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M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 1 Degradação de hemoglobina e tipagem sanguínea Degradação da hemoglobina Tempo de vida das hemácias As hemácias vão da medula óssea para o sistema circulatório, circulando por 120 dias em média antes de serem destruídas. Elas contêm enzimas citoplasmáticas capazes de metabolizar glicose e formar pequenas quantidades de trifosfato de adenosina. Essas enzimas também mantêm: 1. A flexibilidade de sua membrana celular 2. O transporte de íons através da membrana 3. O ferro da hemoglobina na forma ferrosa 4. Impedem a oxidação das proteínas presentes nas hemácias Mesmo assim, o sistema metabólico das hemácias senis fica, de forma progressiva, menos ativo, com as células cada vez mais frágeis devido ao desgaste de seus processos vitais Quando a membrana das hemácias fica frágil, a célula se rompe durante sua passagem por algum ponto estreito da circulação. Muitas das hemácias se autodestroem no baço, formando a polpa vermelha Destruição da hemoglobina por macrófagos Quando as hemácias se rompem, elas liberam hemoglobina, que é fagocitada pelos macrófagos, especialmente as células de Kuppfer, no fígado, e os macrófagos, no baço e na medula óssea. No decorrer das próximas horas a dias, os macrófagos liberam o ferro da hemoglobina de volta para o sangue, para ser transportado pela transferrina até a medula óssea, para produção de novas hemácias, ou para o fígado e outros tecidos, para armazenamento sobre a forma de ferritina A porção porfirina da molécula de hemoglobina é convertida pelos macrófagos por meio de diversas etapas no pigmento biliar, bilirrubina Metabolismo da bilirrubina Quando as membranas celulares das hemácias se rompem e a hemoglobina é liberada, ela é fagocitada pelos macrófagos teciduais (sistema reticuloendotelial) por todo o corpo A hemoglobina é cindida em globina e heme, sendo o anel do grupo heme aberto, fornecendo ferro livre que é transportado pela ferritina, e também fornece uma cadeia reta de quatro núcleos pirrólicos, que constituem o substrato A primeria substância formada é a biliverdina, mas esta é rapidamente reduzida a bilirrubina livre, também chamada de bilirrubina não conjugada que é liberada gradualmente dos macrófagos para o plasma. Ela se liga de imediato e fortemente à albumina plasmática, sendo transportada nessa combinação por todo o sangue e líquidos intersticiais Em horas, a bilirrubina não conjugada é absorvida através das membranas celulares dos hepatócitos. Ao passar para seu interior, ela é liberada da albumina plasmática e depois, 80% serão conjugados ao ácido glicurônico para formar glicuronídeo de bilirrubina, 10% se unirão ao sulfato para formar sulfato de bilirrubina, e 10% se associarão à diversidade de outras substâncias Sob essas formas, a bilirrubina é excretada dos hepatócitos, por processo de transporte ativo, para os canalículos biliares e daí para os intestinos No intestino, cerca de metade da bilirrubina conjugada é convertida por ação bacteriana na substância urobilinogênio. Uma parte será reabsorvida através da mucosa intestinal de volta para o sangue. Sua maior parte é reexcretada pelo fígado novamente para o intestino, mas cerca de 5% são excretados na urina, pelos rins Após a exposição ao ar, na urina, o urobilinogênio é oxidado em urobilina. Alternativamente, nas fezes é alterado e oxidado para formar estercobilina Avaliação da função hepática Os testes sanguíneos realizados para testar a função hepática são: 1. Alanina aminotransferase (ALT) M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 2 2. Albumina 3. Alcalina fosfatase (ALP) 4. Aspartato aminotransferase (AST) 5. Bilirrubina 6. Gama glutamil transferase (GGT) 7. 5’- nucleotidase 8. Lactato desidrogenase 9. Tempo de protrombina Alanina aminotransferase Alanina aminotransferase é uma enzima encontrada nos rins, coração, músculos esqueléticos e principalmente no tecido hepático. Ela funciona como um catalisador nas reações de produção de aminoácidos. Ela é liberada quando há dano à membrana do hepatócito Esse teste é utilizado principalmente para diagnósticos de doenças hepáticas (lesões hepáticas aguda, como hepatite viral, hepatite crônica, câncer no fígado e danos hepáticos causados por drogas) e para monitorar o efeito de drogas hepatotóxicas Quando há um aumento de até 50 vezes, o valor de referência pode indicar hepatite viral ou grave, induzida por drogas, ou outra doença hepática com necrose extensa. Níveis moderado a alto