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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/255687448 Apostila: Produção de embriões bovinos in vivo e in vitro Conference Paper · September 2013 CITATIONS 0 READS 4,699 4 authors: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: Animal reproduction View project Statistical methods for reproductive evaluation in bulls and stallions View project Jurandy Mauro Penitente-Filho Universidade Federal de Viçosa (UFV) 101 PUBLICATIONS 146 CITATIONS SEE PROFILE Fabrício Albani Oliveira 54 PUBLICATIONS 231 CITATIONS SEE PROFILE Carolina Rodriguez Jimenez University of São Paulo 44 PUBLICATIONS 65 CITATIONS SEE PROFILE Ciro A A Torres Universidade Federal de Viçosa (UFV) 197 PUBLICATIONS 1,105 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Jurandy Mauro Penitente-Filho on 28 May 2014. 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Jurandy Mauro Penitente Filho Fabrício Albani Oliveira Carolina Rodrigues Jimenez Ciro Alexandre Alves Torres Viçosa – MG 2013 Sumário Introdução......................................................................................................................................1 Dinâmica folicular .....................................................................................................................2 Produção in vivo de Embriões Bovinos...........................................................................................3 Seleção e sincronização de receptoras.........................................................................................3 Sincronização de receptoras com PGF2α ................................................................................4 Uso do GnRH e suas associações ...........................................................................................4 Associação de progestágenos e estradiol ................................................................................5 Seleção e superovulação (SOV) das doadoras .............................................................................6 Colheita, rastreamento e classificação de embriões: ....................................................................8 Transferência dos embriões: .......................................................................................................9 Produção in vitro de Embriões Bovinos ........................................................................................ 10 Coleta dos Complexos cumulus oócitos (COC’s): ..................................................................... 10 Classificação deoócitos: .......................................................................................................... 10 Maturação in vitro: ................................................................................................................... 11 Fertilização in vitro: ................................................................................................................. 12 Cultivo in vitro de embriões: .................................................................................................... 12 Micromanipulação de Embriões ................................................................................................... 12 Bipartição de embriões ............................................................................................................. 13 Separação de Blastômeros: ....................................................................................................... 13 Considerações finais .................................................................................................................... 13 Referências .................................................................................................................................. 14 1 Introdução A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva. Nesse sentido, especialmente no que se refere aos ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial, fertilização in vitro e a transferência de embriões vêm sendo utilizadas com sucesso (FIGUEIREDO et al., 2007). Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho, visto que o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida reprodutiva aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência e produção in vitro de embriões (GONÇALVES et al., 2007). O Brasil é o maior produtor de embriões bovinos do mundo, respondendo por quase um terço da produção mundial (Figura 1). A mudança ocorrida no mercado nacional após 2004 (Figura 2), com a progressiva substituição da chamada transferência de embriões convencional (ou simplesmente TE) pela produção de embriões em laboratório (conhecida como FIV ou PIV), fez com que a participação do Brasil no total de embriões produzidos por superovulação fosse reduzida pela metade no período 2004-2007. Com isso, o país ficou atrás, no cenário mundial, do eixo EUA-Canadá e Japão. No mercado de embriões PIV, no entanto, o país consolidou sua liderança, respondendo por mais de 85% do total mundial (SBTE, 2009). Figura 1 – Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos no mundo no período de 2003-2007 (SBTE, 2009). Figura 2 – Produção