Perguntas e respostas de evolução

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A MOLECULAR APPROACH TO THE STUDY OF GENIC
HETEROZYGOSITY IN NATURAL POPULATIONS.
I. THE NUMBER OF ALLELES AT DIFFERENT
LOCI IN DROSOPHILA PSEUDOOBSCURA’
J. L. HUBBY AND R. C. LEWONTIN
Department of Zoology, University of Chicago, Chicago, Illinois
 
A pedra angular da teoria da evolução por mudança gradual é que a taxa de a evolução é absolutamente limitada pela quantidade de variação genética na população em evolução. O "Teorema Fundamental da Seleção Natural" de FISHER (1930) é uma afirmação matemática desta generalização, mas mesmo sem matemática é claro que a mudança genética causada pela seleção natural pressupõe diferenças genéticas já existentes, nas quais a seleção natural pode operar. Em certo sentido, uma descrição da variação genética em uma população é o dado fundamental dos estudos evolutivos; e é necessário explicar a origem e manutenção dessa variação e prever suas consequências evolutivas. Não é surpreendente, então, que um grande esforço da genética nos últimos 50 anos foi caracterizar as quantidades e tipos de variação genética existentes em populações naturais ou de laboratório de vários organismos. Os resultados até agora nos disseram muito sobre a variação citológica, como polimorfismos para inversões e translocações, sobre frequências de mutações visíveis raras em muitos loci e sobre frequências de cromossomos que são deletérios quando homozigotos, juntamente com o grau desse efeito deletério. Além disso, sabemos de alguns polimorfismos notáveis em um único foco. Esses resultados são familiares a todos os estudiosos de genética e evolução populacional e foram bem revisados por DOBZHANSKY (195 1) e, mais recentemente, por MAYR (1 963). No entanto, apesar de toda a riqueza de observação e experimento, as técnicas de genética populacional não nos permitiram fazer diretamente a pergunta mais elementar sobre a estrutura genética de uma população: em qual proporção de seus loci podemos esperar que um indivíduo diplóide seja heterozigoto ? Colocado de outra forma, esta é a questão de quanta variação genética existe em qualquer população. Que esta questão permanece sem resposta é melhor demonstrado por uma declaração de MAYR (1963) no final de mais de 100 páginas de revisão de nosso conhecimento atual.
Na verdade, eles são amplamente divergentes, pois 20 loci não podem representar mais de 1% do genoma de Drosophila, no qual a estimativa de WALLACE de 50% se baseia. Embora declarações que dão limites específicos como "1'2 a 20 loci" não estejam na literatura publicada, essencialmente esta ideia está incorporada na declaração de CROW (1961) de que é "altamente improvável que mais de uma fração minúscula do efeito de consanguinidade é devido a alelos mantidos por forças seletivas equilibradas. ” A razão de nossa atual falta de conhecimento sobre a quantidade de heterozigosidade por locus em uma população é que nenhuma técnica foi disponível capaz de dar uma resposta direta e inequívoca, mesmo sob condições experimentais ideais. Qualquer técnica que forneça o tipo de informação clara de que precisamos deve satisfazer todos os seguintes critérios: (1) As diferenças fenotípicas causadas pela substituição alélica em um único loci devem ser detectáveis em um único indivíduo. (2) As substituições alélicas em um locus devem ser distinguíveis das substituições em outros loci. (3) Uma parte substancial de (idealmente, todas) as substituições alélicas devem ser distinguíveis umas das outras. (4) Os locais estudados devem ser uma amostra imparcial do genoma em relação a efeitos fisiológicos e grau de variação. Os requisitos 1 e 2 realmente correspondem à condição de que os fenótipos usados tenham uma herança mendeliana simples sem variações ambientais importantes. Os requisitos 3 e 4 vêm da necessidade de fazer afirmações sobre a variação no genoma como um todo a partir de uma amostra necessariamente restrita. Os métodos de análise disponíveis anteriormente atenderam a alguns desses requisitos, mas nenhum método atendeu a todos. Os estudos das ocorrências de mutações recessivas visíveis nas populações (SPENCER 1947) atendem aos requisitos 1 e 2, mas não são aleatórios em todos os loci e certamente não chegam nem perto de atender ao requisito 3. Algumas proporções muito pequenas, mas desconhecidas, de substituições alélicas aparecem como mudanças morfológicas visíveis. Polimorfismos bioquímicos e morfológicos particulares não atendem ao requisito 4, uma vez que são estudados precisamente porque são polimórficos. Assim, o fato de que vários polimorfismos de grupos sanguíneos sejam conhecidos no homem não é informação suficiente, uma vez que não sabemos se muitos loci não são polimórficos. Nem sabemos se os antígenos do grupo sanguíneo são uma amostra imparcial do genoma. Em um esforço para amostrar os efeitos dos genes de forma ampla, considerável atenção tem sido dada à variação genética em características de aptidão, como viabilidade, fertilidade, longevidade e assim por diante. Mas sejam eles examinados em Drosophila por experimentos de reprodução especiais (por exemplo, DOBZHANSKY e SPASSKY 1954), ou no homem por um estudo de taxas de mortalidade e morbidade em famílias consanguíneas (por