Técnicas inmunológicas

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{Métodos de diagnóstico inmunológico 
Técnicas:
- Aglutinación
- Precipiación - floculación
- Inmunodifusión (se desarrolló a partir de las técnicas de difusión)
- Electroforesis e inmunoelectroforesis 
- Inmunofluorescencia - Radioinmunoanálisis
- Ensayo inmunoenzimático 
Las técnicas en inmunología pueden ser:
- Cualitativas: el resultado es positivo o negativo, como en el caso de la inmunohistoquímica (el agente
tumoral está o no presente).
- Cuantitativas:
• Semicuantitativa: el resultado es negativo o positivo, pero el positivo va desde muy bajo hasta muy alto
(se da por número de cruces +, ++ o +++).
• Cuantitativa: permite cuantificar la concentración de antígeno o anticuerpo en la muestra, como el caso
de una ELISA, un radioinmunoanálisis o una técnica de fluorescencia (se hacen soluciones seriadas del
Ag o Ac y se puede determinar hasta que concentración de antígeno se presentan anticuerpos o hasta
que concentración de anticuerpo se presentan antígenos).
Aglutinación
- Técnica semicuantitativa: se toma una gota de sangre sobre una placa de vidrio, se le pone un antisuero o
anticuerpo monoclonal contra A o contra B y se dice si el paciente es A o B dependiendo de la aparición de
grumos (aglutinación). Se pueden hacer diluciones de suero y hacerla cuantitativa, pero para los casos de
hemoclasificación no es necesario hacer diluciones seriadas (el paciente puede ser A positivo, B positivo u
O si no hace aglutinación).
- Requerimientos:
• Células o partículas: se trabaja con glóbulos rojos de carnero, humanos RH - (estos se pueden lisar o
crenar a pesar de que se tienen en una solución buffer) o con partículas estables como el látex (han
permitido que las reacciones sean exactas y que no hayan falsos positivos o falsos negativos).
• Deben haber 2 o más antígenos cercanos.
• Anticuerpos aglutinantes: IgG e IgM (no se pueden pedir aglutininas tipo
A), las únicas isohematoaglutininas son la IgM (son los anticuerpos contra
los grupos sanguíneos diferentes).
- El anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, así mismo cada
antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado de
complejos Ag - Ac.
- Usos: seroclasificacíon, técnicas en látex o detección de partículas virales.
- Ejemplo: se pide una proteína C reactiva en el laboratorio para evaluar si el
paciente tiene un estado inflamatorio agudo de índole infecciosa o por un trauma, su validez es de 24 a 48
horas.
• Se utilizan Ag contra PCR, es negativa cuando no hay aglutinación o positiva si hay aglutinación. Pero no
solo se informa el resultado cuantitativo (positivo o negativo), también se puede partir del valor de corte
normal que es <6 mg/dL y hacer diluciones seriadas de la muestra para informar hasta donde hay
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positividad (1/1, 1/2, 1/4 o 1/8, el último valor informa un resultado negativo).
• Las proteínas que inducen la producción de proteínas de fase aguda en el hígado son la IL-1, IL-6 y TNF-
alfa.
Precipitación (floculación)
- El antígeno se encuentra disuelto en el medio y al unirse a los antígenos se
forman macrocomplejos moleculares, formando una red tridimensional que
debido a su tamaño precipita. Por medio de la precipitación se determina la
reacción de anticuerpos contra cardiolipinas.
- La sífilis es una enfermedad producida por una bacteria llamada treponema
pállidum, no ha todos los pacientes se les puede hacer pruebas de
floruorecencia por su elevado costo, por eso se realizan pruebas VDRL con
anticuerpos contra cardiolipinas que tienen una sensibilidad y especificidad
del 75%. El VDRL es la prueba estándar para el diagnóstico de sífilis, pero
hay que tener cuidado porque el 25% de los resultados positivos son falsos
(este porcentaje se debe a que las cardiolipinas son compuestos lipídicos que
están tanto en la pared celular de algunos microorganismos, como en la pared
de nuestros glóbulos rojos).
