RESUMO: reação em cadeia da polimerase (PCR)

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@vireicientista 
reação em cadeia da polimerase 
Testes moleculares servem para indicar com 
certeza qual é o diagnóstico de um paciente, 
assim como testes sorológicos. 
TESTE 
SOROLÓGICO 
TESTE 
MOLECULAR 
+ sensível + específico 
Anticorpos Segmento de DNA 
METODOS DE DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR 
 Transcription-mediated amplification 
(TMA); 
 Microarray; 
 Next generation sequencing (NGS); 
 Hibridização; 
 Polymerase Chain Reaction (PCR) e 
suas variações; 
o RT-PCR; 
o qPCR (ou real time); 
o Nested PCR; 
o Multiplex PCR. 
INTRODUÇÃO AO DNA 
 
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR: Uma 
porção de gene de DNA vai ser transcrito em RNA e depois 
traduzido em proteína. 
TRANSCRIÇÃO: primeira etapa da 
expressão de um gene; 
A transcrição é realizada por enzimas 
chamadas RNA polimerases, que ligam 
nucleotídeos para produzir uma cadeia de 
RNA (usando uma cadeia de DNA como 
modelo). 
Porque transcrever? 
É preciso transcrever o DNA porque o DNA 
localizado no núcleo não pode entrar em 
contato com o citoplasma, por isso é transcrito 
em forma de RNA para fora do núcleo. 
APENAS VÍRUS FAZEM TRANSCRIÇÃO 
REVERSA! 
 ENZIMA: TRANSCRIPTASE REVERSA, 
encontrada no HIV, hepatite, entre 
outros vírus. 
NUCLEOTÍDEO 
 
DNA é característico por apenas um OH no carbono 3. 
 O fato do RNA ser mais instável é por 
conta do seu OH a mais no carbono 2. 
Não existe tradução reversa porque o codigo 
genético é degenerado. 
 Significa que um mesmo aminoácido pode 
ser codificado por mais de um códon, mas 
o contrário não ocorre. 
 
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@vireicientista 
Adenina e guanina são purinas: Dois aneis 
carbono-nitrogênio. 
Citosina e timina são pirimidinas: Um anel 
carbono-nitrogênio. 
Uracila também é pirimidina: com apenas 
um anel carbono-nitrogênio. 
REPLICAÇÃO 
 Helicase: promove a abertura da fita de 
DNA -> forquilha de replicação; 
 Topoisomerase: desenrola a cadeia de 
DNA à frente da helicase, promovendo a 
diminuição na tensão da fita; 
 RNA primase: sintetiza os primers 
(iniciadores) da reação; 
 DNA polimerase: síntese da nova cadeia 
de DNA (sempre no sentido 5’-> 3’); 
 Replicação semiconservativa; 
 Cadeia contínua (mesmo sentido da 
replicação) e replicação fragmentada 
(Fragmentos de Okazaki); 
 DNA ligase. 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
 
A PCR possibilita a amplificação de 
sequências de DNA que estejam presentes em 
misturas complexas para obtenção de grandes 
quantidades de DNA para sequenciamento e 
análises sobre a diversidade genética de 
populações. 
A extração de DNA inclui basicamente dois 
procedimentos principais: a lise das células 
presentes na amostra e a purificação do DNA. 
Após a lise das células, o DNA deve ser 
separado dos restos celulares e das proteínas, 
precipitado e suspenso em volume adequado 
de água ultrapura ou soluções-tampão 
adequadas. 
a) Desnaturação 
• DNA perde sua estrutura de dupla 
hélice 
• 94°C a 95°C 
• Primers se ligam à região 
complementar à sua sequência na 
amostra de DNA. 
• O DNA permanece desnaturado por 
todos os ciclos subsequentes, porque 
as fitas complementares estão em 
concentrações muito baixas, o que 
impede a sua reunião. 
b) Anelamento 
• A temperatura é reduzida (específica 
para cada par de primers). 
• Cada primer se encaixa nas 
respectivas sequências 
complementares à região-alvo da 
amplificação. 
c) Extensão 
• A temperatura é elevada até cerca de 
272°C, 
 
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@vireicientista 
• A enzima DNA-polimerase (Taq-DNA-
polimerase) se posiciona junto aos 
primers e com o auxílio do magnésio, 
inicia a síntese da nova fita. 
• A síntese se dá por meio da utilização 
dos nucleotídeos (dNTPs) que foram 
adicionados ao tampão e que são 
sempre complementares à fita-molde.