exemplo, MORTON 1960), eles falham em satisfazer os requisitos 1 e 2. Devido à natureza das diferenças fenotípicas, é impossível, exceto em casos especiais, observar o efeito de substituições de um único gene ou identificar o genótipo de indivíduos. Para detectar diferenças genéticas para tais caracteres com alta variação ambiental, é necessário comparar as médias dos grupos de indivíduos para que a variação ambiental seja cancelada. Esses grupos devem ser diferenciados geneticamente uns dos outros e isso é feito por endogamia deliberada ou usando indivíduos intimamente relacionados. A dificuldade desta técnica é que após a consanguinidade, os grupos ou linhagens diferem uns dos outros em muitos loci simultaneamente. De fato, o número de loci representados em diferentes linhagens consanguíneas por diferentes homozigotos depende da quantidade de variação na população original, exatamente o que estamos tentando estimar. Assim, o geneticista se encontra na curiosa posição de que substituições alélicas de efeito grande o suficiente para serem detectadas como entidades segregantes únicas são claramente uma classe especial de mutações, enquanto a classe mais geral de alelos variantes, SO chamados de isoalelos, são de efeito tão pequeno que eles não podem ser detectados pelo simples mendelismo. O que necessitamos é uma técnica que detecte uma grande porção, senão toda, da variação isoalélica em um locus, mas detecte-a por meio de classes fenotípicas distintas, discretas e não sobrepostas comparáveis ao mutante visível usual. O objetivo deste trabalho é descrever tal método e os resultados genéticos obtidos quando ele foi usado em Drosophila pseudoobscura. O artigo que acompanha este periódico (LEWONTIN e HUBBY 1966) mostra o resultado de sua aplicação a populações de D. pseudoobscura em uma tentativa de responder à questão de quanta variação gênica existe em uma população selvagem de uma espécie que se reproduz sexualmente. O método a ser descrito baseia-se, grosso modo, no seguinte argumento. Qualquer mutação em um gene estrutural deve resultar na substituição, deleção ou adição de pelo menos um aminoácido no polipeptídeo produzido pelo gene. Tal substituição, deleção ou adição irá, em alguma fração de casos, resultar em uma mudança na carga eletrostática líquida no polipeptídeo. Esta mudança, por sua vez, mudará a carga líquida na enzima ou outra proteína da qual esse polipeptídeo é um constituinte. Uma vez que enzimas e proteínas em geral são, até onde sabemos, feitas de polipeptídeos de um ou às vezes dois genes estruturais diferentes, então podemos esperar que as diferenças eletroforéticas nas proteínas enzimáticas segregarão como genes de Mendelização únicos. Assim, se pesquisarmos um grande número de enzimas e outras proteínas e se determinarmos a mobilidade eletroforética de tais proteínas de um único indivíduo,
deve ser possível detectar a variabilidade de indivíduo para indivíduo em um único loci. O estudo da mobilidade eletroforética de enzimas e proteínas na verdade satisfaz os quatro requisitos dados acima quase perfeitamente. As diferenças fenotípicas são detectáveis em um único indivíduo. As substituições alélicas em diferentes loci são distinguíveis umas das outras porque a genética simples de cada diferença pode ser investigada como para qualquer caráter fenotípico. Como se viu, todas as diferenças eletroforéticas a serem descritas revelaram-se entidades mendelizantes únicas. Esse fato é mais importante porque libera o método de quaisquer suposições a priori sobre a ação do gene. Além disso, permite-nos, como primeira ordem de aproximação, igualar uma proteína sem qualquer variação detectável a um gene sem variação detectável. Ou seja, podemos contar o número de locos em nossa amostra que não apresentam variação, bem como o número que possui alelos alternativos. Esta é a pedra angular do método, pois nos permite estimar a proporção de todos os loci que apresentam variação nas populações. O terceiro requisito, que uma parte substancial de todas as alterações possíveis seja detectável, é atendido apenas em parte. Acontece que, no entanto, o artigo que o acompanha (LEWONTIN e HUBBY 1966) mostra que devemos estar detectando uma fração substancial da variação. Finalmente, as enzimas e proteínas de alta concentração utilizadas no estudo foram escolhidas sem referência à sua variabilidade conhecida na população, mas apenas porque existem técnicas de ensaio para elas. Uma discussão mais completa dos possíveis vieses em nosso método é fornecida no artigo anexo, onde os resultados da análise da população são descritos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Quarenta e três cepas de Drosophila pseudoobscura foram investigadas para os fins descritos acima. Cada cepa foi estabelecida a partir de uma única fêmea inseminada capturada na natureza e as 43 cepas representam material amostrado em cinco localizações geográficas. Trinta e três das cepas foram mantidas em culturas de massa por aproximadamente cinco anos. Isso inclui coleções de Wildrose, Califórnia (cepas IO); Mather, Califórnia (7 cepas); Cimmaron, Novo México (6 cepas); Flagstaff, Arizona (9 cepas); e BogotB, Colômbia (1 cepa). Dez cepas adicionais de Strawberry Canyon, Califórnia foram testadas durante suas gerações F