- En esta prueba se forman flóculos, no hay aglutinación, sino que las células se precipitan como grupos de
algodón sobre la muestra.
- Pacientes con enfermedades tropicales (malaria, dengue etc.), mujer en embarazo (pueden tener síndrome, 
anti fosforílico, se generan Ac contra los fosfolípidos de las membrana), pacientes con enfermedades
autoinmunes e incluso una simple gripa pueden causar resultados falsos. Por medio de la historia clínica se
puede corroborar si realmente el resultado positivo es el
reflejo de una infección. Si la muestra está hemolisada o si es
de un paciente que ha desayunado grasas va a dar
positiva porque se van a detectar los lípidos. 
- Se utiliza como una prueba de screening para determinar
positividad o negatividad, cuando no hay un buen
respaldo de historia clínica se hacen otras pruebas para
confirmar el resultado.
- Se miden inmunoglobulinas principalmente del tipo M, que
con el tratamiento se deben negativizar. Si a pesar del
tratamiento no se negativizan las IgM hubo una mala
formulación del tratamiento y la enfermedad puede
deberse a un proceso autoimune.
- La prueba se realiza sobre una lámina de vidrio o sobre el papel. Los análisis sobre papel ya no se hacen
(usaban carbón activado), eran más económicos pero los resultados no eran tan buenos como se esperan
porque se perdían los (pacientes que no son negativos, pero tampoco son reactivos), estosVL positivos 
eran pacientes a los que había que hacerles seguimiento para descartar o confirmar si tenían la
enfermedad. 
- Si no se puede confirmar el resultado, se realizan pruebas de fluorescencia con Ac específicos para la
enfermedad. Antiguamente se realizaban pruebas de túnel con microscopio de campo oscuro. La muestra
puede ser reactiva o no reactiva, y en los casos reactivos se realizan las pruebas semicuantitativas por
dilución (el punto de corte es 2 mg/dL para sífilis).
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Inmunodifusión
- Se utilizan matrices sólidas en donde se realiza la reacción, en un
principio se hacían de almidón pero tenían muchas impurezas, luego se
trabajó con agar y ahora se hace con agarosa (es muy costosa pero los
resultados son muy bueno porque es muy limpia).
- Sobre la matriz se ponen a migrar antígenos y anticuerpos que se unen
en un sitio formando una zona de precipitación. En una caja de Petri se
deposita la agarosa, en un poso central se pone el antígeno y en los
posos periféricos se ponen anticuerpos, en el punto es el que se dé la
reacción AgAc se forman las bandas de precipitación (hay máxima
precipitación en la zona de equivalencia donde se forman los complejos
Ag-Ac).
- Factores importantes: pH, temperatura y concentración.
- Ejemplo: se quiere medir en una población de mujeres si hay anticuerpos contra candida albicans,
normalmente en la vida de una mujer hay una candidiasis. Se pondría en el poso central antígeno de
cándida y alrededor sueros de las distintas mujeres, en donde hayan bandas de precipitación hay
anticuerpos positivos.
- Es una técnica de tipo cuantitativo que nos dice si la muestra es positiva o negativa. Las bandas de
precipitación no son fácilmente observables, se debe fijar con etanol, lavar con solución salina y colorear
con algún colorante para proteínas.
- En la vida practica se utiliza para detectar anticuerpos contra rabia, candida e histoplasma capsular (hongo
que causa una infección sistémica, se encuentra en cuevas de murciélagos). Con esta prueba se detectan
IgM o IgG.
- Patrón de bandas: si hay una banda es una reacción de tipo crónico, si hay dos bandas es un proceso
agudo. 
Técnica de inmunodifusión de Ouchterlony
- Desarrolló una técnica semicuantitativa por medio de la inmunodifusión. 
- La primera vez que se realizó, se tomó suero inmunizado de conejo, se diluyo (1/1,1/2, 1/4, 1/8, 1 /16 y
1/32) y se observó en que posos había reacción Ag-Ac.
- A medida que se diluye el suero la reacción disminuye y las bandas bajan de intensidad hasta que
desaparecen. 
