slides 15 04

Prévia do material em texto

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
SEPARAÇÃO EM FASE REVERSA REALIZADA EM MODO GRADIENTE DE ELUIÇÃO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
VELOCIDADE DA FASE MÓVEL
VAZÃO VOLUMÉTRICA vs. VAZÃO LINEAR
VOLUME DE SOLVENTE QUE
PERCORRE A COLUNA POR UNIDADE
DE TEMPO
(mL/min)
DISTÂNCIA PERCORRIDA
PELO SOLVENTE POR
UNIDADE DE TEMPO
(cm/min)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
VELOCIDADE DA FASE MÓVEL
VAZÃO VOLUMÉTRICA vs. VAZÃO LINEAR
EXEMPLO. EXPERIMENTO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
d (diâmetro interno) = 0,6 cm 
r = 0,3 cm
SE FASE MÓVEL OCUPA 20% DO VOLUME DA COLUNA:
V = 0,0565 mL
CADA cm DO COMPRIMENTO DA COLUNA:
V = π x r2 x 1 cm = 0,283 mL
coluna
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
VELOCIDADE DA FASE MÓVEL
VAZÃO VOLUMÉTRICA vs. VAZÃO LINEAR
EXEMPLO. EXPERIMENTO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
d = 0,6 cm 
r = 0,3 cm
coluna
VAZÃO LINEAR: QUANTOS cm DA COLUNA SÃO PERCORRIDOS
PELO SOLVENTE EM 1 min
VAZÃO VOLUMÉTRICA: POR EXEMPLO, 0,3 mL/min
1 cm DA COLUNA = 0,0565 mL DE FASE MÓVEL
0,3 mL DEVEM OCUPAR: 0,3 mL/0,565 mL.cm-1 = 5,3 cm
PORTANTO, VAZÃO LINEAR = 5,3 cm/min
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
TIPOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
M
as
sa
 m
o
le
cu
la
r
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
TIPOS DE SEPARAÇÃO
O SOLUTO É RETIDO PELA SUPERFÍCIE
DA FASE ESTACIONÁRIA ATRAVÉS DE
INTERAÇÕES QUÍMICAS OU FÍSICAS
O SOLUTO SE DISSOLVE NA PARTE LÍQUIDA QUE
ENVOLVE A SUPERFÍCIE DO SUPORTE SÓLIDO
ADSORÇÃO PARTIÇÃO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Grupos 
silanol
isolados
Pontes de etileno
Resiste a hidrólise até pH 12
SUPERFÍCIE DE SÍLICA CONTÉM 8 µmol/m2 DE GRUPOS
SILANÓIS (Si-OH), QUE EM pH 2-3 ESTÃO PROTONADOS.
EM pH ˃ 3 ENCONTRAM-SE NA FORMA Si-O-.
ESTES GRUPOS RETÊM BASES PROTONADAS (R-NH3
+) 
E PROVOCAM A FORMAÇÃO DE CAUDA
Caráter 
ácido
Caráter 
não ácido
NAS PARTÍCULAS MICROPOROSAS MAIS 99% DA ÁREA SUPERFICIAL ESTÁ 
LOCALIZADA NO INTERIOR DOS POROS
hidrolisa em pH ≤ 2
Sílica dissolve em solução básica (pH ˃ 8)
CURVA DE van DEEMTER
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
HIDROCARBONETOS SATURADOS < HIDROCARBONETOS INSATURADOS < COMPOSTOS HALOGENADOS/AROMÁTICOS < SULFETOS 
< ÉTERES < NITROCOMPOSTOS < ÉSTERES/CETONAS/ALDEÍDOS < ÁLCOOIS/AMINAS < SULFONAS < AMIDAS < ÁCIDOS CARBOXÍLICOS
A FORÇA DE ADSORÇÃO (valor de k) AUMENTA NA SEGUINTE ORDEM:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
ALUMINA
SILICATO DE MAGNÉSIO
CARBONO GRAFITICO POROSO
TITÂNIA
CARACTERISTICAS BÁSICAS (TROCADOR CATIÔNICO FRACO), MAS PODE APRESENTAR CARATER ÁCIDO E NEUTRO. É ESTÁVEL NO 
INTERVALO DE pH 1 - 12. NÃO DEVE SER AQUECIDO ACIMA DE 150°C. É POSSÍVEL REALIZAR DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA.
