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Instituto de Ciências Biomédicas/USP 1. Definição de conceitos 2. Afinal...o que é Biorremediação ? 3. A importância da Biodiversidade 4. Etapas da análise do problema ambiental a ser solucionado 5. Vantagens da Biorremediação 6. Tipos de Biorremediação: Bioestimulação e Bioaumentação 7. A Biorremediação poder ser empregada para remediar o quê? 8. Biorremediação de moléculas orgânicas: lixo, resíduo, rejeito 8.1. Biorremediação de petróleo e de hidrocarbonetos 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: conceitos e exemplos 8.3. Plásticos derivados de petróleo x Bioplásticos Biodegradáveis 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos: 9.1. Precipitação 9.2. Adsorção 9.3. Absorção 10. Questões • Biorremediação Elisabete José Vicente (USP) (11) 3091-7202 bevicent@usp.br Biorremediação 1. Definição de conceitos Biorremediação 1. Definição de conceitos Então,.. vamos lá. O conceito Biorremediação deve ser entendido como: Processo no qual organismos vivos, mortos ou suas partes, são empregados para remover ou reduzir (remediar) poluentes presentes no ambiente. Ou, ainda: A Biorremediação pode ser definida como qualquer processo que usa: - Microrganismos (bactérias, fungos, microalgas), - Plantas (fitorremediação), - Algas (macroalgas ou microalgas), - Suas enzimas ou Suas partes; para fazer com que o ambiente contaminado retorne à sua condição original. Biorremediação Em outras palavras: Biorremediação consiste na utilização de seres vivos ou de seus componentes na recuperação de áreas contaminadas. Geralmente são processos que empregam microrganismos ou suas enzimas para degradar compostos poluentes. 2. Afinal, o que é Biorremediação ? http://pt.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo http://pt.wikipedia.org/wiki/Microrganismo http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima Pois é,.... Considere AINDA que o Brasil tem uma ENORME Biodiversidade Você sabia que há uma imensa quantidade de microrganismos ao nosso redor no ambiente ? Biorremediação Há à nossa disposição um SUPER laboratório natural, de onde podemos selecionar VALIOSOS Isolados microbianos com capacidade de realizar a Biorremediação desejada. = 3. A importância da Biodiversidade Avaliação da natureza da contaminação presente em: água, solo, sedimento Caracterização: - qualitativa - quantitativa - distribuição no ambiente (extensão da contaminação) Planejamento do tipo de Remediação a ser aplicado: - Processos clássicos Físico-químicos (veja seguinte) - Biorremediação, - Ambos em conjunto. 4. Etapas da análise do Problema Ambiental a ser solucionado ATENÇÃO: Todo trabalho d e remediação ambiental tem que ser monitorado até que seja atingido níveis de poluente abaixo daquele permitido pelo órgão ambient al gestor no Estado. No caso de São Paulo, a Cetesb (Compa nhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental) obriga o monit oramento contínuo por mais de do is anos, para garantir o sucesso do processo. A Biorremediação é uma das técnicas mais adequadas para se empregar para realizar a Remediação de áreas contaminadas, pois, relativamente aos Processos Clássicos de Remediação ambiental: - Tem custo relativamente baixo, - É baseada em processos naturais, - Gera menos resíduos; - Promove a redução dos poluentes a níveis muito mais baixos. 5. Vantagens da Biorremediação Pois é,.... Consider e AINDA que o Brasil tem uma ENO RME Biodivers idade Processos clássicos empregados para a remediação ambiental São processos Físico-químicos tais como: - Precipitação, - Filtragem, - Decantação - Flotação, - etc. 1. Bioestimulação 2. Bioaumentação Criar condições para o aumento de populações autóctones degradadoras do poluente Introduzir microrganismos degradadores do poluente Autócnones: isolamento e seleção de microrganismos a partir de amostras do próprio ambiente a ser tratado Alóctones: seleção de microrganismos a partir de amostras de coleções de