Colorimetria e espectrofotometria

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PAULA LARISSA LOYOLA SOUZA 
BLOCO VIDA ADULTA 
PL 1 - PATOLOGIA 
 
 Calorimétrico 
Definição de método colorimétrico
 Método que utiliza a cor para medir a concentração 
de um analito 
 
 
Faixa da luz visível 
 
 Nossos olhos são capazes de distinguir as 
diferentes ondas de comprimento da luz visível 
como cores diferentes 
 Cor é frequência!!! 
 A onda mais longa que conseguimos ver é o 
vermelho, as mais curtas são azul e violeta 
 Frequência maior: vermelho! 
 Frequência menor: roxo! 
 
 
Refração da luz branca 
(policromática) 
 As diferenças cores que formam a luz branca 
podem ser vistas quando um raio de luz é refratado 
por um prisma. 
 O prisma reflete os comprimentos de onda em 
diferentes faixas, e as dispersa em um espectro 
que pode ser visto – refração da luz branca 
Cores (Emissão x Absorção) 
 As substâncias emitem cores diferentes daquelas 
que elas absorvem. 
 As cores absorvidas e refletidas são ditas 
complementares 
 Se um objeto emite amarelo, a cor que ela mais 
absorve é sua cor complementar, ou seja, roxo 
 
 Se um objeto é verde, isso quer dizer que ele 
absorve todas as cores, exceto a cor verde, porque 
essa cor, ele EMITE! Ex: fotossíntese 
 Na reação colorimétrica, para analisar glicose, o 
produto formado é de cor vermelha. Então, no 
Método 
Absorbância, também chamada de absorvância, é a 
capacidade intrínseca dos materiais em absorver 
radiações em frequência específica. 
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aparelho, deve enviar para a solução a faixa VERDE 
(complementar ao vermelho) → verde é a faixa 
mais absorvida do vermelho 
Cores complementares: determinação do 
comprimento de onda para leitura 
 
Calorimetria/Espectrofotometria 
 Qual é a importância das cores absorvidas e 
refletidas no laboratório de análises clínicas? 
 
Espectrofotômetro 
 É um aparelho que faz passar um feixe de luz 
monocromática através de uma solução (que veio da 
reação colorimétrica), e mede a quantidade de luz 
que foi absorvida por essa solução (absorbância) 
 Dentro do aparelho existe um prisma, uma luz 
monocromática e a capacidade de você jogar na sua 
solução colorido somente a faixa de nm que você 
sabe que é complementar 
 
 Usando um prisma, o aparelho separa a luz em 
feixes com diferentes comprimentos de onda (nm), 
tal como acontece no arco-íris com a separação das 
cores da luz branca 
Componentes de um espectrofotômetro 
 Há uma solução, formada por uma reação 
colorimétria → Basicamente, é um conjunto de enzimas 
que reage com o analito. Quanto mais intensa essa cor, 
maior a concentração de analito na amostra 
 
 A) Luz emitente ou fonte luminosa 
 B) Filtro (convergência da luz branca) 
 C) Prisma 
 D) Selecionador de comprimento de onda 
(monocromador) 
 E) Cubeta para conter a solução a ser analisada 
 F) Receptor ou sistema fotométrico 
 G) Visor (Leitura da Absorbância) 
 
 
 
Calorimetria/Espectrofotometria 
 Metodologia que utiliza a luz (radiação 
eletromagnética) ABSORVIDA para medir a 
concentração de um analito. 
 Capacidade que o produto corado derivado de uma 
reação bioquímica tem de absorver luz em um 
determinado comprimento de onda, sob condições 
físico-químicas estabelecidas 
Lei de Lambert-Beer 
 Quando o caminho óptico é constante e igual a 1, a 
concentração do analito é diretamente 
proporcional à quantidade de luz absorvida 
 A absorção da luz é tanto maior quanto mais 
concentrada for a solução por ela atravessada 
 
 A absorbância é diretamente proporcional à 
concentração do composto na solução. 
 Na solução que há uma cor mais forte (ex: cinza 
escuro), quando joga uma faixa de luz, essa solução 
absorve muito mais luz e deixa passar (refletir) 
menos luz → o aparelho dá a metida de cor 
ABSORVIDA! 
Racional do Teste 
 A absorbância é proporcional à concentração da 
espécie química absorvente, sendo constante o 
Na Colorimetria, compara-se a intensidade 
da cor formada com a [ ] do analito 
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comprimento de onda, a espessura (caminho óptico) 
atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. 
 
