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Genética Microbiana: Hereditariedade e Mutações
· Como definir a genética? 
· Genética é o estudo dos genes, a genética abrange o estudo da organização, replicação, transferência e regulação e da variação do material genético.
· Os genes são sequencias de DNA responsáveis pela hereditariedade 
· Alguns vírus possuem exceção, pois apresentam o RNA como o material genético. 
· A estabilidade do material genético é importante para manutenção do genoma, para que os descendentes preservem as características dos pais.
· São as variações que podem permitem um organismo de sobreviver as condições que ocorrem no ambiente.
· Por que estudar genética de bactérias? 
· Existem bactérias benéficas que são usadas na produção de alimentos ou na promoção de crescimento de plantas e animais. Mas também existem bactérias que são prejudiciais aos seres humanos, por exemplos as que deterioram alimentos ou que provocam doenças.
· A compreensão da genética dessas bactérias, nos ajuda a melhorar aquelas que nos beneficiam e a controlar aquelas que nos prejudicam. 
· Por que as bactérias são organismos ideais para estudos genéticos? 
· As bactérias apresentam tempo de geração curto, crescem em meio de cultura relativamente barato, apresentam genoma pequeno, são organismo haploides (o que facilita a detecção de mutantes) e milhões de bactérias podem ser cultivadas em um espaço pequeno.
· Características do cromossomo bacteriano. 
· Molécula de DNA fita-dupla e circular. 
· Replicação semiconservativa.
· Ausência de membrana nucelas.
· Cada bactéria apresenta um cromossomo. 
· Bactérias apresentam elementos genético extra cromossômicos, em geral circulares, constituídos de DNA fita-dupla, estes, são chamados de Plasmídeos.
· Transferência de informação genética entre bactérias.
· A informação genética está presente no DNA que constitui o cromossomo, o cromossomo e replicado e transferido para as células filhas de maneira que cada filha irá receber uma cópia do cromossomo da célula parental. 
· A informação presente nos genes será transferida para um RNA, no processo de transcrição. Esse RNA pode ser mensageiro, ribossômico, transportador ou pequenos RNAS.
· O RNA mensageiro será traduzido em uma sequência de aminoácidos, este processo é chamado de tradução. 
· A transferência de células parentais para células filhas é chamada: transferência vertical. 
· Quando a informação genética é transferida para células do mesmo ambiente: transferência horizontal.
· Bactérias de espécies diferentes podem trocar material genético pela transferência horizontal.
· Replicação do DNA. 
· Organização do DNA.
· Replicação semiconservativa. 
· Complementariedade de bases.
· Enzimas envolvidas na replicação: DNA polimerase, DNA ligase, entre outras. 
· A replicação correta do DNA, permite a transferência de um cromossomo igual para cada célula filha. Nesse cromossomo estão os genes que serão transcritos em RNA que apresentaram as informações contidas no DNA. Os RNAs mensageiros serão traduzidos em proteínas, isso significa que cada bactéria filha terá a capacidade de sintetizar todas as proteínas pela bactéria parietal.
· Componentes do DNA.
· O DNA apresenta unidades de nucleotídeos repetidas, cada nucleotídeo é constituído por uma base nitrogenada (adenina, citosina, guanina ou timina), uma desoxirribose e um grupo fosfato.
· O RNA também é formado por unidades, os ribonucleotídeos, cada ribonucleotídeos é formado por uma base nitrogenada (adenina, citosina, timina e uracila), uma ribose e um grupo fosfato. 
· Replicação semiconservativa do cromossomo 
· O DNA está organizado em uma dupla hélice, e apresenta duas fitas antiparalelas. 
· As duas fitas são unidas por ligação de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.
· Os nucleotídeos são ligados entre si através da ligação açúcar fosfato.
· O paramento das bases é especifico, de maneira que uma adenina pareia sempre com uma timina e uma citosina pareia com uma guanina. Assim, a sequência de bases de uma fita molde, determina a sequência de base da fita que está sendo sintetizada. Existe portanto, uma complementariedade de bases, e é esta que garante que no final do processo de replicação do DNA, serão produzidas duas moléculas iguais, isto é com a mesma sequência de bases. 
· Cada molécula de DNA formada, apresenta uma fita antiga e uma fita recém-formada. Por causa disso o processo da formação do DNA é chamado de semiconservativo. 
· É nessa sequência de bases que está em formação genética, que organizada em um código será lida e traduzida em uma sequência de aminoácidos. 