Doble inmunodifusión 
- En el instituto de inmunología de Butatan (Brasil) se producen antisueros
contra gran cantidad de enfermedades de tipo parasitario.
- Experimento: “Doble inmunodufusión de homogenatos de aparatos
venenosos de Phoneutria nigriventer de las provincias de Misiones (Ph M)
o Jujuy (Ph J), frente al antiveneno experimental desarrollado (A-Ph) y
frente al soro antiaracnídico del instituto de Butantan (Brazil) (AA), único
antídoto disponible mundialmente para tratar este tipo de
envenenamientos. Obsérvese la alta reactivado con ambos antivenenos".
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- Se utilizó suero procesado de equinos inmunizados con veneno de la araña P. nigriventer de dos regiones
(Misiones y Jujuy), se quería ver que tan inmunogénicos eran los sueros. Tomaron el antisuero comercial y
el antisuero producido y los enfrentaron contra los dos antígenos, se encontró que la respuesta era mayor
en el producido en equinos (tiene la ventaja de que se puede producir en grandes cantidades).
- La reactividad inmunoquímica del suero y del antiveneno se evaluó mediante inmunodifusión doble (IDD):
dos antisueros enfrentados a dos antígenos. 
Inmunodifusión radial simple
- Relación cuantitativa entre el Ag del pozo y el Ac disuelto en el agar. 
- Se utilizan placas comerciales específicas para cada Ag. En el agar está
disuelto el anticuerpo y en los posos se pone el suero (se identifican
antígenos específicos).
- Se utiliza para medir las cadenas pesadas de las IgE e IgA, cadenas
livianas lambda y kappa, factores del complemento como C3, C2 y C4 y
para la haptoglobina (proteína relacionada con anemia hemolítica
autoinmune).
- Se mide el aro de precipitación en mm alrededor del antígeno para
obtener la concentración definida de la proteína en la muestra.
- Una de sus aplicaciones es en pacientes con enfermedades autoinmunes, en los cuales disminuye o
aumenta la concentración de factores del complemento, se puede hacer la medición y extrapolar la curva
para hallar la concentración de la proteína. Por ejemplo, en el mieloma de Bencen Jones están aumentadas
las cadenas livianas lambda y se puede determinar haciendo una inmunodifusión radial simple de orina, o
en las anemias hemolíticas autoinmunes están aumentadas las haptoglobinas y se puede determinar con
una inmunodifusión radial simple del suero del paciente.
- A diferencia de los que ocurre en la doble inmunodifusión aquí solo migra el Ag del pozo, el Ac está fijo en
la matriz de agar.
Electroforesis
- Tiselius fue el primero en hacer electroforesis de suero humano (1940), la hizo para detectar las diferencias
en el suero de niños con infecciones bacterianas recurrentes, encontró que habían secciones, a diferencias
del suero normal, en donde no había picos (electroforesis de zona).
- Electroforesis de zona: consiste en tomar las proteínas y ponerlas en la zona central de un buffer, según su
carga eléctrica migran a diferentes zonas (las positivas migran hacia el ánodo y son negativas migran hacia
el cátodo). Las gammaglobulinas migran hacia el cátodo y las globulinas ácidas hacia el ánodo.
• La separación se hace por carga eléctrica.
• Se utiliza un soporte fijo como almidón, agar o agarosa.
• Se encuentran bandas como patrón de migración.
• Al médico se le envía la densitometría que muestra diferentes picos (resultado de la lectura de la
migración de las bandas).
- Orden de migración de bandas en un suero humano normal:
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1. Albumina: 3,2 - 5,0 g/dL, 58%.
2. Alfa 1 globulinas: 0,1 - 0,4 g/dL, 3%.
3. Alfa 2 globulinas: 0,6 - 1,0 g/dL, 9%.
4. Beta globulinas: 0,6 - 1,3 g/dL, 14% 5. Gamma
globulinas: 0,7 - 1,5 g/dL, 16%. 