 Verifica-se uma relação linear entre absorbância 
ou densidade ótica e concentração, e de uma 
relação logarítmica entre transmitância e 
concentração. 
 
 
 
 
Reações colorimétricas 
 Exemplo: dosagem de glicose 
 Glicose (soro) + Regente de cor (KIT): tampão fosfato 
contendo p-hidroxibenzoato, 4-aminoantipirina (4-
AAP), Glicose Oxidase (GOD) e Peroxidase (POD) 
 Processam-se as seguintes reações: 
 
 SABER: 
 O analito passa por reações enzimáticas 
para formar um produto de coloração 
marcante. 
 A intensidade da cor é proporcional à concentração 
do analito → mas, qual é a concentração do analito? 
Dosagens bioquímicas 
 Depois da reação colorimétricas 
 
 A cor vermelha (do produto formado) é medida no 
espectrofotômetro com absorção máxima no 
comprimento em 510nm. 
Determinação da concentração do analito: 
 A determinação é feita a partir da comparação da 
absorbância do teste com a absorbância obtida em 
uma solução padrão (da mesma substância 
conhecida) 
 
 Padrão ou calibrador: substância com 
concentração conhecida 
 Característica da solução padrão: 
 Ter estabilidade 
 Poder ser dissolvida em água e dessecada 
 Composição definida 
 Grau de pureza de 99% ou mais 
 No espectrofotômetro eu obtenho a absorbância 
da luz na solução padrão e no teste → → regra de 
3 simples 
 
𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 = 
𝑎𝑏𝑠. 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 𝑥 𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
𝑎𝑏𝑠. 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 
 
 Cálculo de FATOR DE CALIBRAÇÃO FC → isola a 
conc. Padrão e a abs. Padrão que é igual para 
bateria de exame 
𝐹𝐶 = 
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
 
 
Fator de calibração 
 O FC é um número fixo que ajuda a calcular a 
concentração do analito, quando se está 
trabalhando com várias amostras ao mesmo 
tempo. 
 FC x Abs.1 = concentração ( mg/dL, g/L) do analito 
na amostra 1. 
 FC x Abs.2 = concentração ( mg/dL, g/L) do 
analito na amostra 2. 
Como calcular a concentração 
de um analito na amostra do 
paciente? 
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 • FC x Abs.3 = concentração ( mg/dL, g/L) do analito 
na amostra 3. 
 
 
Uso da colorimetria/ 
espectrofotometria 
 Utilização nas dosagens bioquímicas: 
 Exemplos: glicose, uréia, creatinina, 
colesterol, triglicérides, enzimas, 
ferro sérico etc. 
 Hematologia: dosagem de hemoglobina 
 Sorologia: leitura final do método de ELISA 
quantitativa 
Vantagens da técnica 
 Rapidez e facilidade das medidas 
 Adequadas sensibilidade e especificidade 
 Aparelhos de baixo custo 
 Boa adaptação para automação, com execução em 
larga escala 
Automação: 
 Múltiplos testes; 
 Pipetagem automática 
 Rapidez 
 Precisão 
 Exatidão 
 Controle de qualidade 
 Menor volume de resíduos químicos → diminui a 
escala que são realizados os testes 
Causa de variações dos resultados 
dos exames laboratoriais: 
 Interferentes: fator que provoca a ocorrência de 
alterações no resultado de um exame qualquer 
(drogas, alimentos, exercícios etc.) 
 O médico deve conscientizar o paciente 
para não realizar algo interferente antes 
de realizar o exame 
 Ação dos interferentes: 
 Fisiológica 
 Química 
 Física 
Fisiológica 
 Alterações metabólicas que culminam com 
alterações do analito dosado 
 Estresse ↑ glicose; 
 Dieta rica em proteínas ↑ ureia 
 Exercício ↑ triglicérides 
Química 
 Ingestão de ácido ascórbico (vitamina C): ↓ glicose 
(GOD) 
 Ingestão de etanol: triglicérides, colesterol 
Física: 
 Soro lipêmico 
 Soro hemolisado 
 
