DNA Recombinante, Clonagem Molecular, PCR, Sequenciação, Plasmídeos

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Biologia Molecular – estudo da biologia a um nível molecular que inclui a estrutura, função e 
composição de moléculas biologicamente importantes (DNA, RNA e proteínas). 
Tecnologia de DNA Recombinante – conjunto de técnicas para manipulação de DNA, incluindo a 
identificação e clonagem de genes, estudo da expressão dos genes clonados e a produção em larga 
escala do produto do gene. 
Engenharia Genética – processo de transferência de DNA de um organismo para outro, resultando em 
modificações genéticas. 
Biotecnologia – produção de bens e serviços usando sistemas/organismos/processos biológicos. 
Biotecnologia Molecular – Tecnologia de DNA recombinante + Biotecnologia 
1944 – DNA como material genético (Avery, MacLeod, McCarty) 
1953 – Estrutura do DNA (Watson, Crick) 
1970 – Isolamento de endonuclease de restrição 
1973 – Tecnologia de DNA Recombinante (Boyer, Cohen) 
1976 – Técnicas para sequenciação do DNA 
1980 – Patenteação microrganismos geneticamente manipulados. 
1981 – Venda de sintetizadores de DNA automatizados 
1988 – Método de PCR 
1995 – Sequenciação de genoma de um organismo celular 
1996 – Sequência de DNA completa de um eucarionte (S. cereviseae) 
 – Plantação comercial de colheitas geneticamente modificadas 
1997 – Clonagem nuclear de um mamífero (ovelha) com um núcleo celular diferenciado 
2000 – Sequenciação do DNA de Arabidopsis 
2001 – Publicação do genoma humano 
2009 – Aprovação da primeira droga produzida em animais geneticamente modificado (cabra) 
2010 – Criação da primeira célula sintética 
2016 – Aprovação do teste de segurança da tecnologia de edição de genoma da CRISPR 
Organismos Modelo em Engenharia Molecular 
Cada organismo usado em biologia celular e molecular tem vantagens para certos tipos de estudos 
 
Vírus 
Bacteria (E. coli) 
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae) 
Planárias (Schmidtea mediterranea) 
Algas (Chlamydomonas reinhardtii) 
Moscas da Fruta (Drosophila melanogaster) 
Peixe Zebra (Danio rerio) 
Arabidopsis thaliana 
Rato (Mus musculus) 
Nemátodos (Caenorhabditis elegans) 
Tecnologia de DNA Recombinante 
Ferramentas essenciais 
- Enzimas de restrição – permite cortar o DNA em fragmentos específicos 
- Vetores de Clonagem – permitem amplificar os fragmentos no hospedeiro 
- Ligases - ligam o DNA fragmentado ao vetor 
Metodologias 
- Clonagem molecular 
- Processos de seleção dos recombinantes 
Deteção dos genes de interesse 
- Biblioteca de genes ou genoma 
Estrutura e Expressão de Genes de Procariotas 
Genes Policistrónicos – Gene que possui diferentes operões, operadores, promotor, diferentes ORFs, 
mensageiro policistrónico único com diversos locais de ligação ao ribossoma (cada lugar para uma 
proteína diferente). 
 
 
Em procariontes, a RNA polimerase liga-se ao nucleótido -10 e -35 na região do promotor, 
relativamente ao local de início da transcrição (+1 – primeira base do mRNA). 
O fator σ (sigma) é o local da enzima polimerase que reconhece e se liga ao DNA. 
Operadores são as regiões regulatórias onde existem proteínas repressoras ou ativadoras que alteram 
a transcrição da RNA polimerase. 
Etapas da Clonagem Molecular 
1. Isolamento e Fragmentação do DNA de interesse (insert) 
- Digestão com enzimas de restrição 
- PCR – amplificação de um fragmento específico de DNA 
2. Escolha de um sistema vetor / hospedeiro 
- Vetor de replicação autónoma 
- Hospedeiro de clonagem – organismo recetor final 
3. Ligação do DNA heterólogo (insert) ao vetor 
- Ligase do fago T4 
- Ligase de E. coli 
4. Mecanismo de transferência do “construct” para a célula hospedeira 
- Transformação / Transfeção 
- Infeção / Transdução 
-Conjugação 
5. Seleção “Screening” dos recombinantes 
 