cultura ou de outro ambiente OGMS: introdução de microrganismos geneticamente modificados - Ambos (Bioestimulação + Bioaumentação) podem ser empregados - Monitoramento do Processo - Realização de ajustes Gaylarde et al., 2005 6. Tipos de Biorremediação Moléculas orgânicasBiorremediação: 2. Bioaumentação in situ (no próprio local) Pode ser ex situ (em outro local) 7. A Biorremediação poder ser empregada para Remediar o quê? Moléculas orgânicas Metais tóxicos Melhoramento microbiano para degradação de elementos tóxicos Melhoramento microbiano para imobilização Manipulação de vias metabólicas Complexos intracelulares Superfície Precipitação ...e também 8. Biorremediação de moléculas orgânicas: - De ambientes contaminados com compostos orgânicos, - Derivados de petróleo Os poluentes orgânicos, ao contrário dos poluentes inorgânicos, podem ser completamente degradados por microrganismos, eventualmente à CO2 água. Isto é válido para: - Petróleo derramado; - Águas com rejeitos domésBcos; - Rejeitos domésBcos sólidos; - Herbicidas, fungicidas; - Dejetos da agroindústria; - Rejeitos da indústria química, como de papel e celulose; - Rejeitos da indústria têxBl; - Rejeitos da indústria alimenMcia; - Vários outros rejeitos contendo poluentes orgânicos. O rejeito é um 'po específico de resíduo, onde quando todas as possibilidades de reaproveitamento ou reciclagem já 8verem sido esgotadas e não houver solução final para o item ou parte dele e, portanto, as únicas des8nações plausíveis são encaminhá-lo para um aterro sanitário licenciado ambientalmente ou incineração, que devem ser feitas de modo que não prejudique o meio ambiente. A definição de lixo é tudo aquilo que não apresenta nenhuma serven8a para quem o descarta. Todavia, o item pode se tornar ú8l para alguém ou matéria-prima de um novo produto ou processo, ou seja, um resíduo sólido. Lixo Rejeito Resíduo então é tudo aquilo que pode ser reu'lizado e reciclado e, para isto, este material precisa ser separado por 8po, permi8ndo sua des8nação para outros fins. Podem ser encontrados nas formas sólida (resíduos sólidos), líquida (efluentes) e gasosa (gases e vapores). Segundo a ABNT, NBR 10.004:2004, resíduos sólidos são aqueles que “resultam de a8vidades de origem industrial, domés8ca, hospitalar, comercial, agrícola, de serviços e de varrição. Resíduo 8.1 Biorremediação de petróleo e de hidrocarbonetos Determinadas espécies microbianas especializadas na degradação de componentes aromá-cos e alifá-cos de cadeias médias e longas do óleo, como a bactéria Alcanivorax borkumensis, produzem surfactantes glicolipídicos que auxiliam na degradação promovendo sua a solubilização. Estes resíduos passam a ser captados mais rapidamente por outros microrganismos e catabolizados como fonte de energia, sendo oxidados a CO2. Em condições ideais, 80% ou mais podem ser oxidados no prazo de um ano. Problemas: 1) Determinadas frações de óleo, como hidrocarbonetos de cadeia ramificada ou policíclicos permanecem no ambiente por mais tempo; 2) O óleo derramado que migra para os sedimentos marinhos é degradado mais lentamente, podendo ser um importante impacto de longo prazo Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 O óleo é insolúvel em água, menos denso, e flutua na superUcie, formando manchas. Diversas bactérias, alguns fungos, cianobactérias e algas verdes são capazes de oxidar produtos derivados de petróleo, aerobiamente. Estes microrganismos se desenvolvem nas películas de óleo e a oxidação de hidrocarbonetos é mais extensa se a temperatura for quente e se houver suprimento de nutrientes inorgânicos (principalmente N e P) O petróleo é uma fonte rica em matéria orgânica, assim, seus hidrocarbonetos são atacados por microrganismos quando entra em contato com o ar e a umidade. Em determinadas circunstâncias, como em tanques de armazenamento, o crescimento microbiano é indesejável. No entanto, em derramamentos de petróleo, a biodegradaçãoé desejável e pode ser promovida pela adição de nutrientes inorgânicos para equilibrar o enorme fluxo de carbono orgânico a par8r do óleo (Figura 21.7). A biodegradação pode ser tanto anóxica quanto óxica (Seções 13.22 23) Em condições óxicas, enfa8zamos o importante papel desempenhado pelas enzimas oxigenases ao introduzirem átomos de oxigênio em hidrocarbonetos. Os processos aeróbios, somente na presença de oxigênio as enzimas oxigenases tornam-se a8vas e a oxidação dos hidrocarbonetos é um processo rápido. 