- La relación albumina - gamma globulina es 3:1 (3
albúminas por cada gamma globulina). Una
electroforesis con picos similares de albúmina y gamma
globulinas refiere a una hipergammaglobulinemia (si tiene un vértice es de tipo monoclonal o si tiene una
meseta es de tipo policlonal), por el contrario, si no hay pico de gamma globulinas se tiene un paciente
agammaglobulinemico.
- Normalmente las hipergammaglobulinemias esconden hipogammaglobulinemias selectivas, por ejemplo, se
puede tener un paciente que tiene hipergammaglobulinemia con hiper IgM e hipo IgA o IgG (normalmente
las hipogammaglobulinemias son compensadas con hipergammaglobulinemias de tipo IgM). Las
hipogammaglobulinemias selectivas más frecuentes en el pais son IgA, se esconde bajo una
hipergammaglobulinemia (por lo general en vértice, porque es de tipo monoclonal). Dentro de la medición
de las gamma globulinas lo que se está analizando son las cadenas pesadas.
- La inmunoelectroforesis consiste en la separación electroforética de las proteínas, el mecanismo de
difusión es un canal en el que se ponen anticuerpos y luego se hace inmunoprecipitación. En la
inmunoelectroforesis de suero humano normal se pueden medir diferentes proteínas, tanto de forma
general como las gamma globulinas totales, como de forma específica como las IgG humanas (son
importantes para corroborar las electroforesis generales). 
- En un mieloma monoclonal se va observar una hipergammaglobulinemia en la electroforesis pero no se
puede decir nada más, por eso es necesario realizar electroforesis con inmunofijación para identificar
selectivamente los componentes. En el mieloma de Bence Jones puede haber una
hipergammaglobulinemia que esconde una hipogammaglobulinemia de cadenas livianas lambda.
- En un reporte de caso de mieloma múltiple con espectro policlonal (hay más de un clon de linfocitos
produciendo anticuerpos de forma anormal), se encuentra una inmunoelectroforesis con
hipergammaglobulinemia en meseta y al hacer la electroforesis en papel con inmunofijación se encuentra
elevadas las cadenas pesadas gamma y alfa y las cadenas livianas kappa y lambda. Al hacer las pruebas
con muestra de orina se encuentran elevadas las cadenas livianas kappa (podría ser un mieloma especifico
de cadena liviana). Continua en el estudio por medio de ELISA
- Se puede hacer electroforesis de ácidos nucleicos y proteínas en agarosa, para proteínas se busca que el
punto de fusión no sea muy alto para que no se degraden.
Inmunofluorescencia 
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- Es una técnica cuantitativa clara, arroja un resultado positivo o negativo. Es muy costosa, un microscopio
de fluorescencia esta alrededor de 80 millones de pesos.
- La técnica puede ser directa (identificación de antígeno) o indirecta (detección de anticuerpo).
Inmunofluorescencia directa
- Permite identificar virus y parásitos (Ej. toxoplasma gondi en mujeres embarazadas) o realizar
inmunohistoquimica para identificación de complejos inmunitarios.
- Se tienen el tejido y se quiere medir, por ejemplo, en el paciente que tiene glomerulonefritis si tiene depósito
de complejos inmunes en el riñón. Se toma la biopsia con los
depósitos de complejos inmunes, se le aplica un anticuerpo
fluorescente y se mira si el tejido emite un color.
- Componentes fluorescentes: Isotiosinato de florecelina (verde
manzana brillante), rodanina (ocre rojizo brillante para mycobacterium
tuberculosis en esputo), azul pacífico, etc. Estos colorantes son
estimulados por un haz de luz y el electrón de su ultimo nivel, como
esta en un estado inestable al ser excitado con una longitud de onda,
salta y emite la luz que observa el ojo humano.
- Ejemplos: por inmunofluorescencia directa se pueden identificar
depósitos de complejos inmunes en la membrana basal delos túbulos renales o depósito de inmuno
complejos en los vasos dérmicos (vasculitis).