de embriões no Brasil, por técnica, no período 2000-2008. Após um período intenso de crescimento, de 2002 a 2006, a PIV apresentou uma tendência de estabilização. A redução na velocidade de crescimento da PIV era esperada, 2 em função da redução natural na demanda reprimida que havia no mercado de reprodutores, e também em função das próprias limitações da técnica, como a dificuldade na criopreservação dos embriões. A congelação de embriões PIV ainda é limitada (Figura 3), assim, a TE vem suprindo a demanda por embriões criopreservados, seja para fins de otimização do uso de receptoras, seja para fins de comércio (SBTE, 2009). Figura 3 – Transferências a fresco e congelação de embriões bovinos no Brasil no período 2007-2008 (SBTE, 2009). As raças zebuínas ainda respondem pela maioria absoluta dos embriões produzidos no Brasil, principalmente zebus de corte. Contudo, observa-se um aumento considerável na participação de raças leiteiras no mercado de embriões (Figura 4), especialmente da Gir (68% do total das raças leiteiras) e Girolando (22,4%). Figura 4 – Participação de raças leiteiras no total de embriões produzidos no Brasil de 2004 a 2008 (SBTE, 2009). Dinâmica folicular O desenvolvimento folicular de bovinos ocorre em um padrão de ondas. Cada onda de crescimento folicular é caracterizada por um grupo de pequenos folículos que são recrutados e iniciam uma fase de crescimento comum por cerca de três dias. Destes folículos, apenas um continua seu desenvolvimento, enquanto os outros sofrem decréscimo de tamanho, estabelecendo-se então, o fenômeno da divergência folicular (BARUSELLI et al., 2007). Vacas e novilhas podem ter duas ou três ondas por ciclo, com um folículo tornando- se dominante em cada uma delas. Por isso, uma população de pequenos, médios e grandes folículos é encontrada em cada ovário, durante todos os dias do ciclo estral (BORGES et al., 2001). 0 5 10 15 20 25 2004 2005 2006 2007 2008 ANO % T O T A L FIV TE TOTAL 3 Cada onda de crescimento folicular é dividida em quatro fases: emergência, seleção, dominância e atresia ou ovulação. A emergência de uma onda é caracterizada por um crescimento de mais de 20 folículos pequenos que são estimulados pelo FSH (REIS, 2004). A concentração de FSH atinge seu pico quando o maior folículo denominado dominante (FD) atinge o tamanho de 4 a 5 mm (NASSER, 2006). Uma das maneiras do FD manter seu “status” é produzir substâncias que inibam o desenvolvimento de outros folículos antrais. Uma dessas substâncias é a inibina, um hormônio peptídeo produzido pela granulosa que inibe a secreção do FSH por efeito de retro alimentação negativa sobre a liberação de FSH, aparentemente pelo efeito direto sobre a hipófise (FLORIANI, 2006). A dinâmica folicular em animais zebuínos tem-se mostrado diferente da de bovinos de raças europeias, de modo que o diâmetro dos FD e a área do Corpo Lúteo (CL) são menores nas fêmeas zebuínas (BORGES et al., 2001). Rasi (2005) ressalta que a emergência da 3ª onda folicular está associada a uma fase luteínica mais prolongada (Figura 5). Figura 5 – Esquemas de ciclo estral. Em A, duas ondas foliculares, em B, três ondas foliculares (TECNOPEC, 2010). Produção in vivo de Embriões Bovinos Seleção e sincronização de receptoras As receptoras de embriões necessitam de cuidados tão rigorosos quanto os dispensados às doadoras. Os cuidados, em relação à sanidade (IBR, BVD, Leptospirose, Tuberculose, Brucelose, Tricomonose), nutrição, mineralização de qualidade e fertilidade, influenciam significativamente os resultados da técnica (TECNOPEC, 2010). Geralmente são utilizadas fêmeas cruzadas como receptoras jovens (zebu x taurino), com boa capacidade de conversão alimentar, com alta fertilidade e boa habilidade materna. Em geral, as receptoras eram descartadas após a primeira cria, porém atualmente o reaproveitamento de receptoras tem se tornado comum, pois os preços praticados pelos fornecedores de receptoras têm se tornado cada vez maior (TECNOPEC, 2010). Algumas considerações devem ser feitas em relação à sincronia da receptora com a doadora, tendo em vista que no momento da colheita, os embriões apresentam uma importante variabilidade em seus estágios de desenvolvimento (24 a 36 horas de diferença) (HAFEZ, 1995). Sendo assim, é adequado ter um grau de sincronia de aproximadamente 24 horas entre a doadora e a receptora, o que permite eleger a receptora mais apropriada para cada tipo de embrião colhido. B A 4 Sincronização de receptoras com PGF2α A PGF2α e seus análogos são os hormônios mais utilizados na sincronização de cio. Porém, a PGF2α apresenta alguns limitantes em seu uso, tais como: necessidade de pessoas qualificadas para detecção de cio, alta variabilidade das respostas ao tratamento e limitada quantidade de receptoras detectadas em cio. Vários estudos sobre o uso de prostaglandinas demonstraram que a variação do intervalo entre a aplicaçãoaos sinais de cio e ovulação pode ser atribuída ao estado da onda folicular no momento do tratamento. Se a luteólise for induzida antes da metade do período estático do folículo dominante, indica que este será o folículo ovulatório, sendo que o intervalo tratamento-cio será curto entre 