DEVE SER UTILIZADO COM CRITÉRIO COM COMPOSTOS AROMÁTICOS, AMINAS, ÉSTERES, POIS PODEM SOFRER FORTE ADSORÇÃO
PARTÍCULAS ESFÉRICAS POROSAS QUE SÃO UTILIZADAS EM CROMATOGRAFIA DE MODO NORMAL OU REVERSO. A SUA SUPERFÍCIE É 
CRISTALINA. É ESTÁVEL EM MEIO ÁCIDO OU BÁSICO. É RECOMENDADO NA SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS DE ALTA POLARIDADE, 
IONIZÁVEIS E DE ESTEREOISÔMEROS. 
ZIRCÔNIA
APRESENTA CRISTAIS DE TiO2 E É ESTÁVEL EM pH ELEVADO. PODE SER UTILIZADO EM CROMATOGRAFIA DE MODO NORMAL OU REVERSO 
ZrO2 É SIMILAR A TITÂNIA MAS PODE INTERAGIR COM OS ANALITOS COMO TROCADOR DE ÍONS (ÁCIDO DE LEWIS). DERIVATIZAÇÃO 
QUÍMICA É POSSÍVEL. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
ESTABILIDADE QUÍMICA SUPERIOR EM RELAÇÃO AO SUPORTE CONVENCIONAL
FAIXA DE pH MAIS AMPLA
USO EM TEMPERATURAS SUPERIORES À 60 °C
BAIXA ATIVIDADE DOS GRUPOS SILANÓIS RESIDUAIS NAS FASES À BASE DE SÍLICA
HÍBRIDA
EM RELAÇÃO A SÍLICA PURA, OS GRUPOS HIDROFÓBICOS CONFEREM:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CAPEAMENTO DE PARTÍCULA DA SÍLICA – AGENTE SILANIZANTE TRIMETILCLOROSILANO
PERFIL DA BANDA CROMATOGRÁFICA: A) SÍLICA CAPEADA; B) SÍLICA NÃO CAPEADA
A B
CAPEAMENTO
OU GRUPO
POLAR
INTERAÇÕES ENTRE DIFERENTES FASES QUIMICAMENTE LIGADAS E COMPOSTOS
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
SILICA NÃO LIGADA
-(CH2)3-CN
-(CH2)3-O-CH2-CHOH-CH2OH
-(CH2)3-NH2
COLUNA CIANO
COLUNA DIOL
COLUNA AMINO
HILIC INTERAÇÃO HIDROFÍLICA
PARTÍCULAS DE SÍLICA TIPO B
PARTÍCULAS DE SÍLICA TIPO A
CROMATOGRAFIA DE FASE QUIMICAMENTE LIGADA
≡ 𝐒𝐢 − 𝐎𝐇
GRUPOS SILANÓIS SÃO FORTES 
DOADORES DE PRÓTONS
GRUPOS ACEPTORES DE LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO QUE 
TENHAM ELÉTRONS LIVRES OU MOMENTO DIPOLAR
log [NB10
n
B
(ε0
B
- ε0
A
) + 1 - NB]
ε = ε0A + 
nB
SELETIVIDADE (Força do solvente)
ALTERAÇÃO NA RETENÇÃO RELATIVA DEVIDO A
VARIAÇÃO DA %B EM AMOSTRAS QUE CONTÊM
COMPOSTOS COM GRUPOS POLARES DIFERENTES, BEM
COMO O NÚMEO DESTES GRUPOS POLARES NO
COMPOSTO
ALTERANDO O TIPO DE SOLVENTE E MANTENDO A 
MESMA FORÇA (ε)
Solventes localizantes
nitrometano
acetonitrila
acetona
acetato de etila
dimetilsulfóxido
trietilamina
tetrahidrofurano
éter etílico
Piridina
MTBE
Solventes não 
básicos ou dipolares
Solventes básicos
não localizantes
diclorometano
SÍLICA ˃˃ AMINO ˃ DIOL ˃ CIANO
SELETIVIDADE DA FASE ESTACIONÁRIA POLAR
CADEIA CARBÔNICA FLEXÍVEL
FORÇA DE 
ELUIÇÃO 
DA FASE 
MÓVEL
N: fração molar do solvente B
n: área do solvente B
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
-(CH2)3-CN
-(CH2)3-O-CH2-CHOH-CH2OH
-(CH2)3-NH2
COLUNA CIANO
COLUNA DIOL
COLUNA AMINO
HILIC INTERAÇÃO HIDROFÍLICA
CROMATOGRAFIA DE FASE QUIMICAMENTE LIGADA
GRUPOS OH (FORMAÇÃO DE LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO) TORNAM SIMILAR A COLUNA DE SILICA
MENOR POLARIDADE E VALORES DE k MENORES COM A MESMA FASE MÓVEL EM COMPARAÇÃO 
A COLUNA DE SILICA. USO EM FASE REVERSA, MENOS RETENTIVA DO QUE C8 E C18 . SELETIVA EM 
RELAÇÃO A ESTRUTURAS COM DUPLAS LIGAÇÕES
ANÁLISE DE AÇÚCARES E GLICOSÍDEOS. ATUA COM DOADOR E RECEPTOR DE PRÓTONS EM 
LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO. O GRUPO NH2 PODE SER OXIDADO, EVITAR PERÓXIDOS (ÉTER 
DIETÍLICO OU TETRAHIDROFURANO). CETONAS E ALDEÍDOS REGEM E FORMAM BASE DE SCHIFF. 