 
 
Inibidor Operão Lac 
 A 
Operador Promotor 
Z Y 
-35 -10 +1 
Clonagem Molecular 
Requer um fragmento de DNA e um vetor de clonagem 
- Isolamento dos fragmentos de DNA: requer enzimas de restrição, PCR, PCR de transcrição 
reversa, eletroforese em gel, síntese química de DNA. 
- Clonagem dos fragmentos de DNA: vetor, ligação, transformação, purificação 
- Identificação dos fragmentos de DNA: sequenciação do DNA, Southern blot, Northern blot 
Clonagem do plasmídeo 
Enzimas de Classe II 
Reconhecimento e corte de sequências de bases específicas com simetria bilateral – palindrómicas 
Endonucleases – reconhece sequências específicas e corta no interior do DNA. 
BLUNT ENDS - Cortam no mesmo sítio nas duas cadeias 
 - Origina extremidades abruptas em cadeia dupla 
 
STICKY ENDS - Cortam em locais distintos, mas equidistantes do eixo 
- Origina extremidades salientes em cadeia simples 
 
Nas bactérias, as enzimas de restrição são usadas como defesa contra infeções. Enquanto o DNA 
hospedeiro está sempre metilado (por uma metilase que adiciona CH3), o DNA infecioso não está, o 
que leva ao corte pelas endonucleases. 
A primeira enzima de restrição usada para corte de uma sequência específica é designada protótipo. 
Qualquer outra endonuclease de restrição que ataque a mesma sequência que o protótipo, é 
designada isosquisómero – não têm de cortar da mesma forma. 
Enzimas importantes: 
- Nuclease Mung Bean – corta a extremidade saliente das blunt ends, tornando-as abruptas 
- Polimerase Klenow – sintetiza a cadeia complementar à extremidade saliente, tornando-a abrupta 
- Fosfatase Alcalina – remove o grupo fosfato da extremidade do DNA que impede a re-circularização 
- Polinucleótido Cinase do T4 – fosforila de novo a extremidade do DNA 
Vetor de Clonagem 
Caraterísticas importantes: 1. Multiple Cloning Site (MCS) 
 2. Origem de replicação (Ori) – permite autorreplicação 
 3. Marca de Seleção – permite isolar os transformantes dos wt 
Construção de Bibliotecas e Screening 
Bibliotecas de genes / genoma: 
Há digestão parcial do DNA de interesse com uma enzima que recorta em muitos locais do genoma. 
A digestão não é levada até ao fim, de forma a obtermos fragmentos relativamente longos. Num gel 
de agarose, os fragmentos formam arrastamento pois existem de diversos tamanhos, desses devem 
ser colhidos os que se encontram no peso desejado. 
Os fragmentos, com extremidades coincidentes com as extremidades do bacteriófago λ recortado com 
BamHI (elimina uma zona dispensável do DNA do fago), são ligados ao bacteriófago λ aberto, num 
único vetor recombinante de tamanho capaz de ser empacotado in vitro. 
Screening: Após criação de biblioteca genómica, há infeção de bactérias pelo fago λ, formando regiões 
de placas fágicas. É colocado um filtro de nitrocelulose na placa para recolha dos fagos. O filtro é 
incubado em solução alcalina para lise e desnaturação do DNA libertado. Depois, há hibridação do 
DNA do fago com sondas de localização de gene de interesse, havendo sinal quando o fragmento do 