2 e 3 dias. Porém, se a luteólise for induzida após esse momento, o folículo ovulatório será da próxima onda folicular e o intervalo tratamento-cio será maior, entre 4 a 6 dias. Além disso, estudos revelam que a PGF2α não é efetiva nos primeiro 5 a 6 dias do ciclo estral. Um dos protocolos de sincronização de cios mais usados e mais eficientes consiste na administração de 2 doses de PGF2α num intervalo de 11 a 14 dias, o que possibilitará que todos os animais tratados estejam em fase luteal no momento da segunda aplicação. Este método é facilmente aplicado a um programa de TE, visto que permite que a primeira dose de PGF2α seja administrada na receptora no momento em que a doadora estiver em cio, antes da superovulação (SOV), com a 2 a dose sendo aplicada após 11-12 dias, ou seja, 12 horas antes da aplicação de PGF2α na doadora, fazendo com que o cio da receptora e doadora seja o mais sincrônico possível. Uso do GnRH e suas associações Um protocolo muito usado para sincronizar a ovulação de receptoras é conhecido como OVSYNCH e consiste no seguinte esquema (Esquema 1) de tratamento: GnRH PGF2α GnRH TETF* 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Esquema 1: Protocolo OVSYNCH de sincronização da ovulação.*Transferência de embriões em tempo fixo, Fonte: TECNOPEC, 2008. A administração de GnRH e seus agonistas (GnRHa) induz a liberação de LH e FSH. A liberação de LH induz a ovulação ou a luteinização de grandes folículos presentes no momento do tratamento. A ovulação do folículo dominante permite a liberação de FSH, podendo ser complementado pelo GnRH exógeno, culminando com mais liberação de FSH, para iniciar o recrutamento de uma nova onda folicular. O mecanismo de ação do GnRH consiste: a primeira dose irá induzir a liberação de LH, resultando em ovulação ou luteinização do folículo dominante induzindo, consequentemente, a emergência de uma nova onda folicular dentro de 2 dias. A administração de PGF2a 7 dias após tem função de induzir a luteólise; 2 dias depois se administra outra dose de GnRH com a intenção de induzir outro pico de LH e sincronizar a ovulação do folículo dominante existente (MARTINEZ et al., 2001). O sistema OVSYNCH mostrou melhores resultados quando usados em vacas do que em novilhas. Resultados de outro estudo confirmaram que o GnRH nem sempre resulta em ovulação ou luteinização do folículo dominante em novilhas. Vale ressaltar que a emergência folicular será efetiva somente quando o tratamento causar ovulação (MARTINEZ et al., 1999). Para novilhas têm se obtido maior taxa na sincronização quando entre o GnRH e a PGF2α for administrado um implante de CIDRB (Esquema 2) 5 visando prevenir o aparecimento do cio, que ocorre em muitos casos antes da segunda dose de GnRH (MARTINEZ et al., 2001). GnRH PGF2α GnRH TETF 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Implante de progesterona Esquema 2: Tratamento para TETF, com OVSYNCH associado à progesterona sem a necessidade de detecção de cio. O início do protocolo OVSYNCH em determinado estágio do ciclo estral é associado com redução na fertilidade; por exemplo, se a 1ª dose de GnRH for aplicada entre o D9 e D12 do ciclo estral, a mesma pode não resultar em ovulação com consequente não formação do CL. Neste estágio vacas que possuem apenas 2 ondas foliculares, comumente possuem pequeno potencial de folículo dominante, que não é responsivo ao GnRH. Consequentemente, não há formação de um CL 2 a 4 dias após a injeção de GnRH. O ciclo segue normalmente com a secreção de PGF2α uterina causando a luteólise, sem o aparecimento de cio induzido e sim fisiológico. Outra fase crítica para o uso do OVSYNCH é quando o ovário se encontra no metaestro. Neste estágio, houve uma ovulação fisiológica prévia e o potencial do folículo dominante ainda é pequeno e não é responsivo ao LH (< 9 mm), não havendo resposta à aplicação do GnRH (MOREIRA et al., 2000). Algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para minimizar o número de vacas que se encontram nestes estágios críticos do ciclo estral no início do tratamento OVSYNCH. Um método é a aplicação de 2 doses de PGF2α com intervalo de 11 - 12 dias entre as doses, em um intervalo de 14 dias antes do início do tratamento com OVSYNCH. Com este tratamento se todas as vacas estiverem ciclando espera-se que 90% das vacas estejam no momento ideal para começar o protocolo. Associação de progestágenos e estradiol A função principal do estradiol (E2) é de induzir a regressão dos folículos antrais em crescimento. Os resultados mais eficazes foram obtidos quando o estradiol foi aplicado até um dia depois da inserção do implante de progesterona (P4). O mecanismo pelo qual o estradiol causa regressão folicular envolve a inibição do FSH, até que o estradiol seja metabolizado. A partir de então, o FSH volta aumentar seus níveis e uma nova onda folicular é recrutada. A dose de 5 mg de E2 causa uma emergência folicular 4 dias após sua aplicação. O benzoato de estradiol (BE) na dose de 5 mg possui efeito similar. Os ajustes nos protocolos são controversos, mas tem-se notado maior sincronização da emergência folicular, quando o BE é aplicado no D0 (Dia 0) juntamente com 50 mg de P4 (MOREIRA et al., 2000). Tríbulo (2000) sugere a inserção do dispositivo de liberação lenta de P4 (Primer) combinado com 2 mg de BE no dia 0, e uma aplicação de PGF2α no dia 7, ou seja, no momento da retirada do CIDR, e mais uma dose de 1 mg de BE no D9, sendo que para todas as vacas foram consideradas que o D10 era o dia do estro (Figura 6). 