Atividade extraçao DNA

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DE MATO GROSSO-UNEMAT
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
BIOLOGIA MOLECULAR
PROF. DR. ALEXANDRO CÉZAR FALEIRO
25 DE ABR DE 2018
FELIPE SOARES DE SOUZA[footnoteRef:1] [1: Acadêmico do 4º semestre do curso de Ciências Biológicas Universidade do Estado de mato Grosso-UNEMAT Campus Universitário de Tangará da Serra.] 
	Protocolos de extração de DNA animal, vegetal e bacteriano.
Extração de DNA vegetal 
PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE Anacardium
giganteum W. HANCOCK EX ENGL. (ANACARDIACEAE)
Protocolo 1
Foram utilizadas cerca de 150 a 200 mg de folhas jovens frescas, as quais foram colocadas em microtubos de 2 mL, adicionados 400 µL de tampão e realizada a maceração com bastão de vidro e, a seguir, acrescentado ao macerado mais 400 µL do tampão CTAB, totalizando 800µL (100 mM Tris-HCl (pH 8,0); 20mM de EDTA (ácido etileno diamonotetracético); 1,4M NaCl; (PVP) polivinilpirrolidona; (CTAB) brometo de cetiltrimetilamônio; Proteinase K (100 µg/mL) e β-mercaptoetanol). Foram testadas duas concentrações de CTAB no tampão 2% e 5% e diferentes concentrações de β-mercaptoetanol (0 %, 1 % e 2,5 %). Logo após a adição de cada tampão com as devidas concentrações a mistura foi agitada em Vórtex por 1 minuto e as amostras foram incubadas em banho-maria a 65 ºC por 30 minutos. Após a incubação, as amostras foram retiradas do banho-maria e resfriadas à temperatura ambiente. A seguir as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000 rpm, separando-se as fases orgânica e aquosa. A fase aquosa (sobrenadante) foi transferida para um novo tubo. Para a extração dos ácidos nucléicos, foi adicionado 700 µL de solvente orgânico clorofórmio: álcool isoamílico (24:1 v/v) com subsequente agitação por 1 minuto em vórtex. As amostras foram novamente submetidas à centrifugação por 10 minutos a 12.000 rpm, separando-se em duas fases. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado e transferido para um novo microtubo, no qual adicionou-se 500µL de isopropanol gelado, em seguida os tubos foram invertidos suavemente algumas vezes e incubados a -20 °C, por 3 horas para precipitação. Após este período, os tubos foram novamente centrifugados, a 12.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas vezes com etanol a 70 % e uma vez com etanol a 95 %, a cada lavagem as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 3 minutos. O precipitado foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em 40 µL de TE 0,1 mM (10 mM Tris-HCl; 1mM EDTA). Adicionou-se RNase, na concentração final de 40 µg/mL e incubou-se em banho-maria a 35 ºC, por 30 minutos. As amostras foram acondicionadas a 4°C para o uso posterior.
Função dos compostos:
· CTAB: tem se a função de romper a membrana celular devido a se ter uma grande afinidade com a moléculas de lipídios, mais do que entre os próprios lipídios, assim promovendo a lise.
· Tris HCl: tris(hidroximetil)aminometano(Tris) HCl é uma solução tampão cuja afinidade e manter o pH(8,0) constante
· EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético(EDTA) é um agente quelante ou seja consegue criar complexos muito estáveis com íons metálicos.
· PVP: Polivinilpirrolidona(PVP) é um polímero solúvel em água e outros solventes polares, ele é utilizado em extração de DNA de plantas por possuir efeito antioxidante, e é adicionado para evitar a oxidação de polifenóis. 
· β-mercaptoetanol: é um agente redutor que protege o DNA contra atividade enzimática. 
· Proteinase K: são enzimas que degradam proteínas em aminoácidos para que haja uma melhor remoção dessas substâncias. 
· Fenol-clorofórmio (álcool isoamílico): tem como função remover proteínas e aminoácidos do meio trabalhado.
· Isopropanol: também chamado de álcool isopropílico é utilizado para possa haver a precipitação e agregação do ácido nucléico.
· Etanol: utilizado para lavagem do precipitado que contem DNA, podendo ser várias lavagens com concentrações de DNA diferentes, sendo 70% e 95% usadas nesse protocolo.
· RNase: são enzimas que degradam o RNA, ou seja, deteriora o RNA em pedaços menores. 
· TE: solução composta por 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA.
Referência 
SILVA, Mezzalira da; DALBOSCO, Edinéia Zulian; BOTINI, Nádia; et al. “Protocolo para extração de DNA genômico da Anacardium giganteum w. HANCOCK EX ENGL. (ANACARDIACEAE)”.