O GRUPO AMINO ATUA COMO UM FRACO TROCADOR ANIÔNICO (RNH3
+) EM SOLUÇÃO AQUOSA 
ÁCIDA. ASSIM, EM FASE AQUOSA A RETENÇÃO É FUNÇÃO DO pH.
ANÁLISE DE COMPOSTOS DE ALTA POLARIDADE. COMPONENTE DO ELUENTE FORTE: ÁGUA, 
SOLUÇÃO AQUOSA TAMPONADA OU ÁLCOOL. ACETONITRILA É UM ELUENTE FRACO, CUJO 
CONTEÚDO DECRESCE EM ANÁLISE EM MODO GRADIENTE. ANALITOS NÃO POLARES ELUEM 
PRIMEIRO NESTE MODO DE ANÁLISE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Y(m) + M(S) Y(S) + M(m)
EXEMPLOS HIPOTÉTICO 
DE RETENÇÃO DE 
SOLUTOS 
CLOROBENZENO (a, b 
não localizado) E FENOL 
(c, d localizado) EM 
SÍLICA. FASE MÓVEL EM 
(a, b) É UM SOLVENTE 
MENOS POLAR; A FASE 
MÓVEL EM (c, d) É MAIS 
POLAR. 
Y(m) + 2M(S) Y(S) + 2M(m)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
FATORES QUE CONTRIBUEM PARA A SELETIVIDADE DOS ISÔMEROS EM COLUNA DE
FASE NORMAL EM RELAÇÃO A SÍLICA. (a, b) IMPEDIMENTO ESTÉRICO; (c, d) DOAÇÃO DE
ELÉTRONS; (e, f) POSIÇÃO RELATIVA DE GRUPOS DENTRO DA MOLÉCULA; (g) LIGAÇÃO
DE HIDROGÊNIO INTRAMOLECULAR DE 2 GRUPOS POLARES
A
 S
EP
A
R
A
Ç
Ã
O
 D
E 
IS
Ô
M
ER
O
S 
É 
M
EN
O
S 
P
R
O
N
U
N
C
IA
D
A
 E
M
 C
O
LU
N
A
 D
E 
FA
SE
 N
O
R
M
A
L 
C
O
M
P
A
R
A
T
IV
A
M
EN
T
E 
A
 C
O
LU
N
A
 D
E 
SÍ
LI
C
A
PROBLEMAS NO USO DA CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
BAIXA REPRODUTIBILIDADE NA SEPARAÇÃO
LENTO REEQUILÍBRIO DA COLUNA APÓS MUDANÇA DE 
FASE MÓVEL
DIVISÃO DE PICO
ALTERAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL NA 
ANÁLISE
CONTEÚDO DE ÁGUA DESATIVAÇÃO DA SÍLICA
CONTEÚDO DE ÁGUA
COLUNA COM PARTÍCULA DE SÍLICA TIPO B MINIMIZA A INTERAÇÃO
ELUIÇÃO DA FASE MÓVEL EM MODO GRADIENTE NÃO DEVE SER UTILIZADO EM COLUNA COM FASE 
ESTACIONÁRIA DE SÍLICA
ADIÇÃO DE METANOL OU PROPANOL NA FASE MÓVEL PARA CONTROLAR A VARIAÇÃO DO CONTEÚDO DE 
ÁGUA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
A RETENÇÃO DECRESCE NA SEGUINTE ORDEM: HIDROCARBONETOS ALIFÁTICOS ˃ DIPOLOS INDUZIDOS (CCl4) ˃ DIPOLOS 
PERMANENTES (CHCl3) ˃ BASES FRACAS DE LEWIS (ÉTERES, ALDEÍDOS, CETONAS) ˃ BASES FORTES DE LEWIS (AMINAS) 
˃ ÁCIDOS FRACOS DE LEWIS (ÁLCOOIS, FENÓIS) ˃ ÁCIDOS FORTES DE LEWIS (ÁCIDOS CARBOXÍLICOS)
RETENÇÃO AUMENTA COM O AUMENTO DO NÚMERO DE ÁTOMOS DE CARBONO