indicam mononucleose infecciosa, hepatite crônica, colestase intra-hepática, hepatite viral aguda no início ou processo de cura. Ligeiras elevações a moderadas indicam comprometimento hepatocelular agudo, tais como cirrose ativa, hepatite alcoólica ou induzida por drogas Valores normais: Female: 7–30 U/L (0.12–0.50 μkat/L SI units) Male: 10–55 U/L (0.17–0.91 μkat/L SI units) Albumina É uma proteína produzida pelo fígado e normalmente liberada no sangue que serve para avaliar a existência de lesões no fígado. Uma das funções da albumina é reter líquido no interior dos vasos sanguíneos. Alcalina fosfatase Alcalina fosfatase é uma enzima encontrada no fígado, nos ossos, na placenta, intestino e nos rins, mas principalmente em células do trato biliar e em osteoblastos envolvidos na formação de novos ossos. Ela normalmente é excretada do fígado, na bile Níveis anormais são encontrados em várias doenças hepáticas, obstrução biliar e em períodos de crescimento ósseo Valores normais Mulheres: 30–100 U/L (0.5–1.67 mkat/L SI units) Homens: 45–115 U/L (0.75–1.92 mkat/L SI units) Idosos: Slightly higher norms Crianças: One to three times adult norms Puberdade: Five to six times adult norms Aspartato aminotransferase É uma enzima encontrada principalmente no coração, fígado e nos músculos. Ela é liberada na circulação depois de lesão ou morte celular, apresentando valores elevados após 12 horas e se mantendo por 5 dias. Ele é feito quando há suspeita de danos no músculo cardíaco, infarto do miocárdio, e danos hepáticos • Aumento de mais de 20 vezes o valor de referência – hepatite viral, tóxica e doenças necróticas hepáticas; • Aumento de 10 a 20 vezes o valor de referência; – mononucleose, infarto do miocárdio e cirrose alcoólica • Aumento de 5 a 10 vezes o valor de referência: – hepatite crônica • Aumento de 2 a 5 vezes; – anemia hemolítica. • Além das características individuais, a relação entre o aumento das enzimas tem valor diagnóstico. • AST e ALT se alteram na mesma proporção em doenças hepáticas • Elevações pequenas de ambas – Ou apenas de ALT em pequena proporção, – são encontradas na hepatite crônica • Elevação mais acentuada (o dobro ou mais) de AST (mitocôndrias) – hepatite alcoólica de vido há maior lesão mitocondrial • Valores de ALT iguais ou superiores ao AST: – Hepatite viral, icterícia pós hepática ou colestase intra hepática. M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 3 Bilirrubina Em exames, a bilirrubina pode ser classificada como: total, direta ou conjugada, indireta ou não conjugada A bilirrubina total é composta pela soma da bilirrubina direta e indireta. As bilirrubinas diretas e indiretas já foram classificadas anteriormente Há aumento nos níveis de bilirrubina direta em caso de icterícia obstrutiva (das vias biliares) ou por conta de icterícia hepática Há aumento dos níveis de bilirrubina indireta em casos de icterícia hemolítica, causados por disfunções hepatocelulares, comoa hepatite Níveis anormais de bilirrubina indireta indicam icterícia hemolítica, icterícia neonatal. A bilirrubina direta indica icterícia obstrutiva. Quando existem níveis alterados de bilirrubina direta e indireta indicam lesão hepática Gama glutamil transferase É uma enzima produzida pelo fígado, pelo pâncreas e pelos rins e que é liberada na corrente sanguínea quando esses órgãos estão sendo danificados. Serve para se saber se existe alguma lesão orgânica, intoxicação por drogas e ou medicamentos, abuso de álcool ou doenças do pâncreas. 5’nucleotidase Esse teste é feito junto com a ALP com a finalidade de diferenciar doenças hepatobiliares e doenças ósseas, já que é uma enzima encontrada na membrana plasmática de células hepáticas e células do ducto biliar Lactato desidrogenase A lactato desidrogenase é uma enzima intracelular encontrando primariamente no coração, fígado, músculos esqueléticos e nos eritrócitos. Além disso, pode ser encontrada em menores quantidades no cérebro, rins, pulmões, pâncreas e no baço. Essa enzima é liberada após ocorrer dano ao tecido Medir as isoenzimas contribui para diferenciar o local em que há elevação dos valores de lactato desidrogenase Tempo de protrombina É o tempo necessário para que o sangue coagule indicando lesões hepáticas ou deficiência da absorção de vitamina K causada por uma carência de bile. Tipagem sanguínea Definições Antígeno O termo antígeno ou imunógeno significa toda espécie molecular de origem biológica isolada ou constituída por uma célula, vírus, líquido biológico ou sintético que quando introduzida