Inmunofluorescencia indirecta
- Permite identificar anticuerpos específicos en suero o cualquier liquido corporal o tejido (humor acuoso,
cordón umbilical, liquido amniótico, etc.), es una prueba cuantitativa altamente específica y sensible (se
pueden detectar hasta nanogramos de anticuerpos). 
- Ejemplo: se quiere identificar en una población cual es el anticuerpo predominante frente a rubeola o
toxoplasma gondi. 
- En la lámina se tiene el parasito o el cultivo celular donde se cultivó el microorganismo, se agrega el suero
del paciente en donde puede haber o no anticuerpos, si hay anticuerpos cuando se agregue la sustancia
que va a revelar va a haber fluorescencia del microorganismo, pero si no hay anticuerpos no va a haber
fluorescencia.
- Es una tecnica porque se hacen diluciones seriadas decuantitativa 
suero, se considera positivo para toxoplasma gondi en el país por 
encima de 1/8 (1/4 es negativo, es el punto de corte).
- El anticuerpo está dirigido contra la fracción Fc del anticuerpo, puede
ser IgG o IgM. Jamás se debe pedir una IgM para síndrome TRCHS
(toxoplasma, rubeola, citomegalovirus, herpes y sifilis), se debe
realizar pruebas para diagnosticarlo en mujeres embarazadas a las
que se le sospecha una infección aguda, pero si se hace con IgM no
es tan específica (hay otras pruebas más sólidas como la IgG).
- Usos: identificación de anticuerpos IgG anti-T. cruzi (causante de la enfermedad de Chagas, el valor de
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corte en el país es por encima de 1/20), anti-T. gondi Chlamydia trachomatis.o anti-
- En sospechas de toxoplasmosis congénita se hace inmunofluorescencia directa para saber si está o no el
parasito, e inmunofluorescencia indirecta para saber si hay anticuerpo en el
suero de la mama, la sangre de cordón umbilical, las muestras del primer
mes del niño y las improntas de la placenta.
- Síndrome de Goodpasture: anticuerpo contra la membrana basal glomerular,
no son depósitos de complejos inmunes como ocurre en el pacientes con
lupus o artritis. Por H&E no se puede indentificar, el diagnóstico se debe
hacer por inmunofluorescencia (se identifican anticuerpos precipitados).
Radioinmunoanálisis
- Ya no se realiza por su alto nivel de contaminación (la degradación de los isótopos tarda hasta 300 años).
- Utilizaba un conjugado con un isótopo radioactivo y al hacerse la reacción Ag-Ac con el ligando marcado se
emite radiación, se lee con un contador gamma o beta (es muy costoso). 
- Se hacían para medir hormonas como TSH, T3 y T4. Hoy en día estas mediciones se hacen por ELISA,
turbimetria o quimioluminicencia.
ELISA 
- Técnicas que revoluciono el diagnóstico, se pueden identificar picogramos e incluso una menor cantidad de
moléculas. Tiene alta especificidad, sensibilidad (con AcMO se puede identificar cantidades mínimas de
Ag), rapidez (hoy en día tardan 10 horas) y es muy económica e interferente (IgM).
- No solo se utilizan en muestras humanas, por ejemplo, se tiene un terreno en donde se cultiva papa y se
compra una semilla mejorada muy costosa, se puede solicitar una ELISA del terreno para mirar si está libre
de virus.
- Definición: técnica para medir la presencia de un antígeno o un anticuerpo usando una reacción
inmunológica con base en la reacción enzima - sustrato (el sustrato cambia de color ante la reacción), si se
utiliza peroxidasa la reacción se da con peróxido de hidrogeno y si se utiliza fosfatasa alcalina se da con
compuestos que tengan fosfatos.
- Se escoge la técnica de acuerdo a:
• Tipo de muestra: si se van a medir IgG contra rubeola se utiliza una técnica fácil, no competitiva e
indirecta. Pero si se va a medir IgM se debe realizar una técnica de captura con un AcMO muy específica
y sensible.
• Disponibilidad de los reactivos.
• Precisión y sensibilidad.
- ELISA de tipo no competitiva:
• Indirecta para detectar anticuerpos.
• Directa para detectar antígenos.
• Doble sandwich.