COMPOSTOS COM CADEIAS RAMIFICADAS SÃO ELUÍDOS MAIS RAPIDAMENTE DO QUE COMPOSTOS COM CADEIRAS RETAS
RETENÇÃO AUMENTA COM O AUMENTO DA ÁREA DE CONTATO ENTRE A MOLÉCULA DA AMOSTRA E A FASE ESTACIONÁRIA
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
MECANISMOS DE RETENÇÃO EMCROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
EFEITO DO COMPRIMENTO DA CADEIA CARBÔNICA 
SOBRE A RETENÇÃO DOS COMPOSTOS
EFEITO DO TIPO DA PARTÍCULA DE SÍLICA DO SUPORTE DE 
UMA FASE QUIMICAMENTE LIGADA (C18) SOBRE A 
RETENÇÃO DOS COMPOSTOS
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PARTÍCULAS SUPERFICIALMENTE POROSAS
CORTECS C18 (NÚCLEO SÓLIDO, 1,6 µm)
PARTÍCULAS POROSAS
BEH C18 (PARTÍCULA HÍBRIDA, ponte de
etileno)
CSH C18 (PARTÍCULA HÍBRIDA,
superfície com carga)
HSS T3 (PARTÍCULA DE SÍLICA DE ALTA
PUREZA)
FA
SE
 M
Ó
V
EL
 C
O
M
 M
ET
A
N
O
L
FA
SE
 M
Ó
V
EL
 C
O
M
 A
C
ET
O
N
IT
R
IL
A
1
2
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PARA SEPARAÇÃO DE ESPÉCIES NÃO IÔNICAS
ALTERAÇÃO DA FORÇA DO SOLVENTE (%B)
TEMPERATURA
TIPO DE SOLVENTE (p ex. ACETONITRILA ou METANOL)
TIPO DE COLUNA (p ex. C18 ou CIANO)
SELETIVIDADE
CROMATOGRAFIA EM FASE REVERSA NÃO AQUOSA
ADEQUADA PARA ANALITOS MUITO HIDROFÓBICOS QUE NÃO ELUEM MESMO COM 100% DE ACETONITRILA
p ex. LIPÍDIOS, POLÍMEROS SINTÉTICOS etc
SOLVENTE A (+ POLAR): ACETONITRLA, METANOL
SOLVENTE B (- POLAR): TETRAIDROFURANO, CLOROFÓRMIO, DICLOROMETANO, MTBE etc
CONDICIONAR A COLUNA COM ACETONITRILA ou METANOL ANTES DE BOMBEAR ESTA FASE 
MÓVEL (POR 30 min) PARA QUE NÃO TENHA PRESENÇA DE ÁGUA NO SISTEMA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
QUAIS OS PRINCIPAIS PARÂMETROS A SEREM CONSIDERADOS DURANTE A FASE DE ESCOLHA DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA PARA ENSAIOS POR (U)HPLC?
É PRECISO PENSAR NA QUESTÃO DA PRESSÃO QUE SEU SISTEMA SUPORTA. SE VOCÊ TEM UM UHPLC (BOMBAS QUE SUPORTAM PRESSÃO DE MAIS DE 1.000 bar), VOCÊ PODE UTILIZAR QUALQUER
COLUNA DE HPLC CLÁSSICA, MAS PARA CONSEGUIR O MELHOR DESEMPENHO DO SEU SISTEMA, OPTE POR COLUNAS DE UHPLC COM PARTÍCULAS SUB 2 mm. SE VOCÊ POSSUI UM SISTEMA HPLC
CONVENCIONAL, POR CONTA DAS ALTAS PRESSÕES GERADAS POR COLUNAS DE PARTÍCULAS MENORES, VOCÊ NÃO PODERÁ OPTAR PELA OPÇÃO LISTADA ACIMA, FICANDO RESTRITO AO USO DE
COLUNAS DE HPLC CLÁSSICAS.