fago tiver o gene complementar à sonda. 
Produção da Sonda 
- De DNA: O DNA contendo o gene de interesse é desnaturado e colocado na presença de primers que 
vão se ligar ao DNA e dar início à incorporação de NTPs e dNTPs. Estes últimos são detetados por 
autoradiografia. 
- De oligonucleótidos: Após a síntese da proteína de interesse, há digestão por uma protease, e de 
seguida sequenciação dos péptidos. Com a sequência de aminoácidos, encontramos os codões que os 
codificam. A maior zona com menor degeneração é marcada nas extremidades, pela polinucleótido 
cinase, que transfere um fosfato ϒ do ATP e será usada como sonda. 
Biblioteca de cDNA 
São bibliotecas onde estão representados os genes a ser expresso num determinado local e tempo. 
Para purificar o mRNA, utiliza-se uma matriz de celulose contendo Oligo-dT que é complementar à 
extremidade poli-A. Através de uma lavagem são excluídos os RNAs não poliadenilados (tRNA e rRNA). 
Os mRNA associados à matriz são eluídos com auxílio a um tampão (sal). 
O mRNA é hibridado com um oligo-dT, que serve de início à transcrição em cDNA com recurso a uma 
transcriptase reversa. O RNA é removidocom uma solução alcalina. Ao DNA é adicionado uma cauda 
poli-G na 3’, ao qual se liga um primer de poli-C que dá início à síntese da cadeia complementar. O 
dsDNA é metilado. São adicionados locais de corte da enzima de restrição que crie extremidades 
compatíveis com as extremidades do bacteriófago λ. 
Screening: - Usando uma sonda de DNA com sequência homóloga (ex. cDNA homólogo ou clone 
de gene de espécies relacionadas. 
 - Usando uma sonda de oligonucleótidos baseado numa sequência de aminoácidos 
conhecida (requer purificação da proteína e alguma sequenciação de péptidos). 
 - Usando um anticorpo contra a proteína de interesse (requer o uso de um vetor de 
expressão). 
Técnicas de Polymerase Chain Reaction – PCR 
- Técnica de clonagem sem hospedeiro – amplificação de cadeias de DNA iguais. 
- Utiliza uma Taq Polimerase de uma bactéria termofílica, que não desnatura a 95ºC. 
Processo: 
1. Adição de primers foward (liga à 3’-5’) e reverse (liga à 5’-3’), 
dNTPs e Taq Polimerase; 
Aquecimento a 95ºC para desnaturação do dsDNA; 
Arrefecimento a 52º-60ºC para annealing dos primers. 
2. Aquecimento a 72ºC para extensão dos primers (síntese das 
cadeias complementares) pela Taq polimerase. 
- Podem ser adicionas sequências de reconhecimento de enzimas de restrição às extremidades dos 
primers, para criar extremidades compatíveis no momento da clonagem. 
- T-Vetores têm extremidades 3’-TTT que coincidem com a extremidade 3’-A criada pela Taq DNA 
polimerase. 
O ciclo repete-se  30x. 
 
Aumento exponencial 
do número de cópias 
de DNA 
A 
T A 
T T 
3’ 
3’ 
T 
3’ 
3’ 
+ 
A 
A = 
Síntese Química de DNA 
Síntese por adição sequencial de derivados de nucleótidos reativos, no sentido 3’→5’. 
 → Os oligonucleótidos são sobreponíveis, de maneira a cobrir todo 
o gene; 
 
→ A mistura de oligonucleótidos é aquecido, levando à hibridação 
das regiões. 
 
