Relatório HPLC - G2N

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Universidade de São Paulo
FCF - Noturno
Química Analítica Instrumental
HPLC
Cromatografia a Líquido
Grupo 02 - Noturno
Bianca Lobão n°USP 9370841
Beatriz Medeiros n°USP 9328401
Letícia Freitas nºUSP 8971989
Witor Ferraz n°USP 7609641
Thaina Brumatti n°USP 8972076
São Paulo
Agosto de 2020
METODOLOGIA
• Separação
O objetivo é a separação de paracetamol, cafeína e ácido acetilsalicílico contidos em um
comprimido de analgésico.
Como todas as moléculas possuem ligações duplas conjugadas, entende-se que elas
absorvem radiação UV e então adota-se um detector espectrofotométrico para o método.
Como é provável que as espécies absorvam em regiões semelhantes do espectro UV, é
necessário realizar a separação dos analitos antes da detecção.
Cada uma dessas moléculas possui regiões hidrofóbicas, o que justifica a afinidade delas
por fase orgânica. Por conta disso, utiliza-se fase estacionária também hidrofóbica na
coluna (C18). Como utiliza-se como fase móvel dois solventes (água de pH 2,5 ajustado
com HCl e metanol, 40 e 60%, respectivamente), temos uma fase móvel mais polar que a
fase estacionária, então a separação será feita em modo de fase reversa.
A vazão utilizada será de 1mL/minuto e o detector UV foi ajustado para 230nm, o
equipamento À 30ºC e o tempo de análise de 10 minutos.
Para primeiro teste, a solução padrão com 3 analitos é injetada no aparelho, via injetor
automático, com um volume de amostra de 5µL, e o gráfico obtido, de absorbância por
tempo, é o seguinte:
Verifica-se que as substâncias encontram-se totalmente separadas, em tempo pouco maior
que 5 minutos. Toda a corrida foi realizada com composição de fase móvel fixa (modo
isocrático de análise).
• Qualificação
Com relação à amostra, um comprimido do medicamento foi pesado (massa = 1,070g) e
triturado. Em seguida, 0,1000 g desse material foi dissolvido em 1000 mL de fase móvel. A
solução foi então filtrada e uma alíquota transferida para um vial. Foram também
preparadas soluções padrão de alta pureza de cada um dos analitos de interesse.
Aqui, a corrida foi realizada também em condição isocrática A:B = 40:60, onde A seria a
água acidificada e B o metanol, em fluxo constante de 1 mL/min, num tempo total de 10
min. As amostras foram injetadas num volume de 5 μL, sendo a temperatura da coluna
programada para 30 ºC e o comprimento de onda para detecção dos analitos, 230 nm.
Quatro cromatogramas foram obtidos (1 da amostra a ser analisada e 3 com os respectivos
padrões)
No interior do aparelho, adiciona-se então a amostra a ser medida, e soluções padrão de
alta pureza dos analitos a serem identificados (paracetamol, AAS e cafeína). Configura-se
no software do aparelho que serão realizadas 4 medições e mede-se, primeiramente, a
amostra. Nesta, obtêm-se 3 picos, correspondentes aos analitos de interesse.
Depois da corrida com a amostra, faz-se a corrida com paracetamol, cafeína e AAS. Por
serem soluções de alta pureza, temos como resultado da corrida apenas 1 pico para cada
um dos analitos.
No software do aparelho de HPLC têm-se um programa de Tratamento de Dados. Neste
programa, consegue-se realizar a comparação do cromatograma obtido para a amostra com
cada um dos analitos. Dessa forma, conseguimos descobrir, qualitativamente, qual pico
corresponde a qual analito, por meio de sobreposição desses picos.
Após aplicar as configurações de sobreposição de picos para análise de cada um dos
analitos, e, levando em consideração que sabemos que nessa amostra temos somente
essas 3 substâncias discutidas, descobre-se, portanto, que o primeiro pico corresponde ao
paracetamol, o segundo à cafeína e o terceiro ao AAS.
Figura 1 - Sobreposição dos picos individuais na amostra
Figura 2 - Cromatograma de amostra de comprimido analgésico contendo paracetamol,
cafeína e ácido acetilsalicílico (AAS)
• Quantificação
Para poder se quantificar os valores das corridas e inferir as concentrações da amostra que
se deseja quantificar, é necessário que a intensidade do sinal da amostra seja comparada
com padrões de concentrações conhecidas dos analitos presentes. Preparou-se, assim, 5
soluções padrões para que a comparação e quantificação sejam realizadas.
Com os padrões preparados, coloca-se eles no injetor automático e se procede para as
determinações. Programa-se o injetor para realização das corridas automaticamente, e para
isso basta selecionar as soluções a serem submetidas a análise no programa.