e F. Todas as cepas eram homozigotas para o arranjo gênico do terceiro cromossomo Arrowhead (AB), com exceção do material Strawberry Canyon, que estava segregando várias inversões no terceiro cromossomo. Os estoques de marcadores empregados na localização cromossômica das várias diferenças alélicas de enzimas e proteínas foram os seguintes: Cromossomo Lup bz Ba gl / Delta; Cromossomo 3-Bl sc pr / ou L; Cromossomo Lin hk j Cy (Zn) / leth. A eletroforese em géis de acrilamida foi realizada conforme descrito por HUBBY (1963). A polimerização foi alcançada com adição de tetrametiletilenodamina (TEMED) a 0,2% no lugar do dimetilaminopropionitrila usado anteriormente. O tampão no gel e nos compartimentos celulares é o mesmo descrito anteriormente, exceto quando indicado no método de ensaio. Ensaios enzimáticos: Esterases- (modificado de SIMS 1965). Adultos únicos com um dia de idade foram triturados em 15 pl de tampão tris (hidroximetil) aminometano-borato (Tris-borato) 0,1 M pH 8,9 contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1,5 mM e sacarose 5% em um tubo de centrífuga 100 p1. A pasta foi centrifugada a 21.500 x g durante 3 minutos (tubos e centrífuga obtidos na Microchemical Speciality Corp., Berkeley, Califórnia). 10 p1 do sobrenadante foi colocado na bolsa de gel e a eletroforese foi conduzida a 4-50-500 v e 110-160 ma por 90 minutos. Os géis foram pré-incubados a 5 ° C em 100 ml de uma solução de ácido bórico 0,5 M durante 1,5 a 2 horas para baixar o pH do gel para aproximadamente 6,5. Os géis foram então incubados durante 2 a 4 horas a 25 ° C em 100 ml de tampão fosfato 0,1 M pH 6,5 contendo 20 mg de a-naftilacetato e 50 mg de Fast Red TRN (ambos de Dajac Laboratories, Philadephia, Penna.). Malic desidrogenase- (modificado de SIMS 1965). A preparação do gel e da amostra e a eletroforese foram as mesmas para a determinação da esterase. Para a detecção da enzima, os géis foram incubados 1 a 2 horas a 25 ° C em 100 ml de uma solução contendo Tris-HC1 1 mM pH 8,5 Na malato 1 mM, 0,1 miv KCN, 15 mg NAD e 50 mg Nitro BTR. No final do período de incubação, foram adicionados 2 mg de metossulfato de fenazina (PMS) e o gel foi incubado por mais 30 minutos. Glicose-6-fosfato desidrogenase (modificado de YOUNG, PORTER e CHILDS 1964). Adultos com um dia de idade foram extraídos como acima como fonte desta enzima. 3 mg de TPN foram incluídos na mistura de gel e a eletroforese foi continuada por 150 minutos. Os géis foram incubados de 1 a 2 horas em 100 ml de uma solução contendo 5 mM Tris-HC1 pH 8,5, 0,1 mM KCN, 50 p ~ MgCl ,, 50 mg de glicose-6-fosfato de sódio, 10 mg de TPN e 50 mg de Nitro BTR. No final do período de incubação, 2 mg de PMS foram adicionados e o gel foi incubado por mais 30 minutos. Fosfatase alcalina (modificado de BECKMAN e JOHNSON 1964a). Tampão Tris-borato 0,1 M a pH 8,9 não contendo EDTA foi usado na preparação do gel e nos compartimentos celulares; além disso, a solução de gel continha 5 mM de MgCl. Larvas de terceiro instar foram moídas em 15 pl de tampão também contendo MgC1. A eletroforese foi realizada a 400 volts por 90 minutos. Para a detecção da enzima, os géis foram incubados em 100 ml de uma solução contendo 1 mM Tris-HC1 pH 8,5, 50 PM MgCl ,, 50 mg de sódio a-naftilfosfato, 2 g NaC1 e 500 mg
HETEROZIGOSIDADE NA NATUREZA 581
polivinilpirrolidona. Após 1 a 2 horas, 50 mg de Fast Bluz RR foram adicionados e seguiu-se um período de incubação adicional de 30 minutos. a-glicerofosfato dzidrogenase- (modificado de SIMS 1965). A mistura de gel continha, além dos ingredientes usuais, 1,5 mM de um $ -glicerofosfato; o tampão de extração usual também continha uma concentração idêntica do substrato. Adultos com um dia de idade foram a fonte da enzima e, para a detecção da enzima, os géis foram incubados em 100 ml de uma solução contendo tampão Tris 1 mM a pH 8,5, 1 miv a $ -glicerofosfato, 0,1 miv KCN, 50 mg Nitro BTR e 15 mg de NAD. Após 2 horas de incubação, 2 mg de PMS foram adicionados para um período de incubação adicional de 30 minutos. Leucina aminopeptidase (modificado de BECKMAN e JOHNSON 1964b). O gel foi preparado da mesma maneira que para a fosfatase alcalina. As pupas tardias (um dia antes da emergência) foram trituradas individualmente em 10 81 de tampão Tris-borato 0,1 M pH 8,9 contendo MgC1 5 mM e 5% de sacarose. Para a detecção da enzima, os géis foram pré-incubados a 5 ° C em ácido bórico 0,5 M contendo MgCl 5 mM. Após a lavagem, o gel foi colocado em 100 ml de uma solução contendo tampão Tris-malato 2 mM pH 5,2 e 20 mg L de Leucil-P-naftilamida HC1. Após 2 horas, o gel foi transferido para 100 ml de tampão Tris-malato contendo 50 mg de Fast Black K. Proteínas de larvas: larvas de terceiro instar tardio foram moídas em 20 81 de tampão Tris-borato pH 8,9 contendo 1,5 miv de EDTA e 5% sacarose. O sobrenadante total da centrifugação foi aplicado aos géis e a eletroforese foi realizada a 500 v e 110 ma por 2 horas. Para a detecção de proteínas, os géis foram colocados em 100 ml de uma solução de 5 partes de metanol, 5 partes de água e 1 parte de ácido acético contendo 50 mg de Acid Black I. Os géis foram agitados 3 horas à temperatura ambiente. O excesso de mancha foi removido por lavagem adicional com a mistura de metanol e água e ácido acético.