6 Figura 6 – Protocolo para TETF em receptoras cíclicas (TECNOPEC, 2010). Fêmeas que falham na concepção apresentam menores níveis de progesterona do que aquelas que concebem. O desenvolvimento embrionário e a habilidade do concepto em secretar Interferon τ estão relacionados com a concentração sérica de progesterona. Uma forma estudada para aumentar a concentração de progesterona plasmática é a indução de múltiplas ovulações, através da indução de maior recrutamento folicular pela utilização de eCG (gonadotrofina coriônica equina; Figura 7A) ou FSH (Figura 7B) durante o protocolo de sincronização. Figura 7 – Protocolo para superovulação de receptoras (TECNOPEC, 2010). Seleção e superovulação (SOV) das doadoras Entende-se por doadoras as fêmeas que de alguma forma venham contribuir para o ganho genético de um rebanho. As doadoras devem ter características superiores à média de produtividade encontrada no rebanho, pois assim multiplica-se qualidade. Vacas sadias que já atingiram a puberdade devem ser escolhidas. Doadoras que apresentam problemas reprodutivos, ciclo estral irregular, metrite e/ou anestro não respondem bem ao tratamento superovulatório. A SOV é o aumento do número fisiológico de ovulações, próprio de cada espécie, provocado após administração exógena de gonadotrofinas. Nos bovinos, considera-se que houve resposta ao tratamento quando se conseguem mais de duas ovulações. A SOV, portanto, é um método de estimular diversos folículos terciários a se desenvolverem até o estágio de pré-ovulação, com subsequente ovulação (RASI, 2005). A resposta das doadoras a SOV apresenta grande variabilidade tanto na taxa de ovulação, quanto na produção de embriões viáveis. Há grande efeito da idade da doadora, do coeficiente de endogamia da doadora, da ordem de colheita, da dose da droga e do número de inseminações sobre esses resultados (PEIXOTO et al., 2002). As doadoras A B 7 podem ser superovuladas repetidamente a cada 40 dias, duranteum período de 1 a 2 anos, com resultados satisfatórios (HASLER, 2003). Utilizando o cio natural realizam-se oito aplicações de FSH com intervalos de 12 horas, para aumentar o recrutamento dos folículos e no 3° dia da SOV, realizam-se duas aplicações de PGF2α promovendo a luteólise, para que haja redução da P4 e consequente pico de LH, ocorrendo, assim, a ovulação (Figura 8; RASI, 2005). DIA 0 10 11 12 13 14 15 MANHÃ CIO FSH FSH FSH PGF2α FSH CIO IA TARDE FSH FSH FSH PGF2α FSH IA Figura 8 – Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α; IA = Inseminação Artificial. O uso de P4 e E2 em protocolos foi um grande avanço para a biotecnologia da reprodução animal, permitindo que a SOV fosse iniciada em fases aleatórias do ciclo estral dos bovinos. O Benzoato de Estradiol (BE), em protocolos de SOV, é utilizado com a função de suprimir o desenvolvimento folicular e sua resposta é mais eficaz quando combinada com aplicação de P4 IM na introdução de implante vaginal, CIDR ® , de P4 (Figura 9; RASI, 2005). DIA 0 4 5 6 7 8 9 MANHÃ P4 + E2 + CIDR® (implante) FSH FSH FSH FSH CIDR® (retirada) CIO IA TARDE FSH FSH FSH PGF2α FSH IA Figura 9 – Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α; IA = Inseminação Artificial. Nem sempre a ovulação está sincronizada nos tratamentos de SOV e, portanto há dificuldade no acerto das inseminações realizadas, levando a recuperação de inúmeras estruturas não fecundadas. O GnRH tem sido utilizado para controle da ovulação no final destes protocolos, assim como o LH (Figura 10). DIA 0 4 5 6 7 8 9 MANHÃ P4 + E2 + CIDR® (implante) FSH FSH FSH PGF2α FSH CIDR® (retirada) GnRH / LH IA TARDE FSH FSH FSH PGF2α FSH IA Figura 10 – Protocolo de SOV com E2 + P4+ CIDR® +PGF2α + GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo; IA = Inseminação Artificial. O protocolo de Transferência de embriões em tempo fixo (TETF) para doadoras taurinas consiste em aplicar no dia do início do protocolo (D0) 3 ml de BE (Ric-BE ® ) e inserir um dispositivo de liberação de P4 (Primer ® ), no D4 iniciar a SOV com 8 doses de FSH (Folltropin ® ) aplicadas de 12/12 horas, no D6 às 18h se usa PGF2α (Prolise ® ), no D7 às 18h se retira o dispositivo de liberação de P4, no D8 às 18h usa-se LH (Lutropin ® ), no D9 se faz duas IA sendo uma às 6h e outra às 18h. A colheita dos embriões é realizada no D15 (Figura 11; TECNOPEC, 2010). Já o protocolo recomendado para SOV em doadoras zebuínas é diferente das doadoras taurinas, onde o indutor de ovulação (LH) é aplicado com 12 horas de antecedência e as IAs também são adiantadas 12 horas em relação às doadoras taurinas (Figura 12; TECNOPEC, 2010). 