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UNL. FBCB. QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2019 Respuestas Coloquio 8 Problema 1 a) ¿Qué diferencias espera obtener en el espectro de emisión (rango: 400- 600 nm) si realiza la excitación a una longitud de onda de 320 nm o a 350 nm? ¿Cuál elegiría? ¿Por qué? La altura del pico de absorbancia a 320 nm es menor que a 350 nm, esto indica que la probabilidad de que se produzca la absorción a 320 nm, es menor que a 350 nm. Por lo tanto, si se excita a 320 nm la intensidad de emisión será menor (porque la absorción es menor). Se excitan menor número de moléculas emiten menor número de moléculas. La quinina presenta dos picos de excitación (dos picos de absorción energía radiante). Uno a 320 y otro a 350 nm. Implica que tiene dos posibilidades de promoción electrónica: ΔE=S2 – S0 > ΔE= S1 – S0 En el diagrama de niveles de energía puede observarse que se necesita mayor energía para que se produzca la promoción: S0 - S2 Por esta razón el pico que corresponde a ΔE=S2 – S0 en el espectro aparece en la zona de mayor energía (menor λ). La velocidad de relajación vibracional y rotacional y la probabilidad de que se produzca conversión interna (perdidas de energía sin emisión) entre S2 y S1 son mucho más rápidas que la relajación con emisión, entre S2 y S0. Por esta razón las moléculas que se excitaron hasta S2, se relajan sin emisión hasta S1. La emisión se produce cuando se relaja del nivel más bajo de S1 hasta S0 presentando un solo pico de emisión. Elegiría como λ de trabajo: 350nm de excitación y 450 nm de emisión. UNL. FBCB. QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2019 b) ¿Qué es el corrimiento de Stokes? ¿Por qué ocurre? El corrimiento de Stokes o desplazamiento de Stokes: es un corrimiento en una hacia frecuencias menores o de una longitud de onda hacia mayores λ. La mayoría de las moléculas se excitan a determinadas λ y emiten a mayores λ. Este desplazamiento es consecuencia de la eficacia de la relajación vibracional y rotacional, y de la conversión interna. La quinina se excita a 320 o 350 nm y emite a 450 nm, estas diferencias de λ es lo que se denomina desplazamiento de Stokes Muchas especies moleculares también presentan fluorescencia de resonancia (igual λ de excitación y emisión), pero lo más frecuente es encontrar bandas de fluorescencia o de fosforescencia molecular centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia. Problema 2. Construcción de una curva de calibrado 20 mg de quinolona /GRAGEA 50 mL 10 mL 100 mL 1mL RF 2 mL 10 mL 𝐶𝑀 = 20 𝑚𝑔 50 𝑚𝐿 ∗ 10 100 2 10 1000 𝑚𝐿 1 𝐿 = 8 𝑝𝑝𝑚 La curva debe prepararse al doble de la concentración de la muestra: rango de trabajo: 0 a 16 ppm Elijo 5 puntos: 0, 3, 6, 9, 12, 15 ppm SOLUCIÓN PATRÓN: 120 mg quinolona/100 mL = 1200ppm 𝑉𝑖 = 3 𝑝𝑝𝑚 ∗ 25 𝑚𝐿 1200 𝑝𝑝𝑚 = 0.0625 𝑚𝐿 No puedo medir ese volumen. Planteo una dilución de la SP: 1 mL * Cdil = 0.0625 mL * 1200 ppm Cdil=75 ppm Dil SP = 75/1200 1/16 = 25/400 si se dispone de matraz de 400 mL Si no hacer dos diluciones consecutivas: (5/20*5/20) o (5/20*25/100). Matraces 1 2 3 4 5 6 V SP (mL) 0 1 2 3 4 5 C SP (ppm) 0 3 6 9 12 15 RF (mL) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Enrasar a 25 mL con agua destilada La cantidad de RF en la curva de calibrado se calculó respetando la proporción en que se agregó a la muestra: Muestra: 1 mL de RF en 10 mL finales. Entonces: Curva cal.: 2.5 mL en 25 mL finales. BLANCO DE REACTIVOS: Matraz 1 BLANCO DE MUESTRA: una gragea se disuelve con un solvente orgánico, enrasando a 50 mL. De esta solución se toman 10 mL y se llevan a un volumen de 100 mL. De esta última solución se colocan 2 mL en un matraz de 10 mL (sin agregado de RF) (se resta a la muestra). UNL. FBCB. QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2019 Problema 3. 