RESULTADOS
Análise de cepas: Na fase inicial de cada ensaio, foram examinados 15 a 20 indivíduos de uma determinada cepa. Se nenhuma variação entre eles foi observada para a proteína particular em estudo, a cepa foi escolhida arbitrariamente como uma referência padrão. No caso de proteínas variáveis, o teste foi continuado até que uma cepa uniforme fosse encontrada. A análise do
resto das cepas foi então realizada em géis com 12 bolsas de amostra. Os bolsões externos (1 e 1'2) sempre continham amostras da cepa padrão, enquanto os dez bolsos restantes continham cinco indivíduos de cada uma das duas cepas. O resultado de um gel de triagem típico para a proteína Esterase-5 é mostrado na Figura 1. A figura mostra, além do padrão, algumas moscas apresentando bandas únicas (posições 2,3,5,6, 7,8 e 9 ) e alguns dando bandas duplas (posições 10 e 11). Estes últimos provaram ser heterozigotos. O caso com três bandas claras (bolso 4) mostrou ser um heterozigoto com ambas as enzimas parentais e a enzima híbrida (ver abaixo). Os homozigotos dos dois alelos em questão são mostrados flanqueando-o nas posições 3 e 5. Na maioria dos casos, o procedimento de amostragem foi repetido uma ou mais vezes para que 10, 15 ou mais indivíduos de cada cepa fossem examinados. Quando as variantes foram detectadas em uma cepa, matrizes puras foram obtidas para análise genética e para verificação cruzada da variabilidade entre as cepas. Quando as variantes foram obtidas de duas ou mais cepas que aparentemente tinham a mesma mobilidade, elas foram em todos os casos examinadas juntas no mesmo gel para verificar o achado. Indivíduos únicos de cada cepa que não apresentou variabilidade também foram examinados em géis únicos usando combinações suficientes para verificar esta conclusão. A Figura 2 ilustra a constância da mobilidade eletroforética obtida neste estudo de indivíduos de diferentes linhagens.
Esterases: Várias esterases podem ser detectadas em Drosophila pseudoobscura com os métodos presentes. Dez locais de atividade foram observados quando vários indivíduos foram reunidos e usados como fonte da enzima. No entanto, usando uma única mosca, há um local conspícuo de atividade. Nas condições eletroforéticas aqui empregadas, esta enzima é a quinta esterase da origem e será designada Fsterase-5 (E-5). A partir das populações amostradas, moscas fêmeas individuais mostraram uma variedade de fenótipos em relação à Esterase-5. Uma linhagem, na qual todos os indivíduos testados apresentavam um único local de atividade com mobilidade média de 6,3 cm. foi escolhido como padrão e foi atribuído a esta enzima um valor de mobilidade relativa de 1,00. As fêmeas individuais das várias cepas tinham um local principal de atividade esterase com mobilidades relativas de 0,85, 0,95, 1,00, 1,03, 1,07 e 1,12 (Figura 3A). Certas mulheres exibiram dois locais de coloração menos intensos, cada um com uma das mobilidades acima e um terceiro local de atividade no meio do caminho
... entre os dois sites principais. Assim, uma fêmea exibiu os principais locais de atividade em 1,00 e 1,12 e teve um local adicional em 1,06 (Figura IA, 4ª bolsa). Os machos, pelo contrário, nunca contiveram mais do que um local de atividade da Esterase-5. Concluiu-se que o locus que especifica a estrutura desta enzima estava provavelmente ligado ao sexo e que os três locais de atividade encontrados nas mulheres eram resultado da formação de uma enzima híbrida em um heterozigoto. Os cruzamentos genéticos apoiaram totalmente essas conclusões. Um exemplo típico ilustrará essas descobertas. Depois que ovos suficientes foram postos de um acasalamento de pares, os pais foram sacrificados e seu fenótipo Esterase5 foi determinado. Verificou-se que a fêmea tinha atividade de Esterase-5 com mobilidade relativa de 1,12 e o macho tinha um local de atividade com mobilidade relativa de 0,85. Todos os F, progênie feminina tiveram locais de atividade em 1,12, 1,02 e 0,85. Todos os F, progênie masculina, tinham um local de atividade com uma mobilidade relativa de 1,12. Resultados comparáveis foram observados para cada uma das formas variantes. Além disso, em retrocruzamentos de mulheres heterozigotas com homens hemizigóticos assumidos, os filhos foram produzidos com um ou outro, mas nunca com as duas formas dos avós, enquanto filhas heterozigotas e homozigotas foram encontradas. Assim, as diferenças de Esterase-5 se comportam como personagens simples ligados ao sexo. O locus genético ligado ao sexo responsável por parte ou toda a estrutura desta proteína será denominado esterase-5 (e-5) e as formas alélicas deste locus serão distinguidas por um sobrescrito referente à mobilidade relativa da proteína produzida pelo alelo. Assim, os seis alelos descobertos até agora são e-5yS5, e-5.95, e-51.00, e-5l 03, e-51.07 e e-5, 12, e a proteína correspondente será chamada de Estera ~ e-5, ~ ~ (E-5.s5) etc. As Figuras 3A e B ilustram as seis formas alélicas da enzima detectadas e os resultados do ensaio de indivíduos heterozigotos para certos pares desses alelos. A formação de enzimas híbridas foi detectada em