As soluções padrões foram feitas da seguinte forma, e com esses valores se construiu uma
curva de calibração foi construída com os seguintes valores:
Após a corrida de todas as amostras, deve-se utilizar o software para tratamento dos dados
para quantificação. Sobrepondo cromatograma dos padrões é nítido que intensidade do
pico é aumentada sempre que um padrão de maior concentração é utilizado.
Ao se verificar que há linearidade entre os valores e que a diluição se adequa a curva de
calibração, podemos passar para etapa de integração dos picos, que é realizada também
pelo aparelho. Os valores obtidos se encontram na seguinte tabela:
Para construir uma equação da reta, pode-se utilizar tanto a área quanto a altura. Deve-se
construir uma equação de reta para cada substância e substituir os valores para obtenção
da concentração da amostra. Ainda, deve-se levar em conta a diluição (o volume no qual a
amostra foi solubilizada) para se calcular as quantidades de analitos presentes no
comprimido.
QUESTIONÁRIO
a. Qual a importância de fazer o condicionamento da coluna antes da corrida e a
limpeza após o seu uso?
O condicionamento prévio da coluna é necessário, pois podem haver traços de moléculas
de análises prévias que não foram devidamente purgadas pela falta de limpeza da coluna e
estas podem influenciar nos resultados de análises correntes. Erros por esta causa podem
ser desde aparecimento de picos não desejados no cromatograma até picos contaminantes
que podem formar pares críticos com as substâncias analisadas, o que pode gerar
dificuldades de medição de áreas de pico e diminuição de resoluções no cromatograma. A
limpeza após o uso do equipamento é necessária para que as moléculas analisadas neste
experimento não fiquem retidas na coluna e possam afetar as leituras de experimentos
futuros. Além disso, certas substâncias podem degradar a fase móvel da coluna, o que
inutilazaria a mesma.
b. Esquematize quais os principais componentes de um HPLC e explique a função de
cada um destes.
Componentes de um equipamento para HPLC. Para a realização da leitura de uma amostra
é necessária a aplicação de pressão por meio de uma bomba de duplo pistão do tipo
quaternária para gerar um fluxo da fase móvel. Este fluxo vem de um reservatório de
solventes, que fica disposto do lado de fora do equipamento, em proporção variável de
acordo com a ação da válvula solenóide. A fase móvel aspirada segue para
homogeneização e eluição da amostra, que é injetada por um injetor automático, e na
sequência segue para uma pré-coluna, que protege a coluna de substâncias possivelmente
nocivas, e então para a coluna cromatográfica, onde entrarão em contato com a fase
estacionária e haverá separação de compostos.
Em seguida, ocorre a saída das espécies em direção ao detector, no caso um
espectrofotométrico, que fará leitura de picos espectrofotométricos para um software de
gerenciamento e coleta de dados. As moléculas menos retidas, ou seja, que tiveram menor
interação com a fase estacionária, sairão mais rapidamente, enquanto as mais retidas, com
maior interação, sairão mais lentamente.
Existem casos em que o sistema de HPLC pode conter um forno acoplado, que condiciona
coluna e pré coluna. Há também uma válvula de purga próxima às bombas, que pode atuar
direcionando a amostra para análise ou para descarte. Após a amostra passar pelo
detector, ela segue para um descarte unificado com o do sistema de purga.
c. Por que é necessário desgaseificar a amostra e os solventes da fase móvel antes
da injeção/inserção no HPLC?
Solventes podem contergases dissolvidos e a presença destes pode interferir nas
medições e na obtenção dos picos por formarem bolhas. Desta forma, é necessário realizar
o processo de desgaseificação da amostra para minimizar estas interferências, que podem
alterar altura de picos ou gerar ruídos nas linhas de base.
d. Os experimentos foram realizados em fase normal ou fase reversa? Justifique
segundo as fases móvel e estacionária utilizadas. Explique também a escolha da fase
estacionária e dos solventes para compor a fase móvel (considere a estrutura dos
compostos analisados).
No experimento foi utilizada a cromatografia de fase reversa, onde a fase estacionária é não
polar, neste casa C18, e a fase móvel corresponde a um eluente de caráter polar, neste
caso uma mistura de onde 40% é água no pH = 2,5 (ajustado com HCl) e 60% Metanol.
