Apoptose: Morte Celular Programada

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Histologi� -mo�03 Marin� Ferreir� Magalhãe� - 3P
“APOPTOSE”
É a lesão em que a célula é estimulada a acionar mecanismos que culminam com a sua morte. Diferentemente da
necrose, a célula em apoptose não sofre autólise nem ruptura da membrana citoplasmática; a célula morta é
fragmentada, e os seus fragmentos ficam envolvidos pela membrana citoplasmática e são endocitados por células
vizinhas, sem provocar quimiotaxia nem ativar células fagocitárias (a apoptose não induz inflamação).
A apoptose tem enorme importância em momentos funcionais e em inúmeras doenças. Além de ser lesão frequente
em muitas enfermidades, a apoptose (ou a sua falta) está na base de alguns processos patológicos: (1) apoptose tem
sido considerada a lesão básica de algumas doenças neurodegenerativas (p. ex., doença de Alzheimer, doença de
Parkinson), pois é responsável pela perda de células suficiente para provocar danos funcionais; (2) redução da apoptose
parece importante na progressão de neoplasias; em algumas, como o linfoma de células B, o mecanismo patogenético
mais provável para o aumento da população celular é a falta de apoptose em células linfóides; (3) apoptose pode estar
na base de doenças autoimunes.
Apoptose é uma forma de morte celular muito frequente, tanto em estados fisiológicos (morte programada) quanto
patológicos (morte acidental ou regulada). Como morte programada, ela é importante na remodelação de órgãos
durante a embriogênese e na vida pós-natal. Um bom exemplo é o das glândulas mamárias: terminada a fase de
lactação, as células dos ácinos que proliferaram e secretaram leite entram em apoptose, ficando apenas as células dos
ductos mamários. No caso, a cessação dos estímulos hormonais que mantinham a secreção do leite desencadeia sinais
para ativar a apoptose. De modo semelhante, os linfócitos que proliferam após estimulação antigênica tendem a entrar
em apoptose cessado o estímulo ou quando o estímulo é inadequado.
A apoptose que ocorre em condições patológicas é causada por inúmeros agentes, como vírus, hipóxia, radicais
livres, substâncias químicas, agressão imunitária e radiações ionizantes. Além desses, a apoptose ocorre em muitas
condições sem que se saiba ao certo o agente indutor. As principais condições em que acontece apoptose são: (1) falta
de fatores de crescimento, como ocorre em células dependentes de hormônios quando estes não estão disponíveis ou
em linfócitos que não recebem estímulo de citocinas; (2) lesão no DNA, por radiações, medicamentos antineoplásicos,
radicais livres etc.; (3) estresse no retículo endoplasmático, por defeitos no dobramento de proteínas; (4) ação de linfócitos
T citotóxicos; (5) ativação de receptores que têm o domínio de morte, como acontece na eliminação de linfócitos
autorreatores. Redução da apoptose, por outro lado, pode estar envolvida no aparecimento de alguns cânceres.
Como afeta células individualmente, a apoptose não é facilmente reconhecida em exames microscópicos rotineiros.
A célula encolhe-se e o citoplasma fica mais denso; a cromatina torna-se condensada e forma grumos junto à
membrana nuclear (núcleos em meia-lua, em pata de cavalo e em lança). Em seguida, o núcleo se fragmenta (cariorrexe)
e a membrana citoplasmática forma brotamentos que contêm fragmentos do núcleo. Os múltiplos brotos constituem os
corpos apoptóticos, que geralmente são endocitados por células vizinhas. Algumas vezes, a célula apoptótica sofre
apenas encolhimento e condensação do citoplasma e do núcleo, sem fragmentar-se. Os corpos apoptóticos aparecem
como pequenos corpúsculos basófilos, quando contêm grande fragmento nuclear, ou acidófilos, quando formados
apenas por fragmento de citoplasma condensado. Em preparações de rotina, em geral não é fácil identificá-los; são
facilmente vistos nos centros germinativos de linfonodos, onde são endocitados por macrófagos. Em hepatites virais, são
vistos hepatócitos encarquilhados, com citoplasma muito condensado e acidófilo, conhecidos como corpúsculos de
Councilman-Rocha Lima.