heterozigotos entre todas as seis formas alélicas que tinham diferenças de mobilidade eletroforética suficientes para permitir a discriminação (Figura 3B). Não foi possível detectar a formação de híbrido entre E-51,0 ° e E ', ", nem entre e E-5',07. Em ambos os casos, no entanto, as áreas manchadas fundiram-se de forma a indicar que uma molécula híbrida foi provavelmente presente. Foi possível mostrar que a banda intermediária era de fato uma enzima híbrida pela criação de moléculas híbridas in vitro. Moscas de duas cepas diferentes em mobilidade foram maceradas e os sobrenadantes misturados congelados na presença de NaCl 1 M durante a noite. descongelado e aplicado a um gel para eletroforese e exame de Esterase-5. Uma banda intermediária foi produzida por este tratamento juntamente com bandas correspondentes às proteínas da cepa original (HUBBY e NARISE, em preparação). Foi feito um esforço com esta enzima para determinar se os alelos que produzem uma enzima com a mesma mobilidade eletroforética fossem idênticos em outros aspectos, quando vinham de populações diferentes. Conseqüentemente, uma série de tratamentos térmicos de enzimas Esterase-5 foram realizados. se-5 ~. ~~ diferia nitidamente das outras cinco formas da enzima. O aquecimento do extrato enzimático por 5 minutos a 50 ° C destruiu completamente a atividade de E-5l.O3 e não teve efeito aparente nas outras cinco formas de Esterase-5. E-5, 0,03 'foi encontrado em duas localidades, Wildrose e Mather, Califórnia. Ambos os isolados dessas localidades mostraram o mesmo grau de sensibilidade ao calor. Nenhuma diferença na sensibilidade ao calor em outras temperaturas foi observada com os outros cinco alelos. Desidrogenase málica: a desidrogenase málica existe em várias formas em D. pseudoobscura. A maioria das cepas estudadas tinha uma banda principal de atividade enzimática a aproximadamente 4,7 cm da origem. Esta enzima foi escolhida como padrão e recebeu um valor de mobilidade relativa de 1 .OO (Figura 2B). Uma segunda banda de atividade foi geralmente observada a aproximadamente 5,2 cm da origem em formas que também continham a forma padrão da enzima. Esta segunda área de coloração era consideravelmente mais clara do que a banda principal. Também sob a condição de ensaio, outra área de coloração estava uniformemente presente. No entanto, essa enzima não era específica para o substrato e só exigia a presença de NAD, PMS e o corante para detecção (ver SIMS 1965). Três outras formas de desidrogenase málica foram detectadas nessas cepas. Em todos os casos, o local de atividade dominante tinha uma mobilidade relativa diferente do padrão. Assim, foram demonstradas formas com mobilidade relativa de 0,90, 1 .I 1 e 1,20. Em cepas de reprodução pura para essas enzimas, a forma múltipla da enzima teve uma alteração correspondente na mobilidade. As formas com o principal local de atividade em 1,00 tiveram um local secundário em 1,10, enquanto aqueles indivíduos com 0,90 e 1,20 tiveram locais menores em 1,0 e 1,3, respectivamente. As cepas de cruzamento puro para as quatro formas da enzima foram isoladas e os cruzamentos foram feitos reciprocamente entre todos os pares possíveis. F, fêmeas e machos não diferiram em seus fenótipos. Em cada cruzamento, porém, o F, os indivíduos exibiam um novo local de atividade no meio
do caminho entre a mobilidade das formas parentais. Em um cruzamento de indivíduos com a forma 1,2 da enzima por indivíduos com a forma 0,9, a F, as moscas tinham locais de atividade em 1,2, 0,9 e 1,05. A atividade de coloração foi aproximadamente na proporção de 1: 1: 2 (Figura 4). Bandas fracas das formas múltiplas da enzima ainda eram perceptíveis. Para determinar qual cromossomo controla as diferenças na desidrogenase málica, um cruzamento foi feito entre uma linhagem de cruzamento puro para a forma 1,20 da enzima e cada um dos estoques de marcadores dominantes (todos os cruzamentos puros para a forma 1,00 da enzima). Para cada cruzamento, F, machos heterozigotos para o marcador dominante foram então retrocruzados com fêmeas do estoque do marcador. A progênie de retrocruzamento não portadora do marcador dominante foi então testada quanto à sua constituição enzimática. No caso de cruzamentos envolvendo o 2º e o 3º marcadores cromossômicos, a progênie de retrocruzamento de tipo selvagem caiu em duas classes: moscas com apenas a forma 1,00 (ou seja, homozigotos) e moscas com ambas as formas (heterozigotos 1,00 / 1,20). No caso dos cruzamentos do marcador do 4º cromossomo, entretanto, cada retrocruzamento individual do tipo selvagem possuía ambas as formas e era presumivelmente um heterozigoto, 1.OO / 1.20. Assim, concluiu-se que o locus que especifica a desidrogenase málica estava no quarto cromossomo. Os alelos neste locus serão designados mdh. ", Mdhl, oo, mdh '." E mdh1.20. Glicose-6-fosfato desidrogenase: A glicose-6-fosfato desidrogenase foi detectada como um local de atividade específico do substrato que migrou em média 3,8 cm nas condições empregadas. Nenhuma variante eletroforética desta enzima foidetectados dentro das cepas analisadas.