em um organismo, chamado de hospedeiro ou receptor, é capaz de produzir uma reação imune. Se o organismo for M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 4 imunocompetente, ele pode manifestar uma resposta imune ou uma tolerância Anticorpos Anticorpos ou imunoglobulinas são proteínas do sistema imune, sendo os principais atores na chamada resposta imune humoral, tendo como principal alvo, os patógenos extracelulares, como bactérias e protozoários, servindo como sinalização para os linfócitos Reação de aglutinação Quando um antígeno é particulado, a reação de um anticorpo com o antígeno pode ser detectado pela aglutinação (agrupamento) do antígeno. O termo geral aglutinina é usado para descrever anticorpos que aglutinam antígenos particulados. Quando o antígeno é um eritrócito é usado o termo hemaglutinação. Todos os anticorpos podem teoricamente aglutinar antígenos particulados mas IgM, devido à sua elevada valência, é particularmente uma boa aglutinina e se pode às vezes inferir que um anticorpo deve ser da classe IgM se for um bom anticorpo aglutinador. Teste qualitativo Testes de aglutinação podem ser usados de maneira qualitativa para investigar a presença de um antígeno ou um anticorpo. O anticorpo é misturado com o antígeno particulado e um teste positivo é indicado pela aglutinação do antígeno particulado Por exemplo, células vermelhas do sangue de um paciente podem ser misturadas com um anticorpo dirigido a um antígeno de grupo sanguíneo para determinar o tipo sanguíneo da pessoa. Em um segundo exemplo, o soro de um paciente é misturado com células vermelhas do sangue de um tipo sanguíneo conhecido para pesquisar pela presença de anticorpos para aquele tipo sanguíneo no soro do paciente. Teste quantitativo Testes de aglutinação podem também ser usados para medir o nível de anticorpos para antígenos particulados. Neste teste, é realizada uma diluição seriada de uma amostra a ser testada para anticorpos e a seguir é adicionado um número fixo de células vermelhas sanguíneas, bactérias ou outro antígeno particulado. Em seguida é determinada a diluição máxima que ainda permite aglutinação. A diluição máxima que ainda permite aglutinação visível é chamada de título. Os resultados são descritos como a recíproca entra a diluição máxima que ainda permite aglutinação visível. Efeito prozona Ocasionalmente é observado que quando a concentração do anticorpo é elevada (i.e. diluições menores) não há aglutinação, mas quando a amostra é posteriormente diluida ocorre a aglutinação. A ausência de aglutinação em altas concentrações de anticorpos é chamada de efeito prozona. A ausência de aglutinação no efeito prozona é devida ao excesso de anticorpos resultando em complexos muito pequenos que não se aglomeram para produzir aglutinação visível. Aplicações dos testes de aglutinação i. Determinação dos tipos sanguíneos ou de anticorpos para antígenos de grupos sanguíneos. ii. ii. Avaliar infecções bacterianas Ex. O aumento em título de um anticorpo dirigido a uma bactéria em particular indica uma infecção por aquele tipo bacteriano. N.B. um quadruplo em aumento do título é geralmente considerado como um aumento significante de título de anticorpos. Hemaglutinação passiva Os testes de aglutinação só funcionam com antígenos particulados. Entretanto, é possível se cobrir eritrócitos com um antígeno solúvel (ex. Antígeno viral, um polissacarídeo ou hapteno) e usar as células vermelhas sanguéneas cobertas em um teste de aglutinação com anticorpos para o antígeno solúvel. Issso é chamado de hemaglutinação passiva. O teste é realizado tal como o teste de aglutinação. As aplicações incluem a detecção de anticorpos para antígenos solúveis e detecção de anticorpos para antígenos virais. Sistema ABO – antígenos dos grupos sanguíneos ABO Os antígenos ABO são carboidratos ligados a proteínas e lipídeos da superfície celular, sintetizados por enzimas glicosiltransferases polimórficas, cuja atividade varia dependendo do alelo herdado Todos os indivíduos normais produzem um núcleo glicana comum ligado principalmente às proteínas da membrana plasmática. A maioria dos indivíduos possui uma fucosiltransferase que adiciona uma porção de fucose a um resíduo não terminal de açúcar do núcleo glicana, sendo que as glicanas fucosiladas são chamadas antígeno H. Um único gene no cromossomo 9 codifica a enzima glicosiltransferase que pode modificar adicionalmente o antígeno H. M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 5 Existem três variantes alélicas desse gene. O