→ Com uma DNA polimerase, dá-se a síntese do resto da cadeia de 
DNA complementar aos oligonucleótidos molde. 
→ Uma DNA ligase estabelece uma ligação entre os oligonucleótidos 
e as regiões sintetizadas na mesma cadeia. 
Gibson Assembly 
Vários oligonucleótidos sobreponíveis podem ser ligados numa única reação isotérmica. 
Os oligonucleótidos são criados com homologia terminal. 
Passos e Enzimas: 
1. Formação de extremidades 3’ estendidas; 
 T5 exonuclease – cria ssDNA 3’ estendido ao remover bases da 
extremidade 5’ 
 - Instável aos 50ºC, desnatura 
2. Hibridação dos terminais dos fragmentos (são complementares); 
3. Preenchimento das regiões em falta; 
 Phusion DNA polimerase de alta fidelidade – liga-se às extremidades 
5’ e preenche a região em falta 
4. Ligação entre regiões da mesma cadeia. 
 Taq DNA ligase – liga as regiões 5’ sintetizadas à extremidade 3’ do 
terminal hibridado 
Vantagens - Não são necessários sítios específicos de restrição. 
 - Não deixa marca no sítio de ligação entre fragmentos; 
 - Menos passos; 
 - Pode combinar vários fragmentos de DNA de uma só vez. 
Desvantagens: - Custo e tempo de entrega de primers customizados; 
 - Pode haver rearranjos entre zonas de homologia perto dos terminais; 
 - Estrutura secundária diminui a eficácia da ligação. 
 
Técnicas de Sequenciação 
- Sequenciação de Sanger 
Materiais: DNA polimerase; dNTP’s e ddNTP’s (didesoxinucleótidos); primers; DNA molde 
Num meio com dNTP’s e ddNTP’s, a síntese de diversas cadeias é feita em simultâneo. Sempre que é 
adicionado um ddNTP, a síntese dessa cadeia é terminada pois esse não possui um grupo 3’-OH para 
reagir com o 5’-P do nucleótido seguinte. 
Os ddNTP’s são marcados com fluorescência de cor de acordo com a base que carrega. Através de 
uma eletroforese capilar os fragmentos de cor são separados, e um computador pode ler o espetro 
de absorvência, atribuindo cada base a uma cor. 
- Piro sequenciação 
- Sequenciação usando terminadores de cadeias reversíveis 
- Sequenciação por síntese de moléculas 
Genómica 
As sequências que foram sequenciadas podem ser alinhadas e montadas, formando contigs. 
A anotação do genoma procura caraterísticas conservadas da sequência e regiões codificantes de 
proteína (ORF) 
 Procarionte: TTGACAT...TATAAT (Promotor); RBS – início de tradução; zona codificante 
 Eucarionte: CAAT...TATA (Promotor); zona codificante 
Transcriptómica 
Criação de um perfil de Expressão Gênica a partir dos transcritos produzidos pelos genes ativos numa 
célula, usando um microarray de DNA. 
  
 Lamela contendo genes representativos de uma certa célula. Duas amostras da 
mesma célula, mas em condições diferentes têm o cDNA marcado com um fluoróforo diferente, que 
vai resultar num gel com poços de cor, de acordo com o gene ativo em cada amostra. 
Proteómica 
Pode ser feita por sequenciação dos aminoácidos de peptídeos, usando um espetrofotómetro de massa 
e fazendo coincidir a informação obtida numa base de dados de genes/proteínas. 
Metabolómica 
Estudo de todas as pequenas moléculas através de cromatografia gasosa. 
Interatómica 
Mapeia as interações entre proteínas. 
 
Transcriptómica 
Genómica 
Metabolómica 
Proteómica 
~150000 transcritos 
~1000000 proteínas 
 