8 DIA 0 4 5 6 7 8 9 16 MANHÃ Inserir PRIMER + 3 ml RIC-BE Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin IA Coleta de embriões TARDE Folltropin Folltropin Folltropin + 2 ml Prolise Folltropin Retirada PRIMER Lutropin IA Figura 11 – Protocolo TETF doadoras taurinas; IA = Inseminação Artificial. DIA 0 4 5 6 7 8 9 16 MANHÃ Inserir PRIMER + 3 ml RIC-BE Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin Lutropin IA Coleta de embriões TARDE Folltropin Folltropin Folltropin + 2ml Prolise Folltropin Retirada PRIMER IA Figura 12 – Protocolo TETF doadoras zebuínas; IA = Inseminação Artificial. Convencionalmente, a indução da superovulação em vacas doadoras de embriões é realizada aplicando, por via intramuscular, doses decrescentes de FSH, duas vezes ao dia, durante quatro dias (duração da fase folicular do ciclo estral). A aplicação de doses decrescentes tem por objetivo mimetizar a queda fisiológica do FSH durante a fase folicular, melhorando a resposta superovulatória. Colheita, rastreamento e classificação de embriões: A colheita normalmente é realizada com o animal em posição quadrupedal, por método transcervical. Realiza-se anestesia epidural, utilizando-se 2 a 4 ml de lidocaína 2% e limpeza do reto e assepsia da região vulvar. Utiliza-se um cateter de silicone contendo um balão inflável na sua extremidade, guiado inicialmente por um mandril de metal em seu lúmen para torná-lo rígido, para que o cateter seja introduzido e posicionado em um dos cornos uterinos. Remove-se o mandril e infla-se o balão com 10 a 20 ml de ar, para evitar refluxo de líquido durante a lavagem. O balão deve estar no terço médio do útero, para que a lavagem seja realizada no terço final. O cateter é acoplado a um equipo ligado a uma bolsa de um litro de PBS e a um filtro próprio para embriões. Todo o equipamento está disponível comercialmente com custos acessíveis. Cada corno uterino é lavado aproximadamente 10 vezes, utilizando-se 500 ml de PBS para cada (Figura 13). O PBS deve estar numa temperatura de 25 a 30 ºC. Manter 2-3 cm de líquido no filtro para as estruturas não grudarem no fundo. O filtro com as estruturas deve seguir para o laboratório. Figura 13 – Lavagem uterina para coleta de embriões 9 O conteúdo do filtro é transferido para placa de Petri previamente quadriculada para procura dos embriões. Realizam-se duas procuras completas removendo todas as estruturas viáveis e inviáveis encontradas. Os embriões viáveis encontrados devem ser avaliados e classificados segundo os critérios da IETS (International Embryo Transfer Society; STRINGFELLOW e GIVENS, 2010): EXCELENTE ou BOM (Grau I) – estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais que são uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a Zona Pelúcida (ZP) não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa e, preferencialmente intacta; menos de 15% de células extrusadas. REGULAR (Grau II) – estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; forma regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho; pelo menos de 50% das células compõem massa embrionária viável; menos de 15% de células extrusadas. POBRE (Grau III) – estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado; irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho; menos de 75% das células degeneradas; pelo menos 25% das células compõem massa embrionária viável. MORTO OU DEGENERADO (Grau IV) – estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de todo material celular presente no interior da ZP. Transferência dos embriões: Somente embriões classificados como grau I a III devem ser transferidos para receptoras. A transferência, de preferência deve ser realizada por via transcervical. O embrião precisa ser previamente acomodado no centro de uma palheta de 0,25ml, como mostra a Figura 14. Figura 14 – Esquema de palheta contendo embrião. As receptoras devem estar sincronizadas com a idade do embrião, ou seja, se o embrião tem 7 dias, a receptora deve ter ciclado 7±1 dias atrás. Antes de transferir os embriões, avaliar o CL da receptora, confirmando assim a ovulação. A TE ou inovulação consiste na deposição do embrião no terço médio-final do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. Utilizando aplicador semelhante ao utilizado na inseminação artificial, passa- se a cérvix, realizando-se a inovulação o mais cranialmente possível, na luz do corno uterino ipsilateral ao CL. 10 Produção in vitro de Embriões Bovinos As diversas vantagens e aplicações da produção in vitro de embriões (PIV) estão relacionadas à: determinação e controle do sexo dos produtos; aumento da eficiência dos programas de produção; rápidas e melhores possibilidades para executar programas de cruzamento; avaliação do efeito materno sobre a descendência; rápida multiplicação de raças; facilidade de importação e exportação de material genéticoda fêmea; formação de bancos de gametas congelados; aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético; e estudo e desenvolvimento de outras biotécnicas reprodutivas a partir da micromanipulação de gametas e embriões (GONÇALVES et al., 2002). Coleta dos Complexos cumulus oócitos (COC’s): O advento da aspiração folicular in vivo ou OPU (ovum pick up; Figura 15) e o aprimoramento das condições de cultivo in vitro tornaram viável à aplicação da PIV em escala comercial (Gonçalves et al., 2007). Os índices atuais de blastocistos obtidos com a técnica de produção in