a-glicerofosfato desidrogenase: Ensaios de a-glicerofosfato desidrogenase revelaram dois locais de substrato de atividade migrando a uma distância média de 2,9 e 3,3 cm sob as condições eletroforéticas. A enzima com a taxa de migração mais rápida exibiu a maior atividade. Nenhuma variação eletroforética dessas proteínas foi observada. Como no sistema de ensaio da desidrogenase málica, foi encontrado um local de atividade que exigia apenas a presença de NAD, PMS e corante para detecção (Figura 5). Fosfatase alcalina: Cinco locais de atividade da fosfatase alcalina foram geralmente demonstrados em larvas de terceiro instar tardio (Figura 6). Ocasionalmente, duas outras áreas levemente manchadas apareceram no gel. Esses sete locais serão designados por fosfatase alcalina (Ap) 1 a 7 em ordem crescente de mobilidade. Esses sete sites tinham uma mobilidade absoluta média de 1,0, 2,5, 2,6, 3,3, 3,9, 4,4 e 5,0 cm. Ap-4 exibiu a maior atividade sob nossas condições de ensaio. Apl e Ap-2 não variaram eletroforeticamente nas amostras estudadas, mas foram identificados positivamente em apenas cerca de 60% dos géis. Ap-3 e Ap-5 também foram encontrados com pouca frequência para análise, portanto, não serão considerados mais neste estudo. Ap-4 teve duas variantes eletroforéticas nas populações amostradas. Em uma das 43 cepas, todos os indivíduos amostrados apresentaram um local de atividade um pouco mais lento do que o local usual de Ap-4. Em cruzamentos recíprocos entre indivíduos de reprodução pura para as formas de migração rápida e lenta da enzima, todas F, as fêmeas produziram um local de atividade intermediário e sobreposto às formas parentais da enzima; os machos sempre exibiram a forma da enzima característica de suas fêmeas 
... pai. Assim, concluiu-se que o locus que controlava a enzima era sexlinkado. Esta conclusão foi apoiada pela produção de uma ou outra forma parental da enzima na progênie masculina de F, fêmeas. O locus ligado ao sexo especificando Ap-4 será designado ap-4 e os dois alelos detectados neste estudo serão conhecidos como ~ p-4. ~~ e u ~ - ~~ .OO, respectivamente, para as formas lenta e rápida da enzima eles produzem. A atividade de Ap-4 foi extremamente sensível à presença de íons Mg ++ no gel. Os géis feitos sem incluir este íon revelaram os outros locais de atividade do fosfato alcalino, mas raramente mostraram atividade Ap-4. Ap-6 não mostrou nenhuma variante eletroforética, mas variou consideravelmente na quantidade de atividade entre as cepas e entre os indivíduos da mesma cepa. Ap-6 estava ausente em todos os indivíduos de uma cepa. Em cruzamentos recíprocos entre indivíduos com e sem um local de atividade em Ap-6, todos F, os indivíduos exibiram atividade naquele local. Por causa da atividade variável desta enzima, nenhuma declaração clara sobre se os indivíduos F diferem do tipo parental que produz a enzima pode ser feita no momento. No retrocruzamento de F, foram encontradas fêmeas com machos sem atividade de Ap-6, progênie exibindo e não exibindo atividade enzimática em Ap-6. A ligação do gene responsável pela Ap-6 ainda não foi determinada. Os alelos no locus que especifica esta enzima serão designados ap-6 'e ap-6- para as formas ativa e inativa, respectivamente (Figura 6). Ap-7 se comportou de maneira estritamente análoga ao Ap-6. Assim, nenhuma diferença eletroforética foi encontrada (no entanto, veja abaixo), a atividade variou consideravelmente e uma cepa foi encontrada na qual nenhuma atividade foi detectada na grande maioria dos indivíduos. De linhagens consanguíneas derivadas desta cepa, um estoque uniformemente deficiente na atividade enzimática foi derivado e cruzamentos recíprocos foram feitos para moscas exibindo uniformemente esta atividade enzimática particular. F, a progênie não diferiu na atividade da enzima em relação ao sexo e atividade uniformemente possuída. A progênie de um retrocruzamento de F, fêmeas com machos sem a enzima segregada quanto à presença e ausência desta atividade. Os alelos que produzem as formas ativa e inativa são designados ap-7 + e ap-7-, respectivamente. Durante o curso da análise das cepas, um único indivíduo apresentou dois locais de atividade na área de atividade do Ap-7. Ambos os locais eram de igual intensidade, um ocupava a área migratória usual de Ap-7 e o outro era um pouco mais rápido. Isso poderia ser explicado pela presença de alelos codominantes heterozigotos em ap-7, mas como isso não foi encontrado novamente, essa interpretação deve permanecer conjectural. Leucina aminopeptidase: A leucina aminopeptidase provou ser o sistema de ensaio mais difícil de analisar. Até oito locais de atividade com mobilidade diferente foram detectados em linhagens consanguíneas usando indivíduos únicos. A enzima que migra em segundo lugar da origem teve a maior atividade e foi observada de forma mais consistente. Foram encontradas cepas que apresentavam quatro formas eletroforéticas diferentes dessa enzima. A diferença nas taxas de migração foi extremamente leve e só pode ser detectada por comparação lado a lado em bolsas adjacentes do gel. Essas diferenças, embora leves, eram consistentes e características da cepa. F, os indivíduos obtidos pelo cruzamento das cepas