Extração de DNA bacteriano
COMPARAÇÃO DE PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA NAS BACTÉRIAS E. COLI E PSEUDOMONAS SPP
Protocolo – 1: Extração com SDS:
As bactérias foram cultivadas em meio liquido antes para a preparação de pellets bacterianos. O pellet foi ressuspenso em 1000 μL de solução PBS e 2 μL de EDTA. Neste foi adicionado 60 μL de SDS 10%, e misturado com leve agitação e incubado à 60 °C durante 10 min, resfriado à temperatura ambiente. Neste foi adicionado 0,65 mL de fenol-clorofórmio, e agitado vigorosamente, centrifugado à 10.000 rpm durante 5 min, transferindo 500 μL da fase aquosa para outro tubo e realizado uma nova extração 500 μL fenol-clorofórmio, da fase aquosa foram retirados 500 μL e passado para um tubo novo e neste foi adicionado 10 μL de NaCl 5M, foi adicionado 300 μL de isopropanol, foi novamente centrifugar a 10.000 rpm durante 10 min e o precipitado de ácidos nucléicos lavados com etanol 70%.
Função dos compostos:
· Solução PBS: Phosphate buffered saline ou Tampão fosfato salino(PBS) é uma solução tampão, ou seja, ajuda a manter o pH constante na solução.
· EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético(EDTA) é um agente quelante ou seja consegue criar complexos muito estáveis com íons metálicos.
· SDS: Dodecil Sulfato de Sódio(SDS) é simplificadamente um detergente que tem como função reagir com moléculas lipídicas rompendo as membranas da célula liberando o conteúdo interno celular no meio.
· Fenol-clorofórmio (álcool isoamílico): tem como função remover proteínas e aminoácidos do meio trabalhado.
· NaCl 5M: ele é utilizado para anular as cargas negativas que o DNA detêm, permitindo que eles se reúnam em um aglomerado.
· Isopropanol: também chamado de álcool isopropílico é utilizado para possa haver a precipitação e agregação do ácido nucléico 
· Etanol: os ácidos nucléicos precipitados são lavados a álcool 70%
	
BONATTO, Felipe de Almeida; BREVE, Heliene Ana Moreno.“Comparação de protocolos de extração de DNA nas bactérias E. COLI e PSEUDOMONAS SPP”.
Extração de DNA animal
COMPARAÇÃO DE TRÊS PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA Chrysodeixis includens (WALKER, 1858) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE, PLUSIINAE)
Protocolo 1: O tecido foi homogeneizado em 600 µL tampão de extração (200 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM de EDTA, 2M NaCl, 20 mM de metabisulfito de sódio) em microtubo, 150 µL de L-loril sarcosyl 5% foi adicionado e incubado a 65 °C/ 5 min. Após, adicionou-se 7,5 µL de Proteinase K 10 mg mL-1, incubado por 65 °C/ 60 min, e centrifugado a 13.000 rpm/ 15 min. A fase superior foi transferida para novo microtubo e adicionado igual volume de clorofórmio/álcool isoamil (24:1) e centrifugada a 13.000 rpm/ 15 min. A fase aquosa foi transferida para novo microtubo e foi repetida a etapa clorofórmio/ álcool isoamil. RNAse 10 µg mL-1 foi adicionada e incubada a 37°C/ 30 min. O DNA foi precipitado com adição de 600 µL de isopropanol 100% e 405 µL de acetato de amônia 5 M, mantida durante a noite a 4 °C e centrifugada a 13.000 rpm/ 15 min. O pellet de DNA foi lavado com 400 µL de etanol 70%, centrifugado a 13.000 rpm/ 5 min. e seco ao ar.
Função dos compostos
· Tris-HCl: tris(hidroximetil)aminometano(Tris) HCl é uma solução tampão cuja afinidade e manter o pH(8,0) constante.
· EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético(EDTA) é um agente quelante ou seja consegue criar complexos muito estáveis com íons metálicos.
· NaCl: ele é utilizado para anular as cargas negativas que o DNA detêm, permitindo que eles se reúnam em um aglomerado.
· Metabisulfito de sódio: é um agente redutor, e agente antioxidante.
· Proteinase K: são enzimas que degradam proteínas em aminoácidos para que haja uma melhor remoção dessas substâncias.
· Clorofórmio (álcool isoamílico): tem como função remover proteínase aminoácidos do meio trabalhado.
· RNAse: são enzimas que degradam o RNA, ou seja, deteriora o RNA em pedaços menores.
· Isopropanol: também chamado de álcool isopropílico é utilizado para possa haver a precipitação e agregação do ácido nucléico.
· Acetato de amônia: também utilizado para a precipitação do DNA.
· Etanol: os ácidos nucléicos precipitados são lavados em etanol.
Referência 
PALMA, Janine.; GUEDES, Jerson Vanderlei Carús.; CAGLIARI, Deise.; et al. “Comparação de três protocolos de extração de dna para chrysodeixis Includens (walker, 1858) (lepidoptera: noctuidae, plusiinae)”.
Discussão de protocolos 
	 De acordo com cada tipo de ser vivo e necessário protocolos de extração de DNA diferentes, devido a cada tipo de animal, vegetal, bacteriano conter substâncias que talvez só se encontram em um determinado organismo, assim e necessário que haja alguns reagentes específicos para cada tipo de protocolo, como por exemplo a Polivinilpirrolidona(PVP) que é uma substancia utilizada na extração de DNA vegetal devido a ter efeitos antioxidantes, e assim é adicionado para evitar a oxidação de polifenóis, ou seja, dependendo de qual tipo de substâncias “lixo” haver no material que contenha DNA para extração, haverá diferentes tipos de reagentes e protocolos para tempos diferentes para que possa purificar com uma melhor qualidade o DNA no final do processo.