· O local onde as duas fitas se separam e começa o processo de replicação é chamado: forquilha de replicação. 
· Várias enzimas fazem parte do processo de replicação do DNA, como: DNA-polimerase (responsável pela união dos nucleotídeos), DNA-girase (relaxa o super enovelamento do DNA), DNA-helicase (separa as duplas fitas do DNA), entre outras.
· Replicação semiconservativa do cromossomo 
· As fitas de DNA são paralelas e se ligam no sentido 5’ 3’.
· Os nucleotídeos adicionados inicialmente na fita, são chamados de nucleosídeos trifosfatados.
· Na incorporação dos nucleotídeos, dois grupos fosfatos são retirados e esta hidrolise fornece energia para as novas ligações.
· As diferentes proteínas envolvidas no processo de replicação do DNA, estão posicionadas na forquilha de replicação.
· Devido a capacidade da DNA-polimerase de adicionar nucleotídeos apenas na extremidade 3’, uma fita é produzida de forma continua (fita líder) e a outra é produzida de forma descontinua através de fragmentos de Okazaki (fita retardada). 
· Para o início da replicação é produzido um RNA-iniciador, e é a partir dele que a DNA-polimerase sintetiza as fitas complementares.
· A replicação é um processo preciso, e em geral ocorre um erro a cada 10 milhões de bases incorporadas. 
· A replicação do cromossomo bacteriano tem origem em um sitio chamado de ‘’origem de replicação”.
· No cromossomo de Escherichia Coli, a replicação ocorre de maneira bidirecional, apresentado duas forquilhas que caminham em direções opostas. Como o cromossomo é circular, no final do processo as duas forquilhas se encontram finalizando a replicação. 
· As duas fitas são separadas por uma enzima topoisomerase. 
 
· Transcrição 
· A informação genética presente no DNA é copiada em uma sequência de RNA, que terá bases complementares presente no DNA molde.
· O RNA mensageiro transporta a informação contida no gene, que será posteriormente traduzida. 
· Participação de RNA polimerase DNA dependente.
· O RNA é produzido no sentido 5’3’
· Os genes representam unidade básica da hereditariedade e apresentam regiões reguladores e codificadoras. 
· Participação de RNA polimerase DNA dependente. 
· Código genético 
· As informações contidas no DNA e transferidas no RNA mensageiro, estão organizadas em códigos, denominados “códigos genéticos”, que estabelece uma relação em trincas de bases nitrogenadas, códons e aminoácido. 
· Cada três bases, corresponde a um aminoácido, porem existe um códon iniciador (AUG) e três sem sentido (UAA, UAG, UGA) estes, não codificam qualquer aminoácido e determinam a finalização das cadeias polipeptídicas. 
· As bases que forma os códons são complementares as bases que formam os anticódons que são carregados pelo RNA transportados, havendo no enteando uma oscilação no reconhecimento da terceira base, que tem como consequência a possibilidade de mais de um códon codificar para o mesmo aminoácido. 
· Processo de transcrição 
· Para dar início ao processo, a RNA polimerase irá se ligar ao promotor que dará início a abertura das fitas. 
· A RNA polimerase é responsável polimerização de ribonucleotídeos que terão bases complementares encontradas no DNA molde.
· Quando a RNA polimerase atinge o sinal de terminação, ela irá se dissociar do DNA e o RNA mensageiro será liberado. 
· Ao final da transcrição as duas fitas se associam novamente formando a fita de DNA.
· Tradução 
· É o processo de síntese proteica onde a informação contidano RNAm é traduzida em uma sequência de aminoácidos. 
· RNAm
· Ribossomos (são formados por RNA ribossômico e proteínas) 
· RNAt- anticódon 
· A maioria dos aminoácidos é codificado por mais de um códon. 
· O processo de tradução se inicia com as subunidades maiores e menores. 
1. O RNAt carrega o aminoácido metionina e o anticódon UAC ocupam o sitio P no ribossomo. 
2. RNAt 
· Transcrição e tradução em bactérias 
· Esses processos em bactérias podem ocorrer ao mesmo tempo
· O RNAm que está sendo transcrito pode ser imediatamente traduzido, isso não é possível em organismos eucariotos, onde a transcrição ocorre dentro do núcleo e a tradução no citoplasma. 
· Genótipo: conjunto de genes de um organismo, representa todo o material genético. 