8.1 Biorremediação de petróleo e hidrocarbonetos (con8nuação) Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 Bioestimulação 8.1. Biorremediação de petróleo e hidrocarbonetos Fig. 13. 56: Papéis das oxigenases no catabolismo de compostos aromá<cos. As monoxigenases introduzem um átomo e as dioxigenases introduzem dois átomos de oxigênio em um substrato: a) Hidroxilac ̧ão de benzeno a catecol por uma monoxigenase, NADH é o doador de elétrons; b) Clivagem de catecol a cis,cis-muconato por uma dioxigenase que cliva o anel intradiol. c) AFvidades de uma dioxigenase que hidroxila o anel extradiol, na degradação de tolueno. Fig. 13. 55: Atividade da monoxigenase e b-oxidação. Etapas da oxidação de um hidrocarboneto alifático, sendo a primeira catalisada por uma monoxigenase. Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 Oxidação de hidrocarbonetos aromá9cos A oxidação de hidrocarbonetos pode ser um processo rápido. Os hidrocarbonetos aromáBcos podem ser degradados anaerobiamente por um grupo restrito de microrganismos. O metabolismo desses compostos, alguns dos quais podem ser moléculas bastante grandes, como o na:aleno ou bifenilos, normalmente apresenta como etapa inicial a formação de catecol, ou de um composto estruturalmente relacionado, por intermédio do ataque de enzimas oxigenases . Uma vez formado um composto mais simples, como o catecol, ele pode ser adicionalmente degradado, originando compostos que podem ser introduzidos no ciclo do ácido cítrico: succinato, aceBl-CoA e piruvato. Várias etapas do catabolismo aeróbio de hidrocarbonetos aromá9cos requerem oxigenases, e estes são totalmente oxidados a CO2. Há várias diferentes reações catalisadas por oxigenases: - monoxigenases, - dioxigenases de clivagem de anel, - dioxigenases que hidroxilam o anel ou múlBplos anéis Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 Derramamento de petróleo do navio Exxon Valdez em Prince William Sound, Alasca, 24 de Março de 1989 http://en.wikipedia.org/wiki/Prince_William_Sound http://en.wikipedia.org/wiki/Alaska Petróleo Biorremediação: Bioaumentação SERÁ que os novos xenobióticos também podem ser degradados ?? Fundamentação teórica: 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: pesticidas xenobióticos (continuação) 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: pesticidas xenobióticos Xenobió'cos - incluem pes8cidas: - Bifenilos policlorados (como PCB), - Clorados e policlorados (como DDT), - Aromá8cos, - Contendo nitrogênio ou fósforo, (Figura 21.10). - munições, - Corantes, - Solventes clorados, entre muitos outros produtos químicos. Alguns xenobió8cos possuem estruturas químicas muito diferentes daquelas já encontradas pelos microrganismos e, assim, eles são biodegradados muito lentamente. Outros xenobió8cos são estruturalmente relacionados com um ou mais compostos naturais e, algumas vezes, podem ser degradados lentamente por enzimas que normalmente degradam compostos naturais estruturalmente relacionados. Apesar de causar muitas contaminações ambientais, o petróleo é um composto de ocorrência natural, assim, já é esperado que possamos encontrar microrganismos degradadores de petróleo no ambiente. Surge um novo conceito: Será que será possível encontrar no ambiente microrganismos degradadores de compostos xenobió'cos ? (compostos recalcitrantes que não existem naturalmente no ambiente mas que foram introduzidos lá pelo homem) A resposta é SIM. Podemos isolar microrganismos da Biodiversidade ambiental que tem