• Captura para detectar anticuerpos.
• Dot blot, Western blot e inmunohistoquímica (modificación de las ELISAs en papel).
- Para realizarla es necesario tener una matriz en donde se lleve a cabo toda la reacción, por lo general son
placas de polivinilo en donde se fijan los complejos inmunes Ag-Ac, el problema es que son no reutilizables
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y no biodegradables. Hoy en día se ha optado por trabajar en papel de microcelulosa que es biodegradable.
ELISA indirecta para detectar anticuerpos
- Se utiliza para medir anticuerpos, por ejemplo, se quiere medir anticuerpos contra citomegalovirus en una
población.
- Se tiene la placa en donde está el antígeno (puede venir directamente de la casa comercial), se debe
realizar lavados en cada paso con una solución lavadora que contiene un detergente. 
- Cuando se realiza se debe hacer bloqueo porque las placas de poliestireno pueden fijar proteínasin house 
y dar una reacción falsa. Se puede bloquear con caseina, hemoglobina o albúmina sérica bovina fracción 5
(es muy costosa), también se puede hacer con leche descremada concentrada (hace la prueba mucho más
económica).
- Cuando se adicionan los anticuerpos, como se ha hecho el bloqueo, estos se unen a los antígenos de la
placa. Luego se adiciona el conjugado que es un anti-Ac marcado con una enzima, la enzima sola no
funciona por lo que se le debe adicionar un sustrato en un buffer adecuado a un pH correcto (la peroxidasa
trabaja a pH ácido de 1.5 y la fosfatasa alcalina trabaja a un pH básico de 9.6).
- El resultado final es una reacción de color, a mayor número de
anticuerpos el color es mayor. Este proceso está estandarizado,
en 15 minutos la peroxidasa da un buen color, mientras que la
fosfatasa alcalina tarda 45 - 60 minutos. Si se deja la reacción 24
horas toda la placa se encontrará teñida, incluso el blanco, por
esto es necesario detener la reacción con una solución stop que
normalmente son condiciones extremas (peroxidasa con ácido
sulfúrico y fosfatasa alcalina con hidróxido de sodio).
- El resultado pasa por una ELISA reader que es un densitometro
(informa una densidad óptica), entre mayor concentración de
anticuerpos haya, el color va a ser mas fuerte y al densidad óptica
va a ser mayor (es necesario determinar el punto de corte, por
encimade este son positivos y por debajo negativos).
- Cuando se realiza una ELISA indirecta para detectar anticuerpos en pacientes con TBC se utiliza un
anticuerpo de captura y se debe realizar por cada muestra pruebas por duplicado y si es posible por
triplicado (esto permite estar seguro del resultado). Además se debe hacer control positivo, negativo, del
buffer, del conjugado y de blancos (se debe blanquear con buffer). Para informar los resultados, se hace un
promedio entre las pruebas, si los resultados son muy diferentes se debe repetir las pruebas.
- Detección de inmunocomplejos:
• Detectados en tejidos.
• Técnicas de inmunohistoquímica.
• Detección cualitativa.
• Es valiosa en el diagnóstico de endocarditis bacteriana.
- Continuación En el paciente con mieloma múltiple se le realiza a nivel de medula ósea
inmunohistoquímica, midiendo CD138 (marcador de mieloma), cadenas livianas kappa y lambda. Como se
ha venido observando, para el diagnóstico son necesarias múltiples pruebas como electroforesis,
inmunofijación e inmunohistoquímica, por medio de estas se llega a la conclusión de que el paciente tiene
un mieloma múltiple biclonal (IgG kappa e IgA lambda). Western blotting:
- Primero vino southern blot (DNA), luego western blot (proteínas) y por último northern blot (RNA).
- En esta prueba se hace una separación del antígeno en gel de poliacrilamida, se transfiere a papel de
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nitrocelulosa, se hace reacción Ag-Ac, se adiciona el conjugado y se hace la reacción enzimática y el
revelado.