2.469 g 50 mL 3 x 30 mL 250 mL 𝐶𝑀 = 10 𝑚𝑔 100 𝑔 ∗ 2.469 𝑔 0.250 𝐿 = 1 𝑝𝑝𝑚 = 1000 𝑝𝑝𝑏 La respuesta instrumental es lineal hasta 100 ppb. Lo correcto, cuando se calculan curvas de calibrado de adición estándar, es trabajar con la mitad, o los 2/3 del rango de concentraciones donde se cumple la linealidad. Planteo un rango de 0 a 50 ppb: 0, 10; 20; 30; 40; 50 ppb Cálculo del VM: 𝑉𝑀 = 25 𝑝𝑝𝑏 ∗ 10 𝑚𝐿 1000 𝑝𝑝𝑏 = 0.25 𝑚𝐿 Planteo una dilución previa a la muestra para tomar un volumen de 1 mL: 1 mL * Cdil = 0.25 mL * 1000 ppb Cdil=250 ppm Dil Muestra = 250/1000 = 25/100. Entonces ahora coloco 1 mL de Muestra Diluída en cada matraz. Cálculo SP: 𝑉𝑖 = 10 𝑝𝑝𝑏 ∗ 10 𝑚𝐿 100000 𝑝𝑝𝑏 = 0.001 𝑚𝐿 No puedo medir ese volumen. Planteo una dilución de la SP: 1 mL * Cdil = 0.001 mL * 100000 ppb Cdil= 100 ppb Dil SP = 100/100000 = 1/1000 Matraces 2 3 4 5 6 7 V SP (1/1000) (mL) 0 1 2 3 4 5 C SP (ppb) 0 10 20 30 40 50 VM (25/100) (mL) 1 1 1 1 1 1 RF (mL) 1 1 1 1 1 1 Enrasar a 10 mL con agua destilada Problema 4. UNL. FBCB. QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2019 a) Como se puede observar con etanol (pH 13) la rivoflabina no fluoresce, lo que puede estar influenciado por el pH de la solución. A dicho pH la rivoflavina está completamente cargada de manera negativa, mientras que, en las otras 2 condiciones, el pH del medio es próximo a 5, por debajo del valor de pka, por lo que estará cargada positivamente. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo provienen del número de especies resonantes diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas de las moléculas. b) Se puede inferir que para la rivoflabina es conveniente trabajar a pH ligeramente ácido (5,5 o 4,7). Con buffer fosfato la fluorescencia es un poco mayor (mayor pendiente) que al trabajar con ácido acético. c) La polaridad del solvente también tiene influencia en la fluorescencia, debido al efecto hipsocrómico (se desplaza hacia longitudes de onda menores) y batocrómico (se desplaza hacia longitudes de onda mayores) que el solvente ejerce sobre el compuesto. En general por efecto de la polaridad del solvente, se espera que a mayor polaridad existirá un corrimiento hacia zonas del espectro de menores energías, como se observa en la imagen que se muestra a continuación: Por lo tanto, el espectro de emisión de la rivoflabina (en las condiciones de no apagamiento) se correrá hacia zonas de menor energía (mayor λ): Mayor desplazamiento: agua > ácido acético >10% etanol/90% agua> buffer fosfato Problema 5. La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en la mayoría de las moléculas al subir la temperatura, porque al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivación por conversión externa. Una disminución en la viscosidad del solvente aumenta también la probabilidad de conversión externa y ocasiona el mismo resultado. Problema 6. Determinación de oxatomida (OXA) en comprimidos. 1.152 g 50 mL 200 mL 0.5 mL 5 mL (matraces de la curva de adición estándar) UNL. FBCB. QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2019 Concentración de OXA en la muestra: 2*Ordenada al origen=242 CM= (242 – 121)/20.7 = 5.8454 ppm 𝑆𝑋𝑖𝑛𝑐 = 𝑆𝑦/𝑥 𝐴 √ 1 𝑀 + �̅�2 𝐴2 ∑ (𝑥𝑖 − �̅�) 2 𝐼 = 2.4636 20.7 √ 1 15 + 245.533̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅2 20.72270= 0.09 𝑝𝑝𝑚 (𝐶𝑀 ± ∆𝐶) = ( 5.8454 𝑚𝑔 1 𝐿 ± 0.09) 𝑝𝑝𝑚 ∗ 5 0.5 ∗ 0.2 𝐿 1.152 𝑔 ∗ 0.25 𝑔 1 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑟𝑖𝑚𝑖𝑑𝑜 = (2.537 ± 0.04)𝑚𝑔/𝑐𝑜𝑚𝑝 (2544)×10-2 mg OXA/comp.