produto gênico do alelo O é desprovido de atividade enzimática. A enzima codificada pelo alelo A transfere uma porção N-acetilgalactosamina terminal para o antígeno H. E o produto gênico do alelo B transfere uma porção galactose terminal. Os indivíduos que são homozigotos para o alelo O não podem adicionar açúcares terminais ao antígeno H e expressam apenas o antígeno H. Em contraste, os indivíduos que possuem um alelo A (homozigoto AA, heterozigotos AO, ou heterozigotos AB) formam o antígeno A pela adição da N- acetilgalactosamina terminal em alguns dos seus antígenos H. Da mesma forma, os indivíduos que expressam um alelo B (homozigotos BB, heterozigotos BO, ou heterozigotos AB) formam o antígeno B pela adição da galactose terminal a alguns de seus antígenos H. Os heterozigotos AB formam tanto antígenos A quanto antígenos B a partir de alguns de seus antígenos H. A terminologia foi simplificada de maneira que os indivíduos OO são ditos do tipo sanguíneo O; os indivíduos AA e AO são do tipo sanguíneo A; os indivíduos BB e BO são do tipo sanguíneo B; e os indivíduos AB são do sanguíneo AB. As mutações no gene codificador da fucosiltransferase que produz o antígeno H são raras; indivíduos homozigotos para essa mutação são ditos do grupo sanguíneo Mumbai e não podem produzir antígenos H, A ou B nem podem receber sangue tipo O, A, B ou AB. Os indivíduos que expressam um antígeno particular dogrupo sanguíneo A ou B são tolerantes a esse antígeno, enquanto os indivíduos que não o expressam produzem anticorpos naturais que reconhecem o antígeno. Praticamente todos os indivíduos expressam o antígeno H e, portanto, são tolerantes a esse antígeno e não produzem anticorpos anti-H. Os indivíduos que expressam antígenos A ou B são tolerantes a essas moléculas e não produzem anticorpos anti-A e anti-B respectivamente. Entretanto, os indivíduos dos grupos sanguíneos O e A produzem anticorpos IgM anti-B, e os indivíduos dos grupos sanguíneos O e B produzem anticorpos IgM anti-A. Os raros indivíduos incapazes de produzir antígenos do núcleo H produzem anticorpos contra os antígenos H, A, e B. Na transfusão clínica, a escolha dos doadores de sangue para um receptor em particular é baseada na expressão de antígenos dos grupos sanguíneos e nas respostas de anticorpos contra eles. Se um paciente recebe uma transfusão de hemácias de um doador que expressa o antígeno não expresso em suas próprias hemácias, uma reação transfusional pode ocorrer (descrita anteriormente). Acontece que os indivíduos AB podem tolerar transfusões de todos os potenciais doadores e são, portanto, chamados receptores universais; da mesma forma, os indivíduos O podem tolerar transfusões apenas de doadores O, mas podem fornecer sangue para todos os receptores e, assim, são chamados doadores universais. Em geral, as diferenças nos grupos sanguíneos secundários levam à lise de hemácias somente depois de repetidas transfusões desencadearem uma resposta secundária de anticorpos. Os antígenos dos grupos sanguíneos A e B são expressos em muitos outros tipos celulares além das células sanguíneas, incluindo células endoteliais. Por essa razão, a tipagem ABO é crucial para evitar a rejeição hiperaguda de certos aloenxertos de órgãos sólidos A incompatibilidade ABO entre a mãe e o feto geralmente não causa problemas para o feto porque a maior parte dos anticorpos anticarboidratos são IgM e não atravessam a placenta. Sistema Rh – antígeno Rhesus Os antígenos Rh são proteínas de superfície celular não glicosiladas e hidrofóbicas, encontradas nas membranas das hemácias e estão estruturalmente relacionadas a outras glicoproteínas com funções transportadoras nessas membranas. As proteínas Rh são codificadas por dois genes fortemente ligados e altamente homólogos, mas apenas um deles, chamado RhD, é comumente considerado na tipagem sanguínea clínica. Isso ocorre porque até 15% da população tem uma deleção ou outra alteração do alelo RhD. Todos M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 6 os indivíduos que não expressam o antígeno D são necessariamente classificados como Rh(D) negativo Essas pessoas, chamadas Rh negativas, não são tolerantes ao antígeno RhD e produzirão anticorpos para o antígeno se forem expostas a células sanguíneas Rh-positivas. O principal significado clínico dos anticorpos anti-Rh está relacionado às reações hemolíticas nos fetos em desenvolvimento, as quais são semelhantes às reações de transfusão. Mães Rh negativas gestando um feto Rh positivo podem ser sensibilizadas por hemácias fetais