A apoptose resulta da ativação sequencial de proteases (sobretudo, caspases), que são responsáveis pelas
alterações morfológicas características da lesão. Caspases são enzimas que possuem cisteína no sítio ativo e que clivam
proteínas em sítios com resíduos de ácido aspártico. Caspases são produzidas como pró-caspases e ativadas pelo
desligamento de uma molécula inibidora ou por clivagem proteolítica em sítios com ácido aspártico. Em humanos, são
conhecidas 12 caspases, nem todas associadas a apoptose: as caspases 1, 4 e 5, por exemplo, clivam a pró-IL-1 e a
pró-IL-18 e são importantes na reação inflamatória. As caspases envolvidas na apoptose podem ser ativadoras
(caspases 8, 9 e 10) ou efetuadoras (caspases 3, 6 e 7). As caspases ativadoras ativam as caspases 3, 6 e 7, que, por sua
vez, ativam outras proteases que degradam diferentes substratos da célula, como DNA, laminas nucleares, PARP e
proteínas do citoesqueleto. A ativação de caspases, que é o evento-chave no processo, pode ocorrer por: (a)
mecanismos extrínsecos, dependentes de estímulos externos que são reconhecidos e propagados por receptores da
membrana citoplasmática que possuem domínios de morte (apoptose extrínseca); (b) mecanismos intrínsecos, que
aumentam a permeabilidade mitocondrial, com liberação no citosol de moléculas que induzem o processo (apoptose
intrínseca); (c) agentes que atuam diretamente na membrana citoplasmática, mas sem envolver receptores com domínio
de morte. As mitocôndrias têm papel essencial na apoptose. Quando agredidas por inúmeros agentes (lesões no DNA,
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radicais livres, estresse no RE), ocorre aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial externa, com liberação de
moléculas pró-apoptóticas no citosol: (1) citocromo c, que se associa no citosol à APAF 1 (apoptosis protease activating
factor 1), formando o complexo denominado apoptossomo (este ativa a caspase 9, iniciando a apoptose); (2) proteína
SMAC (também chamada Diablo). No citosol, existem inibidores naturais da apoptose da família IAP. No citosol, a SMAC
inibe a IAP, permitindo a ativação de caspases; (3) AIF (apoptopsis inducing factor), que ativa a caspase 9 e algumas
endonucleases; (4) OMI/HTRA2 (high temperature requirement protein A2), protease que induz apoptose por inibir a IAP;
(5) endonuclease G, que ativa endonucleases e pode induzir apoptose independentemente da ativação de caspases
(apoptose intrínseca independente de caspases).
Muitas proteínas citosólicas atuam estimulando ou inibindo a apoptose:
● A família BCL (B cell lymphoma) inclui 23 proteínas, inibidoras (antiapoptóticas) ou ativadoras
(pró-apoptóticas) da apoptose. As proteínas antiapoptóticas, como BCL-2 e BCL-XL, localizam-se
especialmente na membrana mitocondrial externa, onde fazem parte dos poros de permeabilidade
transicional; normalmente, tais poros são impermeáveis. As proteínas pró-apoptóticas, conhecidas em
conjunto como proteínas BAX (BIM, BAD, BID, NOXA, entre outras), têm um domínio de dimerização BH3
que as liga a proteínas antiapoptóticas (BCL-2 e BCL-XL). Quando ocorre tal ligação, os poros da
membrana mitocondrial externa se abrem, permitindo a saída de citocromo c, SMAC e AIF, que ativam
caspases no citosol;
● As proteínas IAP (inhibitor of apoptosis proteins) inibem as caspases 3, 7 e 9. A caspase 9 fica normalmente
inibida pela IAP; sem esta, a caspase é ativa e desencadeia os passos seguintes do processo. Algumas IAP
são expressas em grande quantidade em células cancerosas, sendo esse um dos motivos que facilitam a
sobrevivência dessas células;
● As proteínas BAD, BIM, BID, Puma e Noxa atuam como sensores de agressão celular; quando estimuladas,
regulam a ação das proteínas pró ou antiapoptóticas; e
● A proteína p53 atua na manutenção da integridadedo genoma e na sobrevivência das células, esta
mediante ação pró-apoptótica. Quando o genoma é agredido por agentes diversos, a célula aumenta a
síntese de p53, a qual induz parada do ciclo celular. Se o defeito no DNA é reparado, a célula permanece
viável; se não é corrigido, a p53 induz apoptose por meio de: (1) ativação de genes cujos produtos são
pró-apoptóticos (p. ex., BAX); (2) inibição da expressão de proteínas antiapoptóticas (p. ex., BCL-2); (3)
inibição de IAP. A p53, portanto, cumpre papel essencial na manutenção da integridade celular, mediante
indução de mecanismos de reparo ou, quando necessário, de morte celular.
Apoptose extrínseca por estímulos em receptores com domínios de morte: os receptores com domínio de morte
pertencem à família do receptor do TNF, quando são ativados pelos agonistas expõem domínios de morte recrutando
proteínas para formar uma plataforma ativadora de caspase 8 ou 10. A caspase 8 a atividade de proteases e
consequentemente a permeabilidade mitocondrial. O receptor para o TNF-α tem comportamento intrigante;
dependendo da proteína de adaptação e das proteínas disponíveis no citosol para formar a plataforma molecular, pode
induzir apoptose, estimular rotas pró-inflamatórias, de proliferação celular e de sobrevivência das células (antiapoptose)
ou causar necrose regulada.
Apoptose extrínseca por falta de estímulo de receptores de dependência: quando estimulados por seus agonistas,
tais receptores (p. ex., receptor Patched, DCC) induzem vias de sobrevivência; na falta do agonista, os receptores ativam
vias que induzem apoptose: recrutam proteínas que formam plataformas ativadoras da caspase 9. A apoptose induzida
pela perda de ancoragem (anoiquia), descrita a seguir, pode ser incluída neste grupo. As moléculas que ligam as células
à MEC (integrinas) ou a outras células (caderinas) associam-se a proteínas do citoesqueleto e a outras proteínas do
citosol para formar os focos de adesão celular. Nesses focos, existem cinases (FAK) que ativam vias de sobrevivência.
Algumas proteínas associadas a integrinas nos focos de adesão, como a anquirina, têm domínio de morte. Quando a
integrina se solta de moléculas da matriz extracelular: (1) a proteína do citoesqueleto com domínio de morte torna-se
ativada e inicia a ativação de caspases; (2) as FAK tornam-se desativadas, reduzindo os estímulos antiapoptóticos. Esse
tipo de apoptose, induzida pela perda de ligação de células à matriz extracelular ou a outra célula é denominada, em
inglês, anoikis, palavra cujo radical grego significa sem casa, sem localização.
Apoptose intrínseca por agressão à membrana mitocondrial: em inúmeras situações, a membrana mitocondrial
torna-se permeável a moléculas pró-apoptóticas existentes no espaço intermembranoso, permitindo sua saída para o
citosol. Tal ocorre por: (1) ação de substâncias que interferem na integridade da camada lipídica (p. ex., hipóxia, radicais
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livres, aumento de Ca++, ácidos biliares apolares, ésteres de etanol com ácidos graxos e alguns medicamentos
quimioterápicos); (2) agressão ao DNA (p. ex., radiações ionizantes, luz ultravioleta, radicais livres, agentes genotóxicos
etc.); (3) estresse do retículo endoplasmático.
Apoptose intrínseca independente de caspase: alteração na permeabilidade da membrana mitocondrial externa
libera OMI, EndoG e AIF. AIF induz condensação da cromatina, enquanto EndoG promove fragmentação do DNA, mas
sem fragmentação do núcleo. A célula morre, com volume reduzido, núcleo condensado e cromatina agrupada na
membrana nuclear, mas sem cariorrexe; trata-se de morte celular em parte semelhante a apoptose, mas feita sem
ativação de caspases. Tal processo ocorre em algumas infecções virais em que os vírus inibem as caspases.
Apoptose por outros estímulos na membrana citoplasmática: radicais livres e radiações também provocam
apoptose quando atuam na membrana citoplasmática e ativam a esfingomielinase, liberando ceramida. Esta induz
apoptose por: (a) inativação de inibidores das caspases 8 e 9, ativando-as; (b) ativação de p38 e JNK, que ativam fatores
de transcrição de genes BCL pró-apoptóticos.
Apoptose induzida por granzimas de linfócitos citotóxico: linfócitos T citotóxicos (que reconhecem antígenos na
superfície de células infectadas) matam-nas mediante liberação de perfurinas e granzimas; perfurinas permeabilizam a
membrana da célula-alvo, o que permite a entrada de granzimas. As granzimas B induzem apoptose porque: (a) ativam a
caspase 10; (b) clivam a molécula BID, que promove permeabilização de mitocôndrias e liberação de fatores apoptóticos;
(c) ativam diretamente a caspase 3. Como descrito nas diferentes vias patogenéticas da apoptose, muitas vezes elas
estão inter-relacionadas e atuam simultaneamente. O aumento da permeabilidade mitocondrial, por exemplo, com a
saída de moléculas que iniciam a apoptose, é evento frequente após agressões muito distintas.
Mecanismos das alterações morfológicas: na apoptose, ocorrem alterações em membranas, no citoplasma e no
núcleo. A formação de brotamentos na membrana citoplasmática depende de alterações no citoesqueleto e em
proteínas que formam a sustentação da face interna da membrana citoplasmática (espectrinas e anquirinas). O
descolamento da célula da matriz extracelular ou de células vizinhas deve-se em parte à desorganização do
citoesqueleto, com desarranjo nos pontos de adesão. A retração do citoplasma, que se torna mais denso, deve-se à
eliminação de água e à reorganização do citoesqueleto. As alterações nucleares, incluindo picnose e cariorrexe,
dependem das caspases 3 e 7, que ativam proteases que degradam proteínas nucleares. A atividade proteolítica no
núcleo leva a: (1) degradação de proteínas que formam o citoesqueleto nuclear; (2) fosforilação e acetilação de histonas,
favorecendo a desorganização da cromatina, que se desloca para a periferia e sofre condensação (picnose); (3)
proteólise parcial de lâminas, que desorganiza a sustentação do envelope, favorecendo a fragmentação do núcleo
(cariorrexe); (4) proteólise de proteínas inibidoras de DNAses (ICAD), que resulta na ativação de endonucleases que clivam
o DNA internucleossomal (CAD), gerando fragmentos com 200 pares de bases ou seus múltiplos.
Autoimunidade: uma hipótese de autoimunidade admite que material intracelular liberado por células mortas
comporta-se como autoantígenos. Como na apoptose a morte celular ocorre sem autólise (sem desintegração
molecular), os potenciais autoantígenos ficam mais preservados, podendo os corpos apoptóticos livres ser fonte de
sensibilização. Redução na endocitose de corpos apoptóticos é descrita no lúpus eritematoso sistêmico, admitindo-se
ser esse um mecanismo que favorece maior exposição de autoantígenos. Além disso, corpos apoptóticos endocitados
por células dendríticas são processados e apresentados via MHC II, o que libera citocinas pró-inflamatórias (p. ex., IL-1 e
TNF-α) capazes de ativar linfóticos T CD4+. Ademais, algumas proteínas nucleares antigênicas (p. ex., SNURP) sofrem
modificações na apoptose, o que poderia facilitar a exposição de antígenos crípticos e a quebra de tolerância. Por outro
lado, deficiência de apoptose pode reduzir a eliminação de linfócitos autorreatores. Por tudo isso, anormalidades na
apoptose podem estar associadas a doenças autoimunes: pela possibilidade de expor autoantígenos ou por defeito na
eliminação de linfócitos autorreatores.
Apoptose X Necrose: apoptose e necrose são duas lesões com margens que se tocam e se confundem. Muitas
agressões podem induzir tanto apoptose quanto necrose, e, muitas vezes, os dois processos coexistem. Após uma
agressão, a decisão da célula de entrar em apoptose ou de sobreviver depende da intensidade e da qualidade da
agressão e dos receptores acionados. A produção de mensageiros a partir de lipídeos de membrana parece ser um fator
crucial na determinação de rotasde ativação de sobrevivência ou de apoptose: a ativação de esfingomielinase gera
ceramida, que induz apoptose. A ativação de outras fosfolipases (p. ex., fosfolipase C) gera diacilglicerol, ativador da
proteinocinase C, grande indutora de rotas de sobrevivência. Como a apoptose depende de ATP, as agressões que a
provocam não podem bloquear completamente a produção de energia. Se o ATP se reduz muito, surge necrose. Nesta,
há aumento da permeabilidade de lisossomos, elemento fundamental na autólise. Admite-se que uma agressão pode,
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inicialmente, induzir apoptose; se esta é interrompida ou não se completa, pode evoluir para necrose. Na necrose
caseosa da tuberculose, esse fato é bem evidente: há aumento da expressão de proteínas pró-apoptóticas, e,
morfologicamente, a cariorrexe é fenômeno dominante (poeira nuclear na periferia da necrose). Por outro lado, na
necrose caseosa também existe cariólise abundante (típico fenômeno de autólise, portanto de necrose). É possível que a
“necrose” caseosa compacta das lesões ainda fechadas seja, predominantemente, um processo de apoptose que
depois evolui para liquefação, com os achados típicos de necrose (autólise).
Necrose regulada (necroptose): é uma forma de morte celular que tem características tanto de necrose como de
apoptose: tem aspecto morfológico de necrose, mas não se associa a ativação de caspases e pode ser bloqueada por
fármacos ou por inibição gênica. Necroptose ocorre em situações fisiológicas ou patológicas; nestas, em
esteato-hepatites, pancreatite aguda e doenças neurodegenerativas. A lesão é encontrada em certas infecções virais,
por ativação de receptores com domínio da morte (família TNFR), após agressão por radicais livres, substâncias tóxicas,
hipóxia ou por sobrecarga de Ca++. Necroptose pode ser induzida ainda por vias que ativam a ciclofilina D, proteína que
atua na formação de poro de permeabilidade mitocondrial que leva a necrose (essa necrose pode ser inibida por
fármacos, como a ciclofilina A, que inibem a ciclofilina D). Necroptose associa-se também a ativação de receptores com
domínio de morte, mas sem ativar caspases.
Autofagia: estudos in vitro mostram que células em autofagia podem morrer, sem ativar caspases e sem sofrer
autólise. Os aspectos morfológicos são diferentes da apoptose e da necrose, não havendo condensação nem
fragmentação da cromatina. Autofagia é encontrada em neurônios e pode associar-se à progressão de doenças
neurodegenerativas.
Piroptose: é a morte celular inicialmente descrita em macrófagos infectados com salmonelas, mas encontrada
também em infecções por diferentes bactérias. Caracteriza-se por vacuolização mitocondrial e do retículo
endoplasmático e formação de bolhas e rupturas na membrana citoplasmática. Piroptose associa-se à ativação da
caspase 1 por inflamassomos, embora os mecanismos de morte celular sejam pouco conhecidos.