vitro de embriões giram em torno de 20 a 50% (média de 35%). Segundo Gonçalves et al. (2002), cada fêmea bovina é capaz de produzir 50 a 100 embriões/ano, com um regime de duas punções semanais por doadora, durante vários meses. A OPU apresenta maior flexibilidade em relação a TE, pois permite a obtenção de oócitos de fêmeas a partir dos 6 meses de idade (ainda com resultados inferiores nessa idade), de vacas prenhes até o terceiro mês de gestação ou mesmo após o parto. A aspiração folicular duas vezes por semana produz maior percentagem de embriões grau 1 e maior número de embriões transferíveis do que aspirações realizadas uma vez por semana (GIBBONS et al., 1994). No entanto, a aspiração folicular semanal de animais da raça Nelore pode produzir um bezerro por semana via PIV (WATANABE et al., 1998), isso demonstra a capacidade da associação OPU/FIV em multiplicar de maneira rápida e eficiente animais geneticamente superiores. Figura 15 – Esquematização da metodologia de Ovum pick up (OPU). Classificação de oócitos: Os complexos cumulus-oócito (COC´s) colhidos devem ser separados em quatro categorias, de acordo com as características baseadas na compactação e transparência das células do cumulus e homogeneidade e transparência do ooplasma, utilizando o sistema de 11 classificação descrito por Leibfried e First (1979). Consideram-se COCs viáveis os de classificação I a III, sendo os COCs de classe IV descartados. Grau I: Oócitos com cumulus compacto e mais de três camadas de células. Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom (Figuras 16A e 17). Grau II: Oócitos com menos de três camadas de células do cumulus oophorus. Ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentradas no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche todo espaço interior da zona pelúcida (Figuras 16B e 17). Grau III: Oócitos que possuem o cumulus presente, mas expandido. Ooplasma contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço perivitelino, degenerado, vacuolizado ou fragmentado (Figura 16C). Grau IV: Oócitos desnudos sem células do cumulus, citoplasma com cor e granulação anormais ou com células expandidas com aspecto apoptótico (Figura 16D). Figura 16 – Classificação de oócitos (STRINGFELLOW e GIVENS, 2010). Figura 17 – Oócitos graus 1 e 2. Maturação in vitro: Para que o oócito seja capaz de ser fecundado e posteriormente se desenvolver até o estágio de blastocisto, precisa ser maturado e, durante essa fase, sofrer diversas transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo. Durante todo o seu desenvolvimento, o oócito se encontra no estágio diplóteno da prófase I, o reinício da meiose, ou maturação, tem início após o pico pré-ovulatório de LH durante o estro. A retirada do oócito do contato com as células foliculares, in vitro, é suficiente para dar início ao processo de maturação nuclear. A maturação nuclear do oócito compreende a progressão do estágio diplóteno prófase I até a fase de metáfase II. O período de maturação 12 in vitro varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e umidade saturada (GONÇALVES et al., 2007). Diferentes condições de cultivo e protocolos já foram testadas in vitro para a maturação de oócitos, vários meios de maturação, tais como fluído sintético de oviduto (SOF; GANDHI et al., 2000;), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-10, Ham’s F-12 (SMETANINA et al., 2000) e meio de cultivo tecidual 199 (TCM 199), têm sido utilizados. Fertilização in vitro: O co-cultivo (espermatozoide e oócito) é realizado em temperatura de 39°C, atmosfera com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozoides viáveis contidos em uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e dos espermatozoides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Em bovinos, o método de separação espermática mais utilizado é o gradiente de PERCOLL. Após a separação, os espermatozoides são diluídos a uma concentração de 1 a 5 x 10 6 sptz/ml de meio (GONÇALVES et al., 2007). Cultivo in vitro de embriões: O co-cultivo de embriões com células somáticas foi utilizado por muitos anos com bons resultados. Entretanto, esse sistema tem sido substituído ao longo do tempo por sistemas mais simples que utilizam meios semi-definidos como os meios Charles Rosenkrans-1 (CR-1), Charles Rosenkrans-2 (CR-2; ROSENKRANS et al., 1993), meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) e fluído sintético de oviduto (SOF) associados a uma atmosfera gasosa controlada contendo baixa tensão de oxigênio (GONÇALVES et al., 2007). Fatores de crescimento como o semelhante à insulina (IGF-1) e fator de crescimento e transformação β1 (TGFβ1) têm sido adicionados ao meio de cultivo in vitro objetivando melhorar o desenvolvimento embrionário (MATSUI et al., 1997). O tempo de cultivo in vitro varia de 7-9 dias, em temperatura de 39ºC com atmosfera controlada (5% de CO2) e umidade saturada. A taxa de blastocistos geralmente é avaliada no 7º dia de cultivo in vitro e a taxa de eclosão in vitro no 9º dia (GONÇALVES et al., 2007). Micromanipulação de Embriões A produção de animais geneticamente idênticos é de grande utilidade à indústria pecuária, principalmente por aumentar o número de descendentes de pais geneticamente valiosos. Além disso, o uso de animais monozigóticos em vários estudos comparativos reduziria substancialmente o número de animais necessários para a geração de dados estatisticamente válidos (YANG e ANDERSON, 1992). 