· Alterações genotípicas 
· Mutações é uma modificação na sequência de nucleotídeos do DNA, consequentemente na sequência de bases. É uma alteração de consequência rara e dificilmente reversível. A mutação so poderá ser revertida na ocorrência de uma segunda mutação. Pode ser dividida em duas: 
- Mutação de ponto: é a substituição de um par de nucleotídeos em um DNA. 
- Podem ser divididas em: 
1. Mutação de sentido trocado, missense ou errônea: quando ocorre a substituição de um par de bases, levando a substituição de um aminoácido na proteína.
2. Mutação sem sentido ou nonsense: proteína incompleta, pois os três códons UAA, UAG e UGA são chamados códons sem sentido 
3. Mutação silenciosa: proteína normal 
· Na tradução, o primeiro códon a ser traduzido é AUG e a partir dele, as trincas de base serão traduzidas determinando a sequência de aminoácidos. Essa organização das bases é denominada Alteração de fase de leitura.
· A introdução ou a retirada de nucleotídeos da região codificadora do gene leva a modificação da sequência de bases no DNA e consequentemente no RNAm, modificando os códons que serão traduzidos.
· A partir do local de inserção todos os aminoácidos poderão ser codificados.
· Fenótipo 
· As alterações fenotípicas são reversíveis, ocorrem na maior parte da população e não envolvem modificações na sequência de bases do DNA.
· Alterações reversíveis: produção de pigmento em Serratia marcescens. Quando a bactéria é cultivada em temperaturas de 28 graus, ela produz um pigmento vermelho, mas quando a bactéria é cultivada em 37 graus, esse pigmento não é produzido. 
· Hereditariedade e Mutações 
· Por que isolamos e caracterizamos mutantes?
- Porque o isolamento e a análise de mutantes podem revelar genes essenciais que codificam proteínas que participam de diferentes processos celulares, ou fatores de patogenicidade que podem ser alvo para o controle de patógenos. 
- A mutação também pode ser empregada no melhoramento genético de bactérias beneficiadas, como por exemplo as bactérias produtoras de antimicrobianos. 
- Diferentes antibióticos são produzidos por bactérias, e essa produção pode ser melhorada por meio da mutação. 
· Agentes Mutagênicos 
· A mutação espontânea é um evento raro, a taxa de mutação em bactérias é de 0,003 mutações por genoma por geração, por causa disso são utilizados agentes mutagênicos para aumentar a taxa de mutação. 
· Um agente mutagênico pode aumentar de 10 a 1000 vezes a taxa de mutação
· Agentes físicos: luz ultravioleta 
· Agente químico: ácido nitroso
· Agente biológico: elementos transponíveis
· Efeito da luz ultravioleta e mecanismo de reparo 
· O comprimento de onda de 260nm, provoca alterações no DNA e principalmente a formação de dímeros de timina.
· A presença dos dímeros de timina impede a replicação e a transcrição do DNA.
· Para conseguir replicar o DNA que possui dímeros de timina, a célula utiliza a DNA-polimerase sujeitas a erros que podem não respeitar a complementariedade de bases, levando a ocorrência de mutação. Por causa disso, as células apresentam um sistema de reparo do DNA, um desses sistemas é por reparo de nucleotídeo, que retira a região do dímero e faz a fita do DNA. 
· Efeito do ácido nitroso
· O ácido nitroso é um agente mutagênico que reage com o DNA causando desanimação de adenina e citosina, podendo levar a substituição (transição) de AT -> GC e GC-> AT. 
· Elementos transponíveis
· São sequências de DNA que são capazes demudar de posição (sofrer transposição) no genoma.
· Principais tipos de elementos transponíveis em bactérias: 
- Sequência de inserção 
- Transposons
· Os elementos transponíveis apresentam uma organização bem estabelecida. Exemplo: sequência de inserção 
· Algumas consequências da transposição: 
- Inativação genica: a inserção de um elemento transponível dentro de um gene leva a inativação. 
- Modificação de regulação genica: se a inserção ocorrer na região promotora, o elemento transponível pode assumir o controle da transposição desde gene.
- Transferência de genes de resistência: os transposões podem transportar genes que conferem resistência a antibióticos. 
· Exemplo de mutantes de bactérias 
· Mutantes resistentes a antibióticos 
· Mutantes auxotróficos 
· Mutantes morfológicos 
· Mutante resistentes a bacteriófagos
· Seleção de mutantes 
· O isolamento de mutantes e facilitado em bactérias, porque estas possuem normalmente apenas uma cópia de cada gene, o que significa que o efeito de uma mutação em um determinado gene não será mascarado pela presença de uma segunda cópia normal do mesmo gene. 
· Seleção positiva (direita): são utilizadas condições de cultivo em que apenas a mutante ira se desenvolver
- Exemplo: seleção de mutantes resistente a antibióticos.
· Seleção negativa (indireta): utilizado meio de cultura que permite a multiplicação de todas as bactérias e posteriormente as bactérias serão testadas em diferentes condições de cultivo para a detecção de mutantes. 
- Exemplo: seleção de mutantes auxotróficos, mutantes nutricionais, por exemplo mutantes que não conseguem sintetizar vitaminas ou aminoácido. Não são capazes de se multiplicar em um meio mínimo, meio quimicamente definido que contém apenas uma fonte de carbono, nitrogênio, sais e elementos traço. Para detectar esse tipo de mutante é utilizado o experimento placa em replica. 
1. Na primeira parte do experimento o cultivo é realizado em um meio complexo, onde tanto a bactéria selvagem, quanto a bactéria mutante irão se multiplicar e formar colônias. É utilizado um veludo esterilizado que é preso a um bloco de madeira, o veludo será pressionado sobre a superfície do meio de cultura e bactérias de cada colônia ficaram aderidas ao veludo na mesma posição que as colônias estão na superfície do meio de cultura, o veludo será então pressionado sobre uma placa de Petri sobre meio mínimo e depois sobre uma segunda placa de Petri em meio completo, ao final colônias serão formadas nas mesmas posições nos dois meios de cultura, mas os mutantes auxotróficos não conseguiram se modificar me mio mínimo e formaram colônias apenas em meio completo. Comparando as colônias formadas nos dois meios, será possível determinar os mutantes auxotróficos, posteriormente tais mutantes poderão ser caracterizados para definir o tipo de requerimento que eles possuem (aminoácido ou vitamina).
· Testes de Ames 
· Compostos presentes no ambiente podem ser mutagênicos, muitos produtos mutagênicos podem ser carcinogênicos
(Provocam câncer), por causa disso, diferentes testes foram desenvolvidos. 
· O teste de Ames utiliza a reversão de uma mutação auxotrófica para avaliar se um determinado composto é mutagênico e potencialmente carcinogênico.
· Mutações são raramente revertidas 
· No teste de Ames, bactérias (salmonela e paricstidina) são tratados como deseja avaliar e com estrato de fígado de rato (muitos produtos só se tornam mutagênicos quando sofrem a ação de determinadas enzimas do fígado)
 
Genética Microbiana: transferência genica 
· A transferência de DNA em bactérias pode ser: 
- Vertical: quando a informação genética é passada entre as gerações de células por replicação do material genético em células filhas. 
- Horizontal: quando ocorre a transferia de DNA em células da mesma geração.
· Rotaspotencial para bactérias resistentes aos antibióticos: rios, agriculturas etc..
· Transferência do material genético 
· Mecanismos horizontal 
- Transformação: o DNA livre é liberado de uma célula e captado por outra.
- Transdução: a transferência do DNA é mediada por um vírus.
- Conjugação: a transferia de DNA envolve o contato entre células e um plasmídeo conjugativo na célula doadora. 
· Independente do processo de transferência horizontal, o DNA captado pela célula pode seguir três caminhos: degradado por enzimas de restrição, pode ser replicado (caso possua sua própria origem de replicação) ou pode sofrer recombinação com o cromossomo hospedeiro.
· Transdução 
· O vírus bacteriano (bacteriófago) transfere o DNA de uma célula para outra. 
· Existem dois tipos de transdução: 
- Generalizada: qualquer fragmento do cromossomo da bactéria pode ser transferido 
- Especializada: transferência de genes adjacentes ao profago.
· O tipo de transdução está relacionado ao vírus usar o ciclo lítico ou lisogênico, ou seja se o vírus é virulento, quando provoca morte de seu hospedeiro após a infecção ou se apresenta um de vida diferente, que representa um relacionamento estável com o hospedeiro, denominado de vírus temperado. 
· O ciclo lítico compreende na absorção, penetração, replicação, montagem e liberação de novas partículas após a morte da célula. 
· Ciclo lisogênico: absorção, penetração, integração e replicação. Após a penetração o DNA viral e integrado ao cromossomo e para a se chamar profago, que pode ficar por longos períodos integrado ate que algum tipo de estresse leva a sua excisão, integração e replicação. 
· Fagos em lisogenia, são imunes a reinfecção pelo mesmo fago. 
· Na lisogenia, as células receptoras podem exibir novas propriedades como por exemplo codificar toxinas e a resistência a antibióticos.
· Transdução generaliza: o fago em ciclo lítico infecta a célula bacteriana doadora, o DNA e as proteínas do fago são produzidas e o cromossomo bacteriano é quebrado em fragmentos. Ocasionalmente durante a montagem do fago, fragmentos de DNA bacterianos são empacotados no capsídeo do fago, então a célula doadora é lisada, e as partículas do fago contendo DNA bacteriano são liberadas. Um fago carregando uma célula bacteriano, infecta uma nova célula hospedeira (célula recepto), a recombinação pode ocorrer produzindo uma célula recombinante com um genótipo diferente
 
· Transdução especializada: 
- Profago que existe em uma bactéria da lactose como fonte de carbono. 
- Genoma viral integrado no cromossomo hospedeiro 
- Transferência de genes adjacentes ao profago. 
· Transformação 
· É a transferência genética a partir da qual, o DNA livre no meio é incorporado numa célula receptora, podendo promover alterações genéticas 
· Griffith: transformação bacteriana 
· Alguns mutantes desprovidos de capsula são incapazes de promover infecção, são chamados de linhagem R, pois suas colônias apresentavam aspecto rugoso em meio solido. 
· A linha com capsula, apresentava colônias lisas, chamadas de linhagem S 
· No experimento de Griffith, quando bactérias encapsuladas eram injetadas em camundongos, eles morriam, e consequentemente fazendo que possível isolar colônias encapsuladas do animal morto. Já quando bactérias não encapsuladas eram injetadas o animal permanecia viva, e as células bactérias isoladas apresentavam aspecto rugoso, ou seja, não virulentas. 
· Quando bactérias virulentas mortas pelo calor eram injetadas no camundongo, o animal permanecia vivo e não eram isoladas colônias. Entretanto, quando bactérias virulentas mortas pelo calor eram misturadas com bactérias não virulentas vivas, o animal morria e era possível isolar bactérias encapsuladas. Esse experimento provou a Griffith, que algo era transferido para as bactérias virulentas mortas para as células vivas não virulentas, sendo essas células então, sendo transformadas em um outro tipo. 
· Transformação
- Competência: uma célula capaz de captar uma célula de DNA e ser transformada, sendo essa capacidade terminada geneticamente. A competência pode ser induzida no final da fase log havendo proteínas especificas na captação e no processamento do DNA.
· Proteínas de competência: Proteína de ligação associada ao DNA, associadas a membrana plasmática, alto lisena de parede celular e várias nucleasses.
· Etapas de transformação
1) Competência 
2) Presença de DNA livre no meio 
3) Ligação do DNA à célula receptora 
4) Entrada do DNA (uma fita entra e a outra é degrada por nucleasses)
5) Recombinação do DNA 
· Conjugação 
· Experimento de Lederberg e Tatum: fator F 
· Davis: demonstrou que o estado físico é necessário para ocorrer a recombinação entre bactérias.
· Os dois experimentos permitiram evidenciar: contato físico e fator de fertilidade (plasmídeo) 
· Fator F: molécula de DNA circular, contem cerca de 40 genes (região chamada de TRA, onde estão os genes relacionados a conjugação da formação do pilus), região chamada ORIV (origem de replicação), ORIT (indica a origem de transferência durante a conjugação)
· São encontrados no fator F, elementos transponíveis, como as sequencias de inserção IS. Essas sequências podem recombinar com elementos idênticos no cromossomo bacteriano, assim promovendo e integração do o fator F, assim o fator F pode ser encontrado na forma de uma molécula independente com replicação autônoma ou integrada no cromossomo, epissoma. 
· No mecanismo de conjugação:
- F +: célula bacteriana que possui o fator F, produz o pilus sexual que permite o reconhecimento e a reaproximação das células. 
- F -: célula bacteriana que não possui o fator F 
- Poro entre as duas células permite a passagem do DNA 
- A transferência do DNA na conjugação, requer a síntese do DNA pelo mecanismo de círculo rolante, onde apenas uma das fitas é transferida. Enquanto uma fita é transferida, a fita de DNA complementar é produzida tanto na célula doadora quando na célula receptora, ao final do processo as duas fitas terão o plasmídeo completo o que resultará em duas células F+.
· O fator F é um epissomo, plasmídeos capazes de se apegar a célula hospedeira 
· As células que apresentam o plasmídeo integrado no cromossomo são denominadas Hfr (alta frequência de recombinação).
Engenharia Genética
· Vantagens da utilização de microrganismo 
· Fácil cultivo, baixo custo e manipulação fácil 
· Obtenção de um grande número de células em curto período de tempo 
· Produção de compostos por tempo indefinido 
· Bactéria produtora de interferon gama 
· E.coli geneticamente modificada 
· O produto visível aqui como uma substancia de cor alaranjada, pode ser liberado pela lise da célula
· Visão geral da engenharia genética 
1) Gene de interesse 
2) Vetor 
3) Hospedeiro 
· Realizados esses passos é possível organizar genes de interesse de um organismo e introduzi-lo em outro.
· Hospedeiro ideal 
· Aceitar o DNA exógeno sem provocar modificações no gene ou na sua expressão 
· Permitir a identificação das células que apresentam o DNA exógeno 
· Baixo potencial de proliferação no meio ambiente 
· Hospedeiro 
· A E.coli é um organismo modelo muito utilizado, pois sabe-se muito sobre seu metabolismo, fisiologia e genética 
· As leveduras, também são muito utilizadas 
· Vetor de clonagem ideal 
· Apresentar propriedades que facilitem sua ligação ao DNA exógeno 
· Duplicar o DNA exógeno 
· Apresentar marcadores pela a seleção 
· Na clonagem dos plasmídeos, é necessário: 
- Origem de replicação do DNA
- Resistencia a ampilicilina 
- Região Polilinker: essa região tem vários sítios de reconhecimento, para as enzimas de restrição. 
· Construção de uma bactéria recombinante 
1) Obtenção do genoma do organismo doador (isolamento do DNA doador)
2) Isolamento do gene de interesse (não é necessário o gene inteiro) 
3) Após o isolamento, obteremos o DNA do vetor (isolamento do DNA plasmidial) 
4) Ligamento do gene de interesse ao DNA do vetor pela ação das enzimas de restrição e da DNA ligase 
5) Introdução da construção na célula hospedeira, o plasmídeo maiso gene de interesse
6) Resultado na clonagem molecular ou clonagem genica 
1) Para o isolamento do DNA doador: é necessário romper a célula doadora, entretanto, ao romper todos os debri celulares e moléculas são liberados juntos com as moléculas de DNA. Portanto é necessário separa as moléculas. 
*A lise de uma bactéria gram positiva é mais demorada do que a da gram negativa, por causa da camada peptídeoglicano da parede celular 
2) Isolamento do gene de interesse.
- PCR: reação em cadeia da polimerase-> replicação in vivo. É necessário a fita molde (DNA ou Cdna), nucleotídeos, DNA polímera, primers (a DNA polimerase se liga e inicia a adição de nucleotídeos). O diferencial do PCR são os primers adicionados que flanqueiam a sequência do gene de interesse. Ao final dessa reação é produzido várias copias do gene de interesse.
· Reação de PCR
· Primeiro passo: temperatura a 94 graus, para que ocorra a abertura a fita de DNA molde 
· Segundo passo: a temperatura é abaixada para que os primers se liguem a regiões complementares ao gene de interesse 
· Terceiro passo: a temperatura é aumentada novamente, para a temperatura ótima da DNA polimerase, assim ela adiciona os nucleotídeos na região do gene de interesse.
· Esses três passos são repetidos mais de 30x, assim ao final do processo haverá milhares de copias do gene de interesse e não do gene inteiro. 
· Isolamento do DNA plasmidial 
· O plasmídeo se encontra no interior das células, então é necessário o rompimento das mesmas. 
· Ao extrair o DNA plasmideal, o DNA cromossômico é extraído também, assim para separa-los é realizada uma ultracentrifugação em gradiente de cloreto de Césio e Brometo de Etídeo 
· O cloreto de Césio será adicionado para criar um gradiente de densidade e o Brometo de Etídeo agente intercalante da fita de DNA que permitirá a visualização sobre a luz ultravioleta 
· Ao final da centrifugação, terá a formação de duas bandas que migra de acordo com o tamanho e conformação das moléculas de DNA 
· Assim, a molécula de DNA plasmidial, por estar fita dupla e supercoide, migra mais que a molécula de DNA cromossômica 
· Enzimas de restrição 
· Para a ligação do DNA plasmidial com o gene de interesse, são utilizadas as enzimas de restrição 
· Presentes em quase todos os microrganismos 
· São muito utilizadas na engenharia genética, pois são capazes de reconhecer e clivar os sítios específicos na sequência do DNA (4 a 6 bases) 
· É capaz de deixar nos terminais dos fragmentos de DNA nucleotídeos livres, chamados de Terminais coesivos 
· Quando a enzima cliva o DNA, sem deixar nucleotídeos livres na extremidade da molécula, chamamos de terminais cegos 
· Enzima de restrição com padrão de clivagem coesivo 
· As enzimas de restrição são muito utilizadas por deixarem nucleotídeos livres no final dos fragmentos, e esses nucleotídeos livre, quando em condições ideias podem se ligar por complementariedade
· Ação das enzimas de restrição
· Para ligarmos o gene de interesse ao DNA plasmidial, tratamos ambas as moléculas com a mesma enzima de transmissão, para produzirem os mesmos terminais 
· Quando colocadas em contato e em condições ideias, os nucleotídeos irão se ligar por complementariedade, entretanto o esqueleto açúcar fosfato da molécula permanece sem se ligar, tornando necessários adicionarmos a DNA ligase para estabelecer tal ligação e selar a molécula de DNA plasmidial como vetor.
· Enzimas de restrição disponíveis no mercado 
· Cada uma possui o sitio de reconhecimento especifico 
· E o nome é dado de acordo ao microrganismo ela foi purificada 
· Kits comerciais: 
- Extração de DNA genômico para diversos tipos de células bacterianas (animais, amostras de solo, água, fezes)
- Extração de DNA plasmidial: não é necessário a ultracentrifugações
- Kit de clonagem de DNA: o plasmídeo esta aberto e não é necessário trata-lo com a enzima de restrição 
· Transformação 
· Construção pronta: gene de interesse ligado ao plasmídeo 
· Após a construção, o próximo passo é introduzir o plasmídeo em uma célula hospedeira
· O método mais comum de atingir o objetivo é pela transformação, mecanismo em que o DNA exógeno é inserido em uma célula receptora competente
· Existem métodos em laboratórios em de induzir a competência de células receptoras que resultam no alto da frequência transformação, existem dois métodos: 
- Transformação com cloreto de cálcio e choque térmico 
- Transformação por eletroporação (método mais caro)
- Ambos tem o mesmo propósito, introduzir o plasmídeo no interior da célula hospedeira utilizando estímulos diferentes
· Transformação com cálcio seguido de choque 
· Transformação da E.coli 
· Após a produção de células competentes em meio contendo cloreto de cálcio 
· Adiciona- se o plasmídeo a estas células e aplica o choque térmico. Submetendo as células de E.coli a um curto período de tempo (60 a 40s) a 42 graus, feito isso segue para o plaqueamento das células transformantes em meio de cultivo apropriado 
· Acredita-se que durante tais estímulos, a célula hospedeira se torna competente, apta a receber o DNA pela abertura de poros na membrana celular, permitindo assim a passagem do plasmídeo para o interior da célula
· No caso da transformação com cloreto de cálcio, os íons formados pelo cloreto neutralizaram as cargas negativas da molécula de DNA do plasmídeo e carga liquida negativa da membrana das células hospedeiras, impedindo a reporção por cargas e permitindo a entrada do plasmídeo. 
· Transformação da E.coli por eletroporação 
· Após a produção de células competentes, adiciona-se os plasmídeos a estas e aplica-se o choque elétrico no eletroporador, onde as células são submetidas a alta voltagem, que provocam uma desestabilização nas cargas da membrana e a formação de poros, possibilitando a entrando do DNA para o interior da célula e os transformantes são plaqueados em meio de cultivo apropriado 
· Identificação das células recombinantes 
· No primeiro método, é selecionado a célula que contém o plasmídeo, este conferirá a célula hospedeira resistência a antibiótico, entretanto neste caso, é selecionada a célula que contém o plasmídeo com e sem o gene de interesse 
· No já segundo e terceiro método, é possível identificar a célula que contém o plasmídeo com gene de interesse 
· Independentemente do método utilizado na transformação, ao final do processo existem pelo menos 3 tipos de célula
- As que recebem o plasmídeo ligado ao gene de interesse 
- Células que não receberão o plasmídeo 
- Células que receberão o plasmídeo, mas sem o gene de interesse 
· Para a identificação das células que receberão o plasmídeo, utilizamos marca de seleção do vetor 
· Exemplo: cultivo em ágar contendo ampicilina. As células que apresentarem o vetor, serão transformadas e sobrevivem em placa de ampicilina, as que não recebem o plasmídeo morrerão em placas com ampicilina 
· Detecção da bactéria recombinante:
- Seleção de colônias azul-brancas 
- Colônias azuis são as células que contem só o plasmídeo
- Células brancas, são células formadas com o plasmídeo carregando o gene de interesse 
· Seleção branca-azul 
· Esses vetores são plasmídeos que contém dois marcadores de seleção: 
1) Para selecionar a célula que contém o plasmídeo pela conferência do gene que confere resistência a antibióticos 
2) Selecionar os marcadores que contém o gene de interesse, a região que facilita a ligação do gene de interesse o polilinker 
3) O Polilinker esta no meio do gene lacZ, este gene codifica a proteína betagalactosidase, que quebra o substrato incolor, adicionado em meio de cultivo em produtos azuis 
· Após a incubação da placa, crescerão as colônias azuis (transformantes), formada por células que contém o plasmídeo sem o gene de interesse, o gene lacZ esta intacto, portanto codificara a proteína betagalactosidade que quebrará o substrato Xgau em produtos azuis 
· Colônias brancas (transformantes recombinantes), onde o gene de interesse entra no meio do gene lacZ, mas neste caso ele não conseguira modificar a proteína betagalactosidade,portando a células ficarão brancas 
· Todas as colônias contêm o plasmídeo, mas só a branca com o plasmídeo com o gene de interesse 
· Hibridação de colônias 
· Nem sempre é possível utilizar um plasmídeo que permita a seleção de colônias brancas e azuis 
· É possível utilizar o método de hibridação de colônias, esta técnica utiliza sondas de ácidos nucleicos para identificar colônias contendo o gene de interesse 
· Essas sondas são complementares e se ligam no DNA de interesse 
· Tais sondas são marcadas por radioatividade ou fluorescência, tornado possível identificas as colônias contendo os plasmídeos recombinantes pela ligação da sonda ao DNA de interesse. 
· Após o crescimento das colônias transformante, é feito uma cópia das colônias da placa em uma membrana com afinada por DNA, esta membra sera tratada com uma solução detergente o SDS, para lisar as células, e em seguido é adicionado uma solução desnaturante o NAOH para abrir a dupla fita e expor a fita simples do DNA. Neste ponto a sonda marcada é adicionada ele se liga ao gene de interesse, e como essa é uma marcação radioativa, a membrana é colocada em contato com o filme revelador que será marcado no local onde a sonda excitar, e assim por comparação do resultado do filme com a placa é possível localizar a colônia cuja as células carregam o plasmídeo recombinante, ou seja o plasmídeo ligado ao gene de interesse. 
· Emprego de sonda de DNA para identificar colônias contendo o gene de interesse 
· As sondas de DNA são complementares ao gene desejado 
· Problemas com a clonagem de gene eucarióticos em bactérias 
· Presença de sequência não codificadora, os íntrons na organização de gene eucariótico, a bactéria não é capaz de realizar o splicing 
· Bactéria hospedeira não reconhece as sequências sinais presentes no gene, importantes para a ligação da enzima como o DNA-polimerase ou RNA-polimerase 
· A proteína produzida pode ser insolúvel, o que dificulta a sua purificação 
· O excesso da proteína pode ser toxico a célula hospedeira 
· A célula hospedeira reconhece a proteína como um corpo estranha e a degrada 
· A célula hospedeira não tem mecanismo de secretar as proteínas, o que pode dificultar e encarecer o processo de recuperação da proteína, principalmente quando se tratando de escala industrial 
· Síntese de DNA 
· A presença dos íntrons é contornada com a enzima trancriptase-reversa, essa enzima é capaz de sintetizar uma fita de DNA complementar o CDNA 
· Utiliza como molde o mRNA maduro, ou seja, ele já terá passado pelo splicing e estará sem os íntrons, assim ao invés de extrair o DNA do organismo doador, o RNA deverá ser extraído ao qual é adicionado a trancriptase- reversa, para a síntese do CDNA complementar ao RNAm, sintetizando o CDNA.
· CDNA é uma subunidade da transcriptase-reversa degrada o RNAm e uma segunda fita de DNA completar ao CDNA será sintetizada pela adição da DNA polimerase
· Ao final temos o DNA dupla fita, sem íntrons prontos para ser religado ao vetor de clonagem