UMA VEZ DEFINIDO SE É POSSÍVEL OU NÃO SE TRABALHAR EM ALTA PRESSÃO, OS PRINCIPAIS PARÂMETROS PARA ESCOLHER A MELHOR COLUNA PARA UM ENSAIO POR (U)HPLC, SÃO:
COMPRIMENTO DA COLUNA
DIÂMETRO DA COLUNA
FASES DA COLUNA (REVERSA OU NORMAL)
ENCHIMENTO DA COLUNA
TAMANHO DA PARTÍCULA
TAMANHO DOS POROS
COMPRIMENTO DA COLUNA
O COMPRIMENTO DE UMA COLUNA DE HPLC OU UHPLC INFLUENCIA DIRETAMENTE OS SEGUINTES PARÂMETROS: VOLUME MORTO, TEMPO DE CORRIDA E VOLUME DE SOLVENTES
(FASE MÓVEL).
NOS DIAS ATUAIS, HÁ UMA PREFERÊNCIA POR SE TRABALHAR COM COLUNAS MENORES (50, 75 OU 100 mm DE COMPRIMENTO), PARA SE OBTER UMA MAIOR RESOLUÇÃO DE
PICOS CROMATOGRÁFICOS E REDUZIR O TEMPO DE CORRIDA DAS ANÁLISES, AUMENTANDO A PRODUTIVIDADE ANALÍTICA E A QUALIDADE DOS RESULTADOS.
DIÂMETRO DA COLUNA
PARA A ESCOLHA DO DIÂMETRO INTERNO DA COLUNA TEM-SE PREFERIDO TRABALHAR COM TAMANHOS MENORES, DE 3,0 mm OU 2,1 mm, AO CLÁSSICO DE 4,6 mm, POIS REDUZ 
O USO DE SOLVENTE E TORNA SUA CORRIDA MAIS RÁPIDA E É COMPATÍVEL COM ACOPLAMENTO COM A TÉCNICA DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
FASES DA COLUNA
EM COLUNAS DE FASE NORMAL OS COMPOSTOS APOLARES ELUIRÃO PRIMEIRO QUE OS COMPOSTOS POLARES, JÁ EM COLUNAS DE FASE REVERSA OS COMPOSTOS POLARES
ELUIRÃO PRIMEIRO QUE OS COMPOSTOS APOLARES.
AS COLUNAS DE FASE REVERSA SÃO AS COLUNAS MAIS UTILIZADAS PELOS LABORATÓRIOS EM GERAL, POR APRESENTAREM DIVERSAS VANTAGENS EM RELAÇÃO ÀS COLUNAS DE
FASE NORMAL, COMO POR EXEMPLO: TRABALHAR NA FAIXA DE pH DE 2 A 8, PERMITIR O USO DE ÁGUA COMO FASE MÓVEL etc.
ENCHIMENTO DA COLUNA
O PRIMEIRO PASSO AO ESCOLHER O RECHEIO DA COLUNA É OLHAR PARA SEU COMPOSTO-ALVO, SUA ESTRUTURA E SEUS GRUPOS FUNCIONAIS.
O MATERIAL MAIS UTILIZADO COMO BASE PARA AS COLUNAS CROMATOGRÁFICAS É A SÍLICA. ALGUMAS PROPRIEDADES JUSTIFICAM SUA UTILIZAÇÃO, COMO: A PUREZA, AUSÊNCIA
DE ÍONS METÁLICOS, FORMATO DAS PARTÍCULAS, ESFÉRICO OU IRREGULAR, TAMANHO DAS PARTÍCULAS E SUA DISTRIBUIÇÃO. TEMOS DOIS TIPOS DE SÍLICA, TIPO A E TIPO B, A
SÍLICA DO TIPO B É MENOS ÁCIDA E POR ISSO RESULTAM EM PICOS COM MENOS CAUDA QUANDO SEU ANALITO É POLAR OU IONIZÁVEL.
AS COLUNAS C18, FORNECEM BOM FORMATO DE PICO E O INTERVALO DE pH QUE ELA SUPORTA É BEM AMPLO (pH 2 A 8). ESTA FASE PODE SER USADA COM SISTEMAS DE 100% DE
FASE AQUOSA E SÃO MELHORES NA RETENÇÃO DE ANALITOS POLARES.
