ± 0,02 2,62 ± 0,06 ** 0,78 ± 0,03 0,95 ± 0,02 *** 1,24 ± 0,05 2,48± 0,00 *** 2,66 ± 0,02 1,3 ± 0,0 2,36 ± 0,06 *** 0,82 ± 0,01 2,92 ± 0,07ns 0,90 ± 0,02 ** 0,05 ± 0,00 ns 1,84 ± 0,05 1,00 ± 0,01 0,03 ± 0,00 2,53 ± 0,03 ** 1,40 ± 0,01 *** 0,04 ± 0,00 ** O meio condicionado de células de câncer colorretal foi usado para cultivar as bactérias não adaptadas e adaptadas. Consiste nos sobrenadantes coletados após o crescimento das células do câncer colorretal em um meio DMEM sem antibiótico por 72 h a 37 ◦ C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2 A glicose foi a fonte de carbono presente neste meio. Cada condição foi executada em duplicata e os resultados correspondem à média ± erro padrão da média. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, valores significativamente diferentes entre as condições do meio condicionado e respectivos controles; “Ns” corresponde a diferenças não signi fi cativas. CM ½, meio condicionado de células de câncer colorretal diluído (1: 1) em DMEM fresco; CCM ½, controle de meio condicionado diluído de células de câncer colorretal; CM, meio condicionado de células de câncer colorretal; CCM, meio condicionado de controle de células de câncer colorretal. subsp. freudenreichii, denominado TL3, produziu 1,32 g L - 1 de propionato, que é semelhante à concentração de propionato obtida neste estudo (1,4 g L - 1). Jan et al. ( 17 ) utilizando as mesmas condições que as aqui utilizadas na fermentação do DMEMmedium mostrado, com a cepa ITG18 ( P. freudenreichii subsp. freudenreichii), que a propionibactéria produziu 2,7 g L - 1 de propionato e 0,75 g L - 1 de acetato. Portanto, os resultados apresentados estão de acordo com a literatura. Neste trabalho, adaptamos com sucesso P. freudenreichii subsp. Freudenreichii DSM 20271 ao estresse digestivo através da cultura de células em um meio de estresse digestivo simulado. Vários autores realizaram desafios de estresse digestivo para testar a adaptação e tolerância de propionibactérias ( 11 , 12 , 17 , 33 ) Por serem probióticos, essas bactérias devem ser capazes de sobreviver ao estresse ácido imposto no estômago para chegar ao intestino, onde exercem seu papel benéfico. Em todos os estudos relatados, os autores conseguiram obter uma propionibactéria adaptada ao estresse digestivo, que foi capaz de sobreviver ao desafio de forma semelhante aos nossos achados. Além disso, esses estudos mostraram que a tolerância ao estresse digestivo é altamente variável, dependendo da cepa. A cepa usada neste trabalho é descrita como aquela que apresenta a melhor taxa de sobrevivência durante desafios de estresse digestivo ( 12 ) A adaptação do P. freudenreichii induziu um impacto negativo na produção de propionato em meios YEL e BM. No entanto, o desempenho de adaptado P. freudenreichii não foi afetado nos meios MCHC e DMEM para os quais foi observado um pequeno aumento na produção de biomassa quando comparado com os resultados obtidos para P. freudenreichii. Os ácidos graxos de cadeia curta têm sido amplamente descritos na literatura por sua variedade de efeitos biológicos e vários relatos demonstram os mecanismos de ação dessas moléculas ( 19 , 21 , 22 ) Ambos SCFA e sobrenadantes de cultura de propionibactérias das espécies leiteiras P. freudenreichii e P. acidipropionici apoptose induzida em células CRC em vitro ( 17 , 27 , 28 , 36 ) Por exemplo, Lan et al. ( 27 ) mostrou que 0,9 g L - 1 de acetato e 2,2 g L - 1 de células de câncer de cólon HT 29 induzidas por propionato FIGURA 3 | Proliferação de células cancerosas colorretais tratadas com acetato e propionato puros, isoladamente ou combinados. As células foram incubadas por 48 h com IC50, IC30 e as concentrações de acetato e propionato semelhantes às que foram determinadas no Propionibacterium freudenreichii caldo fermentado. Meio DMEM fresco e peróxido de hidrogênio (1mM) foram usados como controle negativo e positivo, respectivamente. Os valores representam a média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. *** p < 0,001, em comparação com células de controle negativo. ## p < 0,01, ### p < 0,001, comparando entre as condições. otimizações de P. freudenreichii