~3000 metabolitos 
 
Maioritariamente 
conhecido 
Maioritariamente 
desconhecido 
Impacto no 
ambiente 
~10000 genes 
Clonagem Molecular 
Vetor – Molécula de DNA usada como veículo para transportar artificialmente material genético 
estranho para dentro de uma célula. 
 - A sua escolha depende do tipo de hospedeiro a usar. 
 Plasmídeos – dsDNA circular que possui sequências de DNA que permitam se replicar na célula 
hospedeira. Possui uma Origem de replicação que permite que a molécula se multiplique de 
forma semi-independente. 
 Cosmídeos – plasmídeos híbridos que contêm sequências Cos (fago λ), permitem introduzir 
fragmentos maiores do que normal. 
 Vetores Virais – vírus modificados geneticamente de forma a não serem infeciosos. 
 Cromossomas Artificiais – feitos em laboratório - BACs (bactéria), YACs (levedura), HACs 
(humano). Inclui origem de replicação, centrómero e regiões e sequências teloméricas. 
Plasmídeos 
Propriedades: 
- Devem possuir uma região semelhante a uma Origem de Replicação para conseguir se auto-replicar. 
- Episomas – Alguns plasmídeos são capazes de se inserir no cromossoma – plasmídeos integrativos. 
Classificação: 
- Conjugativos ou não-conjugativos – os conjugativos possuem genes de transferência e genes que 
promovem a conjugação entre diferentes células através da formação da sex pili; 
- Pertencem ou não a grupos de incompatibilidade – uma célula pode conter mais do que um 
plasmídeo diferente, mas só consegue conter plasmídeos de grupos compatíveis entre si. 
Incompatíveis normalmente possuem o mesmo sistema de replicação – competem pelos mesmos 
compostos; 
- Por função – plasmídeos F – de fertilidade, capazes de conjugar e resultam na formação da sex pili; 
 – plasmídeos R – de resistência, contêm genes de resistência a substâncias; 
 – plasmídeos Col – contêm genes para bacteriocinas – proteínas que matam bactérias; 
 – plasmídeos degradativos – contêm genes capazes de degradar variadas substâncias; 
 – plasmídeos de virulência – tornam a bactéria num patogénio 
Tipos de Plasmídeos: 
- De Clonagem – para propagação/amplificação do DNA in vivo 
- De Expressão – para expressar uma proteína heteróloga no hospedeiro final (expressar em grande 
quantidade); 
- Repórter – contêm gene que codifica proteínas que reagem em certas condições (reporta o que se 
passa e localiza proteínas; ex. lacZ ou proteína fluorescente) 
- Virais – derivados do fago λ, adenovírus ou lentivírus; 
- De gene knock-down (inserção inativante) – inativam determinados genes no cromossoma; 
- De Engenharia genómica – construídos artificialmente, usados para editar genomas. 
  
Origem de replicação; Marca de resistência; MCS; Insert; Promotor; Marcador de Seleção; 
Primers; Terminadores 
 Terminadores:Em bactérias são Independentes de Rho; normalmente aparecem 2x para 
garantir a terminação. Em mamíferos têm a sequência AAUAAA que promove a poli-adenilação 
e terminação. 
 
A inserção dos plasmídeos nas bactérias, pode ser feita de duas formas: 
Transformação Química 
- As células são transformadas em células competentes (aptas a receber o DNA) a partir de tratamento 
com Cloreto de Cálcio. As células são incubadas e submetidas a choque térmico que ajuda a 
incorporação do DNA, seguindo um tratamento para recuperação da membrana, antes de serem 
colocadas num meio onde serão selecionadas as transformantes. 
Eletroporação 
- A diferença encontra-se no choque elétrico em pulsos em vez de térmico. 
Blue-White Screening 
Bactérias que possuem o gene LacZ tornam a célula capaz de produzir β-galactosidase. 
Em bactérias que sofreram a deleção de uma zona no lacZ, a β-galactosidase não é funcional. Na 
presença de X-gal: 
 Os plasmídeos que possuem o gene para lacZα, se não receberem o fragmento, 
transportam a secção em falta que vai fazer complementação α ao gene LacZ e 
tornar as células hospedeiras capazes de produzir a enzima funcional → AZUL 
 Plasmídeos que receberam o fragmento têm a zona do gene lacZα 
interrompida com o fragmento clonado, e não permitem que a bactéria produza 
uma β-galactosidase funcional → BRANCA 
Vetores de Expressão e os Hospedeiros 
Estes vetores são usados para expressão de proteínas heterólogas. 
Requerem: 
 MCS, Gene de Resistência, Marcador de Seleção, e ORI no hospedeiro 
 Promotor reconhecido pela maquinaria do hospedeiro 
 Terminador de transcrição funcional