- Las proteínas cargadas negativamente se separan por peso molecular, se utiliza SDS que abre los puentes
disulfuro y carga las proteínas negativamente. Luego literalmente se saca una foto del gel haciendo
transferencia de las proteínas (es ahí cuando se habla de western blot, western es la separación
electroforética de proteínas y blot la transferencia), dependiendo de la capacidad del laboratorio se puede
hacer transferencia mecánica o electrotransferencia. En el papel en el que se a hecho el western blot se
realiza la reacción Ag-Ac, se le adiciona la enzima y se revisa con el cromógeno, se obtiene una muestra
con una serie de bandas marcadas que corresponden a las proteínas inmunogénicas.
- Se puede realizar separación electroforética PAGE-
SDS para péptidos de M. tuberculosis, marcando
proteínas de 30, 47 y 58 KDa. Estas proteínas se
deben extraer, cortar, correr electroforeticamente y
transferir al papel de nitrocelulosa donde se hace la
reacción Ag-Ac. 
- Actualmente hay pruebas ELISA de cuarta
generación que permiten medir anticuerpos y
antígenos al mismo tiempo (antiguamente el western blot
se realizaba como muestra confirmatoria de la
ELISA).
- Western blot para VIH (confirmación de resultados
positivos en ELISA):
• Se utiliza una banda de referencia con todas las proteínas del virus. Según la OMS se considera positivo
un diagnóstico de VIH con presencia de dos proteínas gp y una proteína p, pero además p24 y p23
positivas son marcadores de infección.
• Se debe realizar un control negativo, en el cual solo se debe marcar la banda o el punto control (sc). Esto
se debe realizar porque se está trabajando con proteínas susceptibles a pH, temperatura, luz, etc.
• Si la prueba no es concluyente, a los 20 - 30 días se debe repetir para confirmar el diagnóstico, en la
segunda prueba se deben correr al mismo tiempo las bandas que dieron positivas en la primera (si no
hubo una reacción cruzada la primera vez, en la segunda muestra aparecerán muchas bandas más). 
InmunoComb
 
- Es una prueba de campo que no requiero un ELISA reader, ni un microscopio. 
- Es una ELISA en papel, en donde los antígenos o anticuerpos están fijos en el papel. Todos los elemento
desde las sustancias de dilución del suero, el conjugado y el sustrato hasta la solución para dar la reacción
están en el papel. Se obtienen puntos producto de la reacción enzima - sustrato (parte de la base del
western blot).
- Es una ELISA mejorada, es específica pero no sensible. Se intentó utilizarla como prueba para el
diagnóstico de VIH positivo, pero no funcionó bien (sin embargo,
en otras pruebas de campo funciona muy bien).
- Tiene como ventaja que es una inmunocromatografía, la
formación de los complejos se da por oro coloidal que se precipita
y da bandas positivas y negativas (hay una banda que siempre
debe dar positiva que es el control y otra que es la de test). Si se
quiere medir la presencia de un virus, se agrega el conjugado que
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es un anticuerpo con oro coloidal, si hay virus va a precipitar (la banda tiene un anticuerpo de captura,
ELISA sandwich).
- Pasos:
1. Pre incubación de la bandeja en desarrollo.
2. Adición de muestras y controles en la fila A (mezclar).
3. Sacar el peine de la bolsa.
4. Insertar el peine y mezclar en la fila A (incubar).
5. Abrir la fila B.
6. Absorber el exceso de líquido adherido a los dientes.
7. Insertar el peine y agitar en la fila b (incubar), después
mezclar o agitar e incubar en las filas C, D y E.
8. Debe haber una reacción de color en la fila F.
9. Leer los resultados, guardar el peine para la documentación a largo plazo y hacer seguimiento del
paciente.
- Los pacientes VIH positivo al toser no expectoran bacilos, pero se ha observado que orinan un antígeno de
la pared de las bacterias (LAM y MPT64, este último específico de tuberculosis). Por esta técnica, se puede
medir en la orina el LAM y hacer el diagnóstico. La ventaja de esta prueba es que, a pesar de no ser barata,
el clínico obtiene el resultado en muy poco tiempo (20 minutos).