com a maior diferença nas taxas de migração tiveram um local de atividade sobreposto às duas formas parentais. Este site não poderia ser caracterizado quanto ao número ou intensidade de áreas mais discretas. Não houve diferenças detectáveis entre cruzamentos recíprocos. Resultados de um exame de indivíduos de um retrocruzamento foi consistente com uma interpretação de um único tipo parental e um tipo híbrido. Mas sentimos, no momento, que técnicas mais elaboradas serão necessárias para a comprovação completa dessas descobertas. A relação de ligação do gene que controla essa enzima, que chamaremos de lap-2. atualmente não é conhecido. Proteínas larvais: Mais de 13 proteínas podem ser observadas a partir de extratos de larvas de 3o ínstar (Figura 7). Presumivelmente, estes derivam em grande parte da hemolinfa. Destes, nove podem ser demonstrados rotineiramente. Neste caso, em vez de usar cepas padrão arbitrárias, suas mobilidades foram calculadas a partir de um padrão de referência de albumina de soro bovino. Essas proteínas são designadas
Proteínas (Pt) 1 a 13 e, por inferência ou teste genético, os loci responsáveis por sua produção são chamados de pt-1 a pt-13. Pt-7, 8 e 10 foram as proteínas coradas mais proeminentemente e apresentaram variabilidade eletroforética. Em dois casos, três
... diferentes formas da proteína foram detectadas, enquanto na terceira, quatro formas foram encontradas. As formas das proteínas foram nomeadas de acordo com suas mobilidades relativas e são as seguintes: Pt-7.73, Pt-7,75, Pt-7,77; Pt-8.so, Pt-8. ", Pt-8,83; e Pt-10l.", Pt-101,04, Pt-101. @ 6, Pt-101,08. Indivíduos isolados continham no máximo apenas duas das formas possíveis e linhagens de cruzamento puro para nove das dez formas possíveis foram obtidas (a exceção foi pt-101. @ S). Em cada caso, todos os F, indivíduos de cruzamentos recíprocos de cepas com diferentes formas das proteínas exibiram ambas as formas parentais. Em retrocruzamentos de F, fêmeas com uma ou outra linhagem de reprodução pura, dois tipos de progênie foram observados: aqueles que exibiam apenas uma proteína na forma do pai retrocruzado e aqueles que exibiam ambas as formas como em seu pai F. Assim, os loci genéticos responsáveis pela produção dessas proteínas são chamados pt-7, com três formas alélicas ~ t-7. '~ E ~ t-7. ~~; pt-8, com três formas alélicas ~ t-8. ~ O, pt-8, S1 e ~ t-8. ~~; e pt-10, com quatro formas alélicas pt-1 O '. @', pt-1 ol. ", pt-1 01.06 e pt-1 01.08. A localização cromossômica dos três loci foi determinada como segue. Primeiro, constituição genética dos estoques de marcadores foram testados para esses três loci. Foi descoberto que o segundo estoque de marcadores de cromossomos era homozigoto para ~ t-7. '~ e pt ZO1.O1. O estoque de marcadores para o terceiro cromossomo era homozigoto para ~ t-7. ~~ e ~ t-8. ~ l, mas era consistentemente heterozigoto para pt-101.04 e pt-1O1So6. O estoque de marcadores letais balanceados para o quarto cromossomo continha ~ t-7, '~ e ~ t- 7, ~~ em condição heterozigótica e homozigótica, e era homozigoto para ~ t-8. ~~ e pt-101g04. Assim, concluiu-se que pt-IO estava provavelmente no terceiro cromossomo e que pt-7 provavelmente não estava no quarto cromossomo. Em segundo lugar, os estoques de marcadores foram então cruzados com cepas portadoras de diferentes alelos; F, machos e fêmeas portadores do marcador dominante foram consanguíneos e sua progênie testada como larva. Se a progênie fosse descobriram que eram homozigotos para a característica alélica do estoque do marcador, concluiu-se que esse alelo não estava ligado ao cromossomo carregando o marcador dominante, uma vez que os marcadores dominantes eram homozigotos letais e estavam associados a supressores de crossover. A partir dessa análise, concluiu-se que pt-7 e pt-8 estavam localizados no cromossomo 2 e pt-10 no cromossomo 3. pt-101.os foi encontrado em um único indivíduo (como um provável heterozigoto com pt 101 * @ 6) e nunca recapturado em testes subsequentes. Pt-1, 4, 6, 11, 12 e 13 foram, além de Pt-7, 8 e 10, observados na análise das cepas, embora não identificados positivamente em cada amostra. Destes, Pt-1, Pt-4, Pt-6 e Pt-13 foram encontrados em todas as 43 cepas. Pt-12 foi identificado em 36 cepas, Pt-11 em 34, Pt-5 em 18 e Pt-9 em 15. Pt-4, 6, 11 e 12 não apresentaram variabilidade na mobilidade. A migração de Pt-1 variou de uma mobilidade relativa de 0,21 a 0,23 (ver Figura 7). Esta variação não era consistente ou reproduzível. Não foi associado de forma alguma com a derivação da cepa do indivíduo, nem foram obtidas cepas de reprodução pura que diferissem consistentemente umas das outras. Como a migração dessa proteína foi a mais lenta de todas as proteínas testadas, ela foi, conseqüentemente, a menos confiável. Portanto, concluímos provisoriamente que essa variação não foi determinada geneticamente. Pt-13, a proteína de migração mais rápida, foi encontrada em duas condições. Em 39 das 43 cepas investigadas, essa proteína migrou com mobilidade relativa de 1,30. Em duas cepas, uma proteína foi vista com uma mobilidade relativa de 1,28, além da forma usual em 1,30. Em testes subsequentes com essas duas cepas, essa banda adicional não foi observada.