para o uso pretendido deve ser explorado. Lan et al. ( 12 ) cultivou várias cepas de propionibacteria em meio MCHC em 37 ◦ C e avaliou a produção de propionato. Os autores descobriram que um conjunto de cepas produziu propionato em concentrações em torno de 1,32 g L - 1, enquanto outras cepas produziram quantidades menores, sugerindo assim que a taxa de produção de propionato é dependente da cepa. P. freudenreichii Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 8 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. P r o p i o n a t o A c e t a t o https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii FIGURA 4 | Proliferação de células de câncer colorretal tratadas com BM ( A) e DMEM ( B) caldo fermentado por adaptado e normal Propionibacterium freudenreichii. Os caldos fermentados foram desproteinizados para eliminar qualquer possível efeito citotóxico das proteínas contaminantes. SCFA puro em concentrações presentes no caldo fermentado de bactérias não adaptadas (0,9g L - 1 acetato; 2,4g L - 1 propionato) ou bactérias adaptadas (0,6g L - 1 acetato; 1,5g L - 1 propionato) foram usados como um controle SCFA. As células foram incubadas por 48 h com os caldos fermentados BM e DMEM e seus respectivos controles. BM diluído em meio DMEM fresco e meio condicionado de células CRC diluídas em meio DMEM fresco foram usados como controle negativo de caldos fermentados BM e DMEM, respectivamente, e peróxido de hidrogênio (1mM) como controle positivo. Os valores representam a média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 em comparação com as células de controle negativo. morte em 50% 48 h após a incubação. Jan et al. ( 17 ) relataram que o meio fermentado DMEM por P. freudenreichii subsp. Freudenreichii cepa ITG18, contendo 0,75 g L - 1 de acetato e 2,7 g L - 1 de propionato em pH 5,6, foi capaz de induzir a morte celular em células HT29 de câncer de cólon, e comprovou que a citotoxicidade era devida à concentração de SCFA presente no sobrenadante. Nossos resultados usando 0,79 g L - 1 de acetato e 2,6 g L - 1 de propionato mostrou uma diminuição da proliferação celular por ∼ 21% em células RKO e uma indução de parada do ciclo celular na fase G2 / M, não induzindo efeito significativo na morte celular. Isso pode refletir a sensibilidade diferente a SCFA das linhas de células usadas, visto que essas células têm origens genéticas diferentes. Para estudar o efeito antineoplásico potencial de meios de cultura fermentados de propionibactérias em células CRC, as células foram tratadas com caldo fermentado DMEM e BM por meio de caldo normal e adaptado P. freudenreichii por 48 h, conforme descrito anteriormente. Em relação à distribuição do ciclo celular avaliada nos tratamentos com SCFA e SCFA produzidos por P. freudenreichii, nossos resultados mostraram uma parada do ciclo celular e inibição da proliferação para todas as condições avaliadas (caldo fermentado BM e DMEM e os respectivos controles) de forma semelhante ao que foi relatado em nosso próprio, bem como em outros estudos ( 22 , 27 ) No entanto, é importante destacar que aqui relatamos pela primeira vez o efeito citotóxico do caldo fermentado de um meio de propionibactéria (BM) sobre as células CRC. As células cancerosas são conhecidas por suas capacidades biológicas adquiridas durante o desenvolvimento em várias etapas de tumores humanos, o que as faz agir de forma diferente das células normais ( 37 ) Uma dessas características é a capacidade de contornar o sistema imunológico aproveitando a interação com as células do estroma ( 37 ) Além disso, o desenvolvimento de câncercolorretal está relacionado a alterações na população da microbiota intestinal [revisado em ( 38 )]. Portanto, avaliamos o efeito do meio condicionado por células CRC sobre o desempenho de propionibactérias, adaptadas e não adaptadas ao estresse digestivo. Os resultados indicaram que propionibactérias cultivadas em meio condicionado proporcionam maior produção de SCFA quando comparada ao respectivo controle, sendo esta melhora mais pronunciada na produção de acetato. P. freudenreichii pode ser capaz de crescer em co-cultura com linhas de células