Os compostos analisados tem uma boa partição octanol água, o que significa que eles
possuem maior afinidade pela fase orgânica, desta maneira, eles conseguirão interagir bem
com a fase móvel C18, mais apolar, e ter uma eluição em um tempo considerável para que
possa haver uma boa eluição e separação dos picos. Sobre a fase móvel temos que, para
que ocorra uma boa eluição em fase reversa devemos possuir uma fase móvel de caráter
mais polar para que essa possa eluir as moléculas analisadas em um bom intervalo de
tempo, pois, se a mesma fosse apolar os tempos em que as moléculas sairiam no detector
seria muito pequeno e com baixa eluição, devido a força do eluente em relação à fase
estacionária. Como as moléculas também possuem grupos ionizáveis o pH 2,5 pode causar
a ionização de certos grupos funcionais (aminas podem ser protonadas e gerarem cátions e
grupos fenóis e carboxilas ao serem protonados podem deixar de produzir ânions), tal efeito
é mais discutido na questão abaixo.
e. Justifique, a partir das características físico-químicas e estruturais dos compostos,
a ordem de eluição dos analitos alvo observada na parte 3 do experimento. Além da
forma mostrada no vídeo, como podemos proceder a confirmação da identidade de
cada um dos analitos? Discuta as diferenças entre os dois métodos.
A eluição dos analitos ocorrerá conforme a afinidade com a coluna estacionária. A coluna
utilizada é a C18, que é apolar, sendo assim, analitos apolares terão mais afinidade com
ela, o que implica em maior tempo para eluição, enquanto os analitos mais polares, terão
menos afinidade e serão eluídos mais rapidamente. De acordo com as interações
moleculares de cada composto, é possível dizer que o paracetamol é mais polar dadas às
condições do experimento, sua amina secundária protonada em pH2,5 é a responsável por
esta polaridade e possibilita que se elua com maior velocidade na fase móvel polar. A
cafeína também possui grupos que podem ser protonados e tornarem-se cátions, porém
esta possui um caráter mais polar que o paracetamol o que permite uma maior interação
com a fase estacionária polar que o paracetamol protonada e por isso ela é o pico do meio,
sendo seu pico projetado após o do paracetamol. O AAS é o mais apolar nas condições
deste experimentos, pois, por se tratar de um ácido orgânico fraco o mesmo se encontra
totalmente protonado em pH 2,5, estando em sua forma molecular, muito mais apolar que
as duas outras espécies, o que faz com que ele interaja mais fortemente com a fase
estacionária de C18 e apresente o maior tempo de eluição entre as três espécies, sendo
então o analito correspondente ao último pico.
f. Fazer a curva de calibração para o paracetamol (utilizando os dados obtidos do
cromatograma da parte 4 do experimento, apresentados na tabela 2), mostrando a
equação da reta (com coeficiente de determinação) e calcular sua concentração no
COMPRIMIDO analisado.
Utilizando os dados de concentração e área apresentados na tabela 2, construímos a
seguinte curva de calibração, com respectiva equação da reta:
Dada a equação da reta, substituímos a área do pico da amostra no lugar de y para então
encontrar a concentração:
231391 = 13100X - 4,6202
X = 17,664 mg/L
Sendo assim, a concentração da solução amostra é 17,664 mg/L. A solução amostra foi
preparada com 1L, então em 0,1g, que foi a massa pesada do comprimido na amostra, há
17,664 mg de paracetamol. Sendo a massa de um comprimido igual a 1,07g, podemos
então calcular a massa total de paracetamol em um comprimido:
17,664mg -> 0,1g
Z -> 1,07g
Z = 189,00mg
Desta forma, encontramos que no comprimido de 1,07g, tem-se 189,00mg de paracetamol.
g. Por que a quantificação da cafeína, paracetamol e AAS foi feita em um HPLC com
detector do tipo UV-Vis em 230 nm? Em sua justificativa considere a estrutura dos
compostos analisados.
Os compostos usados apresentam bastantes regiões de duplas conjugadas o que indica
que eles absorvem radiação no UV e possibilita que os comprimentos de onda utilizados
estejam dentro desta faixa e que, para medição, seja utilizado um detector
espectrofotométrico UV-Vis.
h. Calcular a eficiência da coluna (número de pratos teóricos) a partir do pico do
paracetamol no cromatograma obtido na parte 4 do experimento, apresentado na
figura a seguir (utilizar valores aproximados de tempo de retenção)
Utilizando a fórmula N = 5,55 (tr/w1/2)2 , onde N é o número de pratos teóricos, tr é o
tempo de retenção e w1/2 é a metade da largura da base do pico, e os dados
cedidos na parte 4 do vídeo do experimento dizem que o tr do pico do paracetamol é
de 3,372 minutos e que seu w1/2 pe de 0,092 minutos.
Desta forma, completando na fórmula temos que N = N = 5,55 (3,372/0,092)2 , com N
sendo 7455,769, ou em notação científica, aproximadamente 7,456 x 103 .