que entram na circulação materna, geralmente durante o parto. Uma vez que o antígeno Rh é uma proteína, ao contrário dos antígenos carboidratos ABO, anticorpos IgG de alta afinidade, que passaram por troca de classe, específicos para Rh são gerados em mães Rh negativas. As gestações subsequentes nas quais o feto é Rh positivo estão em risco, pois os anticorpos IgG anti-Rh maternos podem atravessar a placenta e mediar a destruição das hemácias fetais. Isso causa a eritroblastose fetal (doença hemolítica do recém-nascido) e pode ser letal para o feto. Eritroblastose fetal Eritroblastose fetal é uma anemia hemolítica fetal (ou neonatal, como eritroblastose neonatal) causada pela transmissão transplacentária de anticorpos maternos direcionados às hemácias fetais. O distúrbio costuma resultar de incompatibilidade entre os grupos sanguíneos materno e fetal, geralmente os antígenos Rho(D) A eritroblastose fetal resulta classicamente da incompatibilidade aos antígenos Rho(D), que pode se desenvolver quando uma mulher com tipo sanguíneo Rh negativo engravida de um homem Rh positivo e concebe um feto com sangue também Rh positivo, às vezes resultando em hemólise. Essa doença pode ser prevenida pela administração de anticorpos anti-RhD para a mãe dentro de 72 horas após o nascimento do primeiro bebê Rh positivo. O tratamento previne que as hemácias Rh positivas do bebê que entraram na circulação materna induzam a produção de anticorpos anti-Rh na mãe. Os mecanismos de ação exatos dos anticorpos administrados não são claros, mas devem incluir a remoção fagocítica ou a lise das hemácias do bebê mediada pelo complemento antes que possam desencadear uma resposta de anticorpos maternos, ou ainda a inibição por feedback dependente do receptor Fc das células B RhD-específicas da mãe Teste Coombs Aplicações Entre estas se incluem a detecção de anticorpos (Rh) anti-fator Rhesus. Anticorpos contra o fator Rh geralmente não aglutinam células vermelhas sanguíneas. Portanto, células vermelhas de crianças Rh+ nascidas de mães Rh-, que têm anticorpos anti- Rh, devem estar cobertas por esses anticorpos. Para verificar isso, é realizado um teste de Coombs direto. Para ver se a mãe tem anticorpos anti-Rh no seu soro se realiza um teste de Coombs Indireto. Teste de Coombs direto Quando anticorpos se ligam a eritrócitos, eles nem sempre resultam em aglutinação. Isso pode se dever à relação antígeno/anticorpo, em que o antígeno em excesso, o anticorpo em excesso ou em alguns casos cargas elétricas nas células vermelhas sanguíneas prejudicam a eficiência da ligação cruzada entra as células. Esses anticorpos que ligam, mas não causam aglutinação das células vermelhas sanguíneas são às vezes referidos como anticorpos incompletos. Isso não quer dizer de forma nenhuma que os anticorpos sejam diferentes em sua estrutura, embora isso seja o que se pensava que fosse o caso. Pelo contrário, esta é uma definição apenas funcional. Para detectar a presença de anticorpos não-aglutinadores nas células vermelhas sanguíneas, simplesmente se adiciona um segundo anticorpo diretamente contra a imunoglobulina (anticorpo) que cobre as células vermelhas. Esta anti-imunoglobulina pode agora fazer reação cruzada com as células vermelhas sanguíneas e levar à aglutinação. Direto avalia as células sanguíneas do sangue se tem anticorpos ligados às hemácias (no RN) - Resultados: > teste negativo – ausência de anticorpos que prova a destruição das hemácias > teste positivo – presença de anticorpos Teste de Coombs indireto Se for necessário saber se uma amostra de soro tem anticorpos dirigidos contra uma célula vermelha sanguínea em particular e você quer se assegurar de que também vai detectar anticorpos não-aglutinadores M e d ic in a U N IC ID T X X IX Práticas Funcionais- M1- Tipagem Sanguínea Práticas F.- Módulo 1- 3ª Etapa Rodrigo Barbosa Guerra 7 potenciais na amostra, é realizado um teste de Coombs Indireto. Este teste é feito incubando as células vermelhas sanguíneas com a amostra de soro, lavando- se para retirar quaisquer anticorpos não ligados e depois adicionando um segundo reagente anti- imunoglobulina para fazer ligação cruzada com as células. Indireto avalia se no plasma há anticorpos existentes (na mãe) - Resultados: > teste positivo – presença de anticorpos > teste negativo – ausência de anticorpos Em caso de aglutinação, significa que o indivíduo testado é Rh+, e no caso de ser Rh-, significa que está sensibilizado, ao ser exposto a um sangue Rh+
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