CONCLUSÕES GERAIS
Evidências diretas foram obtidas para oito loci genéticos e fortes evidências foram apresentadas para um nono locus controlando várias proteínas em Drosophila pseudoobscura. A partir da análise desses loci, foi possível distinguir 6 alelos em um locus (esterase-5), 4 alelos em três loci separados (mdh, lap-2 e pt-IO), 3 alelos em dois loci separados (pt-7 e pt-8) e 2 alelos em três loci (ap-4, ap-6 e ap-7). Destes nove loci, seis foram encontrados para estar ligados a um dos cinco cromossomos de D. pseudoobscura. Estes incluem esterase-5 e fosfatase alcalina-4 no cromossomo X, pt-7 e pt-8 no segundo cromossomo, pt-10 no terceiro cromossomo e desidrogenase málica no quarto cromossomo; ap-6, ap-7 e lap ainda não foram colocados em cromossomos específicos, mas sabe-se que eles se comportam como genes mendelianos únicos em retrocruzamentos. Além disso, 12 outras proteínas foram encontradas que não variaram eletroforeticamente. Assim, nenhuma evidência direta pôde ser obtida quanto ao seu controle genético. No entanto, não temos razão para acreditar que os ditames da teoria genética moderna não pertençam a essas proteínas. Consequentemente, incluiríamos estes como exemplos de produtos gênicos de loci que não apresentam variação alélica. Esta é, obviamente, uma aproximação, uma vez que nem todas as mudanças genéticas dão origem à variabilidade eletroforética. Portanto, esta técnica apenas nos fornece uma medida do limite inferior de todas as variações gênicas possíveis em um locus particular. No entanto, dos 21 loci investigados, foi possível demonstrar de forma confiável mais de um alelo em nove deles. A distribuição de loci variáveis nas várias funções precisam ser considerada quando usamos essas diferenças para perguntar sobre a variação genética no genoma como um todo. Em primeiro lugar, obviamente estamos amostrando apenas loci de genes estruturais, em vez de genes controladores. Em segundo lugar, deliberadamente colocamos peso no levantamento de uma variedade de enzimas e proteínas, em vez de estudar exaustivamente muitas enzimas com a mesma especificidade geral. Existem dez locais de atividade esterase detectáveis em géis, mas estudamos apenas aquele com alta atividade em nossas condições. No caso em que várias enzimas relacionadas foram estudadas, das cinco fosfatases alcalinas, três eram variáveis e duas constantes. Entre as cinco proteínas enzimáticas restantes, três também são variáveis e duas constantes. Portanto, não parece haver nenhuma diferença entre uma amostra ampla de funções e uma amostra estreita. As proteínas larvais são proteínas únicas em alta concentração. Nenhuma das proteínas enzimáticas específicas aparece com a coloração de Black I com ácido, provavelmente porque estão em concentrações muito baixas. Das 11 proteínas, três apresentaram variação genética confiável e uma, Pt-13, apresentou variação que ainda não foi confirmada. Esta é uma variação menor do que seis entre dez entre as enzimas analisadas, mas não totalmente diferente. Pode ser em parte devido ao menor tamanho da amostra analisada para Pt-5, 9, 11 e 12. Essa semelhança geral na variação dentro dos dois grupos de proteínas nos permite, pelo menos como uma primeira aproximação, usá-los como uma amostra representativa de genes estruturais no genoma de D. pseudoobscura. A localização cromossômica de alguns dos genes envolvidos merece alguns comentários breves quanto à sua possível homologia com outras espécies de Drosophila. Em D. melamgaster, tanto a esterase-6 quanto a esterase C foram localizadas no braço esquerdo do cromossomo 3 (elemento D) (WRIGHT 1963; BECKMAN e JOHNSON 1964 ~). A esterase-5 em D. pseudwbscura está no cromossomo X, que é composto dos elementos A e D. Assim, a esterase em D. pseudoobscura pode ter tido uma origem comum com uma ou outra das enzimas em D. melanogaster. No entanto, eles
claramente não são idênticos, uma vez que diferem na mobilidade eletroforética e na capacidade de formar moléculas híbridas em heterozigotos. Um gene de fosfato alcalino também foi encontrado no cromossomo 3 de D. melanogaster (BECKMAN e JOHNSON 1964a). Como uma das enzimas com essa atividade está ligada ao sexo em D. pseudoobscura, há novamente a possibilidade de homologia genética dessa enzima entre essas espécies. Deve ser apontado que técnicas como essas são aplicáveis à maioria dos outros organismos e, portanto, fornecem os meios para análises semelhantes de outros tipos de espécies.