13 Bipartição de embriões Apenas 25% da massa celular total do embrião são requeridas para manter sua viabilidade embrionária. Neste caso, embriões bipartidos podem manter ainda razoável capacidade de desenvolvimento (WILLADSEM e POLGE, 1981). A bipartição de embriões com finalidades comerciais iniciou-se em meados da década de 80 (BAKER e SHEA, 1985). A partir deste período, vislumbrou-se a possibilidade de aumentar a progênie de machos e fêmeas pela colheita e posterior bipartição de embriões. A bipartição de embriões permite aumentar o número de bezerros a partir de menor número de embriões (TORRES et al., 2012). Com o auxílio de um estereomicroscópio com base de transiluminação acoplado a um dispositivo de micromanipulação mecânico, cada estrutura é posicionada de forma a permitir uma divisão o mais equitativa possível da massa embrionária, objetivando a separação do embrião em duas metades com a maior semelhança. Este procedimento simplificado de bipartição embrionária utiliza lâmina metálica de microcirurgia (Figura 18) (FERNANDES et al., 2007). Os embriões podem ser bipartidos nas fases de mórula, blastocisto inicial e blastocisto (OLIVEIRA et al., 2012). Embriões na fase de mórula podem ser bipartidos em qualquer sentido. Aqueles na fase de blastocisto são divididos de forma a se obter metades equitativas da blastocele e botão celular. Figura 18 – Sequência de bipartição de uma mórula. Separação de Blastômeros: A totipotência dos blastômeros isolados ou em grupos pequenos já foi relatada,principalmente com células originadas de embriões de 2 a 8 células. Para embriões com estágio de desenvolvimento mais adiantado a totipotência é dependente de um grupo maior de células (WILLIANS et al., 1984). A separação dos blastômeros de embriões de 2 a 8 células pode ser obtida pela ruptura da zona pelúcida e posterior proteólise ou separação mecânica. Uma vez rompida a zona pelúcida, os blastômeros podem ser separados por repetidas pipetagens em meio de cultivo apropriado. Os blastômeros de embriões bovinos de oito células produzidos in vitro, mesmo após separação em duas metades, mostraram a mesma capacidade de desenvolver para o estágio de blastocisto quanto os embriões de oito células intactos. Além disso, uma alta taxa de gestação foi obtida com a transferência desses blastocistos (TAGAWA et al., 2008). Considerações finais A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução de bovinos permitem o aumento da eficiência produtiva e reprodutiva. O número de descendentes deixados por uma fêmea ao longo de sua vida aumentou com o aperfeiçoamento das técnicas de TE, PIV e Bipartição. Contudo, embora as técnicas apresentem resultados satisfatórios, pesquisas ainda são requeridas objetivando redução dos custos da produção de embriões, ainda proibitivos para a grande maioria dos proprietários. 14 Referências BAKER, R.D.; SHEA, B.F. Commercial splitting of bovine embryos. Theriogenology, v.23, p.3- 12, 1985. BARUSELLI, P.S.; GIMENES, L.U.; SALES, J.N.S. Fisiologia reprodutiva de fêmeas taurinas e zebuínas. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, p.205-211, 2007. BORGES, A.M.; TORRES, C.A.A.; ROCHA JUNIOR, V.R.; RUAS, J.R.M.; CARVALHO, G.R. Dinâmica folicular ovariana em novilhas mestiças Holandês-Zebu. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.53, p.1-13, 2001. FERNANDES, C.A.C.; OLIVEIRA, E.R.; VASCONCELOS, T.D.; ALVES, B.F.L.; GIOSO, M.M.; VIANA, J.H.M.; OBA, E.; FIGUEIREDO, A.C.S. Bipartição de embriões bovinos em diferentes estádios de desenvolvimento. In: REUNIÃO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE TECNOLOGIA DE EMBRIÕES, 21., 2007, Costa do Sauípe, 2007. Anais... Costa do Sauípe: SBTE, 2007. p. 1-5. FIGUEIREDO, J.R.; CELESTINO, J.J.H.; RODRIGUES, A.P.R.; SILVA, J.R.V. Importância da biotécnica de MOIFOPA para o estudo da foliculogênese e produção in vitro de embriões em larga escala. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, p.143-152, 2007. FLORIANI, A. R. Efeito de progesterona e benzoato de estradiol na dinâmica folicular e produção in vitro de embriões bovinos. Belo Horizonte, 2006. 40p. Tese (Doutorado) – Escola de Veterinária. Universidade Federal de Minas Gerais. GANDHI, A. P.; LANE, M.; GARDNER, D. K.; KRISHER, R. L. A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. Human Reproduction, v.15, p.395-401, 2000. GIBBONS, J. R.; BEAL, W. E.; KRISHER, R. L.; FABER, E. G.; PEARSON, R. E.; GWAZDAUSKAS, F. C. Effects of once- versus twice-weekly transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and embryo development. Theriogenology, v.42, p.405- 419, 1994. GONÇALVES, P.B.D.; FIGUEIREDO, J.R.; FREITAS, V.J.F. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela, 2002. 340p. GONÇALVES, P.B.D.; BARRETA, M.H.; SANDRI, L.R.; FERREIRA, R.; ANTONIAZZI, A.Q. Produção in vitro de embriões bovinos: o estado da arte. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, p.212-217, 2007. HAFEZ, E.S.E. Tecnologia reprodutiva assistida: manipulação da ovulação, fertilização in vitro/transferência de embrião. In: HAFEZ, E.S.E. Reprodução animal. São Paulo: Manole, 1995. p.469-512. HASLER, J.F. The current status and future of commercial embryo transfer in cattle. Animal Reproduction Science, v.79, p.245-264, 2003. LEIBFRIED, L.; FIRST, N. L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science, v.48, p.76-86, 1979. MARTINEZ, M.F.; ADAMS, G.P.; BERGFELT, D.; KASTELIC, J.P.; MAPLETOFT, R.J. Effect of LH or GnRH on the dominant follicle of the first wave in heifers. Anim. Reprod. Sci. v. 57, p. 23-33, 1999. MARTINEZ, M.F.; KASTELIC, J.P.; ADAMS, G.P.; COOK, R.B.; OLSON, W.O.; MAPLETOFT, R.J. The use of progestins in regimens for fixed-time artificial insemination in beef cattle. Theriogenology. 2001. MATOS, L.F. Curso de Aspiração Folicular para FIV em Bovinos. Viçosa: CPT Cursos Presenciais, 2008. 34p. MATSUI, M.; TAKAHASHI, Y.; HISHINUMA, M.; KANAGAWA, H. Stimulation of the development of bovine embryos by insulin and insulin-like growth factor-I (IGF-I) is mediated through the IGF-I receptor. Theriogenology, v.48, p.605-616, 1997. MOREIRA, F.; ORLANDI, C.; RISCO, C.; LOPES, F.; MATTOS, R.; THATCHER, W.W. Pregnancy rates to a timed insemination in lacting dairy cows pre-syncronized and treated with bovine somatotropin: Cyclic versus anestrus cows. Journal of Dairy Science, v.83, (Suppl.), p.134, 2000. (Abstr.) 15 NASSER, L.F.T. Resposta superovulatória na primeira onda de crescimento folicular em doadoras Nelore (Bos taurus indicus). São Paulo, 2006. 80p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo. OLIVEIRA, F.A.; TORRES, C.A.A.; NASCIMENTO, V.A.; PENITENTE FILHO, J.M.; OLIVEIRA, M.M.N.F.; MACHADO, T.M.M. Effect of nutritional flushing on in vivo development of demi-embryos from superovulated Dairy Gir cows. Animal Reproduction, v.9, p.984, 2012. PEIXOTO, M.G.C.D.; FONSECA, C.G.; PENNA, V.M.; ALVIM, M.T.T. Multivariate analysis of multiple ovulation followed by embryo transfer results from zebu donors. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.54, p.492-500, 2002. RASI, F.P.A. Técnicas de superovulação, colheita e transferência de embriões em bovinos. Botucatu, 2005. 27p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade Estadual Paulista. REIS, E.L. Efeito da dose e do momento da administração de gonadotrofina coriônica equina no protocolo de sincronização da ovulação para TETF. São Paulo, 2004. 101p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo. ROSENKRANS Jr, C.F.; ZENG, G.Q.; McNAMARA, G.T.; SCHOFF, P.K.; FIRST, N.L. Development of bovine embryos in vitro as affected by energy substrates. Biology of Reproduction, v.49, p.459-462, 1993. SBTE, Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões. Mudanças de tendências no Mercado de embriões bovinos no Brasil. Jornal O Embrião. v.42, p.5-7, 2009. SMETANINA, I. G.; TATARINOVA, L. V.; KRIVOKHARDCHENNKO, A. S. The effect of the composition of the culture media on bovine oocyte maturation and embryo development in vitro. Ontogenez, v.31, p.139-143, 2000. STRINGFELLOW, D.A.; GIVENS, M.D. Manual of the International Embryo Transfer Society. Illinois: International Embryo Transfer Society, 2010. 200p. TAGAWA, M.; MATOBA, S.; NARITA, M.; SAITO, N.; NAGAI, T.; IMAI, K. Production of monozygotic twin calves using the blastomere separation technique and Well of the Well culture system Theriogenology, v.69, p.574–582, 2008. TECNOPEC. Superovulação e transferência de embriões em tempo fixo (SOVTF / TETF) – Manual técnico. 2010. Disponível em: <http://www.tecnopec.com.br/ filearchive/5cc4d0e764c9524f35eb447a12c56381.pdf>. Acesso em: 27 out. 2012. TORRES, C.A.A.; FERNANDES, C.A.C.; OLIVEIRA, F.A.; PENITENTE FILHO, J.M.; OLIVEIRA, C.T.S.A.M.; SANTOS, M.C.R.; JIMÉNEZ, C.R.; TRIANA, E.L.C; OLIVEIRA, M.M.N.F. Pregnancy rates of bovine embryos and hemiembryos transference. Reproduction, Fertility and Development, v.24, p.167-167, 2012. TRÍBULO, H.; BÓ, G.A.; GATI, G.; TEGLI, J.; MORENO, M.; BRITO, M.; TRÍBULO, R. Pregnancy rates in embryo recipients treated with estradiol benzoate and CIDR-B vagina device to eliminate the need for estrus detection. In: INTERNATIONAL CONGRESSON ANIMAL REPRODUCTION, 14., 2000, Stockholm. Proceedings... Stockholm: 2000. p.115. WATANABE, M. R.; LÔBO, R. B.; FRANCESCHINI, P. H.; DAYAN, A.; VILA, R. A.; GALERANI, M. A. V.; WATANABE, Y. F. Embryo in vitro production per session of follicular aspiration in Nelore cows. Arquivos Faculdade Veterinária UFRGS, v.26, p.383, 1998. WILLADSEM, S.M.; POLGE, C. Attempts to produce monozygotic quadruplets in cattle by blastomere separation. Veterinary Records, v.108, p.211–213, 1981. WILLIANS, T.J.; ELSDEN R.P; SEIDEL, G.E. Effect of embryo age and stage on pregnancy rates from demi-embryos. Theriogenology, v.21, p.276, 1984. YANG, X.; ANDERSON, G.B. Micromanipulation of mammalian embryos: principles, progress and future possibilities. Theriogenology. v.38, p.315–335, 1992. View publication statsView publication stats https://www.researchgate.net/publication/255687448
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