Fases dos exames e potenciais 
problemas: 
 
 Fase pré-analítica (paciente): estresse, dieta do 
paciente, exercícios → 60/70%de problemas 
 Fase analítica: problema com o 
técnico/biomédico/farmacêutico 
 Fase de menor porcentagem de erros 
 Fase pós-analítica: entrega do laudo 
Interferentes: 
 
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Considerações: 
 O exame de laboratório, apesar das similaridades, 
não pode ser considerado como um processo 
fabril. 
 Cada material, cada amostra e cada teste têm 
particularidades que exigem cuidado, atenção e 
conhecimento específicos. 
 Os erros laboratoriais são uma ameaça à 
segurança do paciente com consequências graves 
(desde atrasos, necessidade de recoleta, 
prejuízo, até risco de morte) 
Teoria da prática 1 
Coleta de sangue: 
 Paramentação do coletor 
 Preparação do material 
 Procedimento (Início ao fim) 
 Assepsia 
 Anticoagulantes 
 Observações: (Interferentes como Estase 
venosa) 
 Descarte de resíduos biológicos 
 
Via Parenteral 
 Agulhas 
 
 
 
 
 
Sangue e seus constituintes 
 Tecido fluido circulante, formado por uma fase 
sólida diferenciadas e por uma fase líquida 
(acelular) denominada plasma 
 Plasma - plasmático 
 Soro = plasma – fibrinogênio * → sérico 
 Fibrinogênio é uma proteína plasmática que atua na 
coagulação sanguínea 
 Obtemos o soro colhendo o sangue em tubo sem 
anticoagulante 
As cores das tampas dos tubos a vácuo 
 
Teoria da prática 2 
Dosagem de glicose: 
 Material necessário: 
 Espectrofotômetro 
 Pipetas 
 Tubos de vidro 
 Suporte 
 Kit de glicose 
 1) identificar os tubos 
 Branco: usado para zerar o espectrofotômetro 
– normalmente água destilada ou reagente puro 
(quando este tem cor) – não tem analito nem 
padrão, só o reagente → 
 Padrão ou calibrador: substância de 
concentração conhecida 
 Amostra/teste: soro ou plasma do paciente 
 2) deixar os reagentes alcançarem a temperatura 
ambiente 
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 3) Pipetar o reagente nos tubos B, P e T 
 
 4) Pipetar o padrão no tubo P 
 
 5) pipetar a amostra no tubo T 
 
 6) Incubar os tubos em banho-maria a 37ºc por 15 
minutos 
 
 7) retirar os tubos da incubação ao fim do tempo 
marcado 
 
 8) ligar o espectrofotômetro e determinar a faixa de nm 
para leitura 
 
 9) preparar os frascos para leitura (limpeza externa da 
cubeta ou tubo) 
 
 10) zerar o espectrofotômetro com o branco 
 
 11) fazer a leitura da absorbância do padrão 
 
 Leitura: a densidade ótica (DO) ou absorbância 
do padrão da glicose cuja concentração é de 
100mg/dLl foi: 0,347 
 [padrão]= 100mg/dL (conhecida) 
 Abs. Do padrão: 0,347 (medida) 
 Esta leitura é anotada para os cálculos 
subsequentes; por exemplo, calcular o fator de 
calibração (FC) 
 12) Preparar cubeta ou tubo para leitura da amostra 
 
 13) Fazer a leitura da absorbância da amostra 
 
 Leitura: a densidade ótica (DO) ou absorbância 
da amostra foi de 0,341 
 [Padrão] = 100mg/dL (conhecida) 
 Abs. do Padrão = 0,347 (medida) 
 Abs. da Amostra = 0,341 (medida) 
 Esta leitura é anotada também, para 
calcularmos a concentração da amostra 
Cálculos 
Dosagem de glicose na amostra 
 Fator de calibração 𝐹𝐶 = 
100 𝑚𝑔/𝑑𝐿
𝑎𝑏𝑠.𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
 
 𝐹𝑐 = 
100𝑚𝑔/𝑑𝐿
0,347
 
 𝐹𝑐 = 288,2 
 Concentração da amostra: 288,2 x 0,341 = 98,3 mg/dL 
 O valor de referência (VR) da glicose é: 70 a 99 mg/dL 
 A concentração de glicose na amostra é: 98,3 mg/dL