SE OS SOLUTOS DE INTERESSE NÃO FOREM BEM RESOLVIDOS COM A COLUNA C18 PODE-SE TENTAR AS COLUNAS CN E AS DE FENIL, QUE PODEM DAS DIFERENÇAS SIGNIFICATIVAS
NA SELETIVIDADE DAS FASES ALQUILA DE CADEIA RETA PARA AFETAR A SEPARAÇÃO.
AS FASES COM CN INTERAGEM MUITO BEM COM SOLUTOS BÁSICOS QUE CONTENHA NITROGÊNIO E HALOGÊNIOS. A RETENÇÃO É GOVERNADA PELA HIDROFOBICIDADE E
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO.
AS FASES DE FENIL INTERAGEM FORTEMENTE COM ANALITOS QUE CONTENHAM SISTEMAS DE ELÉTRONS π (AROMÁTICOS E INSATURADOS).
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
TAMANHO DAS PARTÍCULAS DE ENCHIMENTO
TAMANHOS MENORES DE PARTÍCULAS TRAZEM MAIOR EFICIÊNCIA; NO ENTANTO, ISSO GERALMENTE OCORRE À CUSTA DE UM AUMENTO NA PRESSÃO DO SISTEMA. AS PARTÍCULAS
MAIS AMPLAMENTE UTILIZADAS PARA SISTEMAS HPLC TÊM 5 µm DE DIÂMETRO E PROPORCIONAM EFICIÊNCIAS MUITO RAZOÁVEIS QUANDO UTILIZADAS COM OS SISTEMAS
TRADICIONAIS DE HPLC. OUTRAS PARTÍCULAS COM DIÂMETROS COMO 3,0 µm OU 3,5 µm FORNECEM RESOLUÇÃO MAIS ALTA E TEMPOS DE ANÁLISE MAIS CURTOS, MAS CUIDADO
COM AUMENTOS NA PRESSÃO DE RETORNO DO SISTEMA E TAMBÉM NOTE QUE O TAMANHO DA PARTÍCULA TAMBÉM REDUZ A POROSIDADE DA “FRIT” DE RETENÇÃO.
TAMANHO DOS POROS DAS PARTÍCULAS DE ENCHIMENTO
O TAMANHO DOS POROS DESCREVE O DIÂMETRO MÉDIO DOS POROS NA SUPERFÍCIE DO MATERIAL EMPACOTADO. POROS DE 6–12 nm SÃO USADOS COM ANALITOS COM MASSA
MOLECULAR ABAIXO DE 2000 Da E POROS DE 30 nm SÃO USADOS PARA ANALITOS ACIMA DE 4000 Da. PARA O INTERVALO DE 2000–4000 É PRECISO EXPERIMENTAR PARA VER QUAL
TAMANHO DE PORO RESULTA EM MELHOR RETENÇÃO E EFICIÊNCIA.
COLUNAS DE POROS MAIORES TENDEM A SER MAIS “CARREGÁVEIS”, ISTO É MAIS MASSA DE ANALITO PODE SER APLICADA ANTES QUE A DETERIORAÇÃO DA FORMA DE PICO
(ASSIMETRIA) SE TORNE UM PROBLEMA.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
FASES QUIMICAMENTE LIGADAS COM DIFERENTES SELETIVIDADES
TAMANHOS DE PARTÍCULA DA FASE ESTACIONÁRIA DE ACORDO 
COM O SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PEAK BROADENING OCCURS DUE TO CONTRIBUTIONS FROM THE INTRA-COLUMN VOLUME 
AND EXTRA-COLUMN VOLUME –
INJECTOR MECHANISM
DETECTOR FLOW CELL
CONNECTION TUBING BETWEEN INJECTOR AND COLUMN
CONNECTION TUBING BETWEEN COLUMN AND DETECTOR FLOW CELL
THE SMALLER THE INTRA-COLUMN VOLUME, THE HIGHER THE CONTRIBUTION FROM EXTRA-
COLUMN VOLUME
GOOD UHPLC PERFORMANCE DEMANDS THAT WE MINIMIZE THE SYSTEM VOLUME BY USING
MINIMUM TUBING IDS AND THE SHORTEST LENGTHS.
CONTRIBUIÇÕES DO SISTEMA E DA COLUNA PARA O PROCESSO DE ALARGAMENTO DA BANDA CROMATOGRÁFICA
HPLC UHPLC