capacidade de realizar a biodegradação de xenobió'cos. Biorremediação de pes'cidas Xenobió'cos Mais de 1.000 8pos de pes8cidas são comercializados globalmente, visando o controle químico de pragas, incluem herbicidas, inse'cidas e fungicidas. Algumas dessas substâncias podem ser u8lizadas como fontes de carbono e doadores de elétrons por microrganismos, outras não. Compostos altamente clorados, tais como o DDT, são normalmente os mais resistentes ao ataque microbiano e persistem rela8vamente inalterados durante muitos anos. Fig. 21.10: Exemplos de compostos xenobióBcos. Embora nenhum destes compostos exista na natureza, existem microrganismos que podem degradá-los. Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 2. Bioaumentação 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: pesticidas xenobióticos (continuação) Fig. 21.11: Biodegradação do herbicida 2,4,5-T. Mecanismo da biodegradação. Observe a importância de uma dioxigenase no processo de degradação: a) Anaeróbica: descoloração redutiva por Dehalococcoides, e b) Aeróbica: oxigenases – subsequente degradação ate acetato. Moléculas orgânicasBiorremediação: xenobióticos Moléculas orgânicasBiorremediação: xenobióticos Moléculas orgânicasBiorremediação: xenobióticos Moléculas orgânicas Xenobióticos Biorremediação: Bioaumentação SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE do herbicida ATRAZINA. Julieta Ueta e col., EMBRAPA. A maioria dos compostos orgânicos xenobióBcos, tais como agroquímicos em geral, não se perpetuam no ambiente pois podem ser biodegradados pela ação de organismos vivos presentes na natureza, que atacam a estrutura molecular destes compostos. O grupo da EMBRAPA realizou o isolamento e a seleção de linhagens microbianas capazes de biodegradar ATRAZINA, um trabalho de enorme interesse nacional importante para a recuperação de solos tropicais submeCdos a agricultura intensiva. O mercado mundial de agroquímicos movimenta atualmente mais de US$ 30 bilhões. O Brasil é o 5º maior consumidor de pes9cidas e movimenta mais de US$ 2,5 bilhões/ano. Exemplo: 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: pesticidas xenobióticos (continuação) Fig.: Seleção de bactérias degradadoras de atrazina. As colônias foram cul8vadas em meio na presença do xenobió8co: São resistentes e o biodegradam. Assim: A Biorremediação pode ser realizada por Bioaumentação + Bioes timulação seguida do monitoramento do meio ambiente. Bioestimulação + Bioaumentação O “Landfarming” é um processo já uBlizado há mais de 20 anos que foi originalmente empregado em fazendas para tratamento de resíduos orgânicos. Atualmente passou a ser empregado para o tratamento de resíduos da indústria química. Os resíduos dispostos no solo são periodicamente revolvidos juntamente com parte do solo, considerando uma camada superior bem definida (15-20 cm). Este procedimento promove a redistribuição dos resíduos (garanBa de nutrientes), temperatura adequada, e aeração. Os microrganismos são termoflicos (a temperatura varia durante o processo). Deve-se ter cuidado para evitar contaminação do lençol freáBco. Exemplo: Bioestimulação + Bioaumentação 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: Moléculas orgânicas (continuação) “Landfarming” Fig.: “Landfarming”, também chamado de eleito rea'vo Fig.: 1. Pilhas de degradação: uma adaptação do “Landfarming” O tratamento secundário aeróbio de água de rejeitos u8liza reações diges8vas realizadas por microrganismos em condições aeróbias para o tratamento de água de rejeitos contendo baixos níveis de matérias orgânicas (Figura 21.16a, b). De maneira geral, as águas de rejeitos de origem residencial podem ser de maneira eficiente tratadas realizando-se apenas um tratamento aeróbio. Diversos 8pos de processos de decomposição aeróbia são u8lizados no tratamento de água de rejeitos, porém os métodos de lodo a'vado são os maiscomuns. Aqui, o esgoto é constantemente misturado e aerado em grandes tanques. Bactérias formadoras