CRC, uma vez que foi observado um crescimento mais lento com um aumento na produção de SCFA. Além disso, nossos resultados demonstraram que esse desempenho de biotransformação induziu a morte celular do CRC. A melhora na produção de SCFAs em meio condicionado pode ser devida aos metabólitos excretados por linhagens celulares RKO, ou seja, o lactato. O lactato é uma fonte de carbono ideal para P. freudenrechii fermentação, levando a altos rendimentos de propionato e acetato ( 39 ) P. freudenrechii tem um metabolismo complexo que envolve várias vias metabólicas. O consumo de lactato produz piruvato, que pode ser reduzido para produzir propionato via os ciclos de transcarboxilase, ou oxidados para produzir acetato e CO 2 ( 40 ) O CRC é conhecido por depender da glicólise para a produção de energia e essa atividade leva à produção de importantes quantidades de lactato, que são exportados para o meio extracelular, contribuindo assim para o microambiente ácido ( 41 , 42 ) Este fenômeno, conhecido como "glicólise aeróbica" ou "efeito Warburg" ( 43 ) e leva a um acúmulo de lactato ( 44 ) O aumento da produção de lactato pelas células CRC ( 42 ) pode resultar, como observamos neste trabalho, no aumento da produção de SCFA pelo Propionibacterium. Nossos resultados sugerem que P. freudenreichii promove um efeito citotóxico nas células CRC, através de seus metabólitos, e que as células CRC aumentam a produção de acetato e propionato por P. freudenreichii, o que, por sua vez, levará a um aumento do efeito citotóxico nas células CRC. Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 9 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii FIGURA 5 | Efeito do BM ( A) e DMEM ( B) caldo fermentado na distribuição do ciclo celular. Análise da distribuição das fases do ciclo celular: G0 / G1; S; G2 / M e SUB-G1 em células CRC tratadas com caldo fermentado de adaptado e não adaptado P. freudenreichii e os respectivos controles. Os caldos fermentados foram desproteinizados para eliminar qualquer possível efeito citotóxico das proteínas contaminantes. BM diluído em meio DMEM fresco e meio condicionado de células CRC diluídas em meio DMEM fresco foram usados como controle negativo de caldos fermentados BM e DMEM, respectivamente. Peróxido de hidrogênio (1 mM) foi usado como controle positivo. SCFA puro em concentrações presentes no caldo fermentado de bactérias não adaptadas (0,9g L - 1 acetato; 2,4 g L - 1 propionato) ou bactérias adaptadas (0,6g L - 1 acetato; 1,5g L - 1 propionato) foram usados como um controle SCFA. Os valores representam a média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. * p < 0,05; ** p < 0,01; * * * p < 0,001, em comparação com o controle negativo. Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 10 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Casanova et al. Lactato aumenta o desempenho de Propionibacterium freudenreichii CONCLUSÕES manuscrito e aprovou sua versão final. Ambos os autores seniores desenharam o estudo, planejaram o trabalho experimental e contribuíram igualmente para este artigo. Propionibacterium freudenreichii foi capaz de produzir grandes quantidades de acetato e propionato em meio BM e YEL. Adaptação de P. freudenreichii ao estresse digestivo foi obtido com sucesso e seu comportamento foi semelhante ao das bactérias normais. Curiosamente, observamos uma grande melhora no desempenho das bactérias utilizando os meios MCHC e DMEM que são semelhantes ao cenário real do GIT. O efeito do meio condicionado de células CRC rico em lactato sobre o desempenho bacteriano mostrou que as bactérias foram capazes de crescer permanecendo metabolicamente ativas e produziram mais AGCC na presença de lactato. Além disso, a exposição de células CRC a SCFA produzidos por Propionibacteria inibiu sua proliferação e induziu a parada do ciclo celular. Nossos resultados sugerem o uso de P. freudenreichii como probiótico na prevenção e / ou como adjuvante terapêutico no CRC. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro do FEDER através do POFC — COMPETE e da FCT através do projeto PEst-OE / BIA / UI4050 / 2014. Este trabalho foi apoiado pela FCT IP através do financiamento estratégico da unidade UID / BIO / 04469/2013 e ref. RECI / BBB-EBI / 0179/2012 (número do projeto FCOMP-01-0124- FEDER-027462). Este trabalho foi também apoiado pelo programa estratégico UID / BIA / 04050/2013 (POCI-01-0145-FEDER-007569) financiado por fundos nacionais através da FCT IP e pelo FEDER através do COMPETE2020 — Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI). Este artigo resulta do projeto EcoAgriFood NORTE-01-0145-FEDER-00009, apoiado pelo Programa Operacional Regional do Norte de Portugal (NORTE 2020), no âmbito do Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR O trabalho experimental foi desenvolvido por MC. Todos os autores contribuíram para o planejamento, discussão e redação do REFERÊNCIAS análises fisiológicas e proteômicas. Appl Environ Microbiol. ( 2003) 69: 3809–18. doi: 10.1128 / AEM.69.7.3809-3818.2003 Lan A, Bruneau A, Philippe C, Rochet V, Rouault A, Herve C, et al. Sobrevivência e atividade metabólica de cepas selecionadas de Propionibacterium freudenreichii no trato gastrointestinal de ratos associados à microbiota humana. Br J Nutr. (2007) 97: 714–24. doi: 10.1017 / S0007114507433001 Borowicki A, Michelmann A, Stein K, Scharlau D, Scheu K, Obst U, et al. A aleurona de trigo fermentada enriquecida com cepas probióticas LGG e Bb12 modula marcadores de progressão tumoral em células do cólon humano. Nutr Cancer (2011) 63: 151–60. doi: 10.1080 / 01635581.2010.516874 Dalmasso M, Nicolas P, Falentin H, Valence F, Tanskanen J, Jatila H, et al. Tipagem de sequência multilocus de Propionibacterium freudenreichii. Int J Food Microbiol. 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Copyright © 2018 Casanova, Azevedo-Silva, Rodrigues e Preto. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). É permitida a utilização, distribuição ou reprodução em outros fóruns, desde que o (s) autor (es) original (is) e o detentor dos direitos autorais sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitida a utilização, distribuição ou reprodução em desacordo com estes termos. Fronteiras em Nutrição | www.frontiersin.org 12 Maio de 2018 | Volume 5 | Artigo 44. https://doi.org/10.1038/cddis.2013.29 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.157 https://doi.org/10.1016/j.cmet.2011.02.018 https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.05.011 https://doi.org/10.1002/btpr.1512 https://doi.org/10.1007/s10495-006-0010-3 https://doi.org/10.1017/S0007114508978284 https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb06813.x https://doi.org/10.1016/j.ejca.2012.12.027 https://doi.org/10.1093/jn/132.12.3804S https://doi.org/10.3748/wjg.v21.i9.2759 https://doi.org/10.1016/j.fm.2012.05.003 https://doi.org/10.1007/s00203-003-0646-0 https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-911 https://doi.org/10.1097/00008469-199510000-00005 https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013 https://doi.org/10.1186/s41021-016-0038-8 https://doi.org/10.1128/AEM.66.5.2012-2020.2000 https://doi.org/10.1007/s10863-012-9428-1 https://doi.org/10.1016/j.canlet.2015.05.015 https://doi.org/10.1126/science.123.3191.309 https://doi.org/10.1172/JCI69741 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ https://www.frontiersin.org/journals/nutrition https://www.frontiersin.org https://www.frontiersin.org/journals/nutrition#articles Colorectal Cancer Cells Increase the Production of Short Chain Fatty Acids by Propionibacterium freudenreichii Impacting on Cancer Cells Survival Introduction Materials and Methods Bacterial Strains and Growth Conditions Analysis of Small Chain Fatty Acids, Glucose, and Biomass CRC Cells Culture Conditions CRC Cells Proliferation Assay Cell Cycle Analysis Statistical Analysis Results Production of Short Chain Fatty Acids by P. freudenreichii P. freudenreichii Adaptation to Simulated Digestive Stress Effect of Colorectal Cancer Extracellular Medium on Propionibacteria Performance Effect of Short Chain Fatty Acids Produced by Propionibacteria on Colorectal Cancer Cells Proliferation Discussion Conclusions Author Contributions Acknowledgments References
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