de limo, incluindo Zoogloea ramigera, entre outras, crescem e formam flocos (massas agregadas) (Figura 21.17). Exemplo: 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: Moléculas orgânicas (continuação) Tratamento secundário de água de rejeitos Fig. 21.6: Processo de tratamento secundário de água de rejeitos mostrando o processo de lodo aBvado : a) tanque de aeração; b) o fluxo de agua residual passa por uma instalação de lodos aBvados. A recirculação do lodo aBvado para o tanque de aeração introduz os microrganismos responsáveis pela digestão oxidaBva dos componentes orgânicos da água residual. Fig.: 21.17: Um floco de agua de rejeitos formado pela bactéria Zoogloea ramigera formado no processo de lodo aBvado. Ele é composto por um grande numero de pequenas células bacterianas em forma de bastonete. Uma camada limosa polissacarídica disposta e, projeções digiBformes nesta coloração negaBva com Bnta nanquim. Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 Fonte: Microbiologia de Brock, 16a.ed., 2016 Bioestimulação + Bioaumentação Bioestimulação + BioaumentaçãoExemplo: 8.2. Biorremediação de poluentes orgânicos: Moléculas orgânicas (continuação) Compostagem 8.3. Biorremediação de poluentes orgânicos: plásticos Os plás'cos derivados de petróleo são exemplos clássicos de xenobió'cos, pois permanecem no ambiente por mais de 200 anos. A indústria de plás8cos em todo o mundo produz mais de 40 milhões de toneladas de plás8co/ano, e quase metade destes são descartados em vez de reciclados. Esse problema es8mulou a busca por alterna8vas biodegradáveis denominadas biopolímeros, em subs8tuição a alguns dos polímeros sinté8cos. Os biopolímeros polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros produzidos por bactérias, são totalmente biodegradáveis e possuem muitas das propriedades desejáveis dos plás8cos clássicos. Os PHAs podem ser biossinte8zados em diversas formas químicas, cada um com suas próprias propriedades Usicas (rigidez, resistência ao impacto e cisalhamento e outros). Diversas bactérias podem ser empregadas para produzir PHAs com diferentes propriedades e a par8r de diferentes fontes de carbono. Dentre muitas bactérias estudadas, a bactéria Ralstonia eutropha é a mais estuda para a finalidade de produção comercial de PHAs. Quando adicionados de PLASTIFICANTE (preferencialmente um bioplas'fcante) se tornam BIOPLÁSTICOS semelhantes aos convencionais derivados de petróleo. Um copolímero de PHA contendo quan8dades iguais de poli-b- hidroxibu8rato e poli-b-hidroxivalerato tem ó8mas propriedades para emprego em embalagens e tem sido comercializado na Europa. como recipiente para produtos de higiene pessoal. a) b) Fig.: a) Frasco de Shampoo com a primeira embalagem comercial da empresa Biopol; b) Garrafas fabricadas com biopolímero PHA (Polihidroxialcanoato) incubadas em lodo de esgoto aeróbico durante o verão, na temperatura média de 20 °C, por: 0, 2, 4, 6, 8 e 10 semanas (da esquerda para a direita). Observa- se a ocorrência de progressiva degradação. Fonte: Dieter Jendrossek, Georg-August-Universit Universt, Gö]ngen, Alemanha. Plás9cos derivados de petróleo x Bioplás>cos Biodegradáveis Fonte: Madison, L.L.; Huisman, G. W.. 1999. Metabolic Engineering of Poly(3- Hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (1): 21–53. https://www.researchgate.net/publication/13223568_Metabolic_Engineering_of_Poly3- Hydroxyalkanoates_From_DNA_to_Plastic https://www.researchgate.net/publication/13223568_Metabolic_Engineering_of_Poly3-Hydroxyalkanoates_From_DNA_to_Plastic E como é a biorremediação de metais pesados? É possível? 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos Metais pesados: Metais pesados tóxicos Hg2+ Imagem da Agência Espacial Européia (ESA) que mostra grande quantidade de lixo espacial na órbita terrestre. Segundo a ESA, 6.000 satélites já foram enviados para o espaço desde 1957 (2008). está na Biolixiviação Fundamentação teórica: 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) A Biolixiviação consiste no emprego de bactérias capazes de promover a solubilização de metais. A Biorremediação consiste no emprego de bactérias para promover a imobilização de metais, torná-los não mais biodisponiveis. Pode ser por : - Precipitação: microrganismo promove este efeito; - Adsorção: Ocorre adesão à superfície do sorvente. Pode ser realizado com microrganismos mortos, ou material inanimado, como: carvão, cascas secas, etc; - Absorção: o microrganismo usa energia para internalizar o metal. Em escala industrial é aplicada para a mineração ou para a recuperação secundaria de metais como cobre, urânio, ouro. Pilhas de resíduos com teor do metal desejado baixo são tratadas com soluções acidas (pH 1,5-2,0) e bactérias com capacidade realizar transferência de elétrons entre metais, acabam por promover a solubilização do metal presente no minério. O metal desejado em solução é recuperado e o metal pode ser obtido por técnicas de precipitação em ambiente desejado. Fig. 21.1: Poluição: Drenado acido de mina de cobre. Biomineração: Cobre em solução. em ambiente controlado, pode ser recuperado na forma metálica. Biorremediação: O Drenado poluído pode ser tratado com microrganismos. 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Biorremediação: Metais pesados tóxicos 1. Precipitação 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Bactérias Gram- negaCvas Biorremediação: Metais pesados tóxicos 2. Adsorção 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Bactérias Gram-posiCvas Biorremediação: Metais pesados tóxicos 2. Adsorção 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Leveduras Biorremediação: Metais pesados tóxicos 2. Adsorção 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Biorremediação: Metais pesados tóxicos 3. Bioacumulação (Adsorção + Absorção 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Clones recombinantes de E. coli que expressam intracelularmente a fitoquela8na sinté8ca EC20 apresentaram capacidade aumentada de realizar a Bioacumulação de íons Cadmio. Como foi feito: Foi sinte8zado in vitro um gene codificante da fitoquela8na (pequena proteína ávida por ligar metal) sinté8ca EC20. O gene EC20 sinté8co foi amplificado por PCR, inserido em vetores de clonagem e expressão gênica e o plasmídeo recombinante foi inserido em E. coli. As células recombinantes E. coli expressando EC20 apresentam aumento de: 1) resistência a este íon tóxico, e 2) da capacidade de biossorção de íons Cd2+. Estes resultados indicam bom potencial para emprego futuro para Biorremediação ex situ de íons Cd2+. Figura 3: O clone recombinante E. coli expressando EC20 apresenta maior resistência (16 vezes maior) aos efeitos tóxicos dos íons Cd2+. Figura 4 : A análise ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry) mostrou que o clone recombinante que expressa EC20 absorve 37,5% de íons Cd2+ , ou seja um aumento de 26% na bioacumulação de ions Cadmio. Fonte: Barbieri de Souza, C. & Vicente, E.J. (2020). Expression of syntheCc phytochelaCn EC20 in E. coli increases its biosorpCon capacity and candmium resistance. Bioscience Journal Original ArCcle Biosci. J. 36: 619-627. Processos Biorremediaçã oex-situ: Os processos de tratamento ex-situ são mais caros que os processos in-situ. Todavia, as vezes são ou preferidos devido: - A toxicidade envolvida; - Obrigatoriedade de uso quando são empregados microrganismos recombinantes (OGM). Metais pesados tóxicos 9. Biorremediação de metais pesados tóxicos (continuação) Biodegradação e Biorremediação não são conceitos novos, pois estes processos biológicos têm sido aplicados há muito tempo no tratamento de resíduos. O direcionamento atualé o uso de processos biológicos para a remoção de compostos tóxicos (xenobióticos) do ambiente. ...Hei ! Muito Obrigada! Elisabete José Vicente Instituto de Ciências Biomédicas II – USP bevicent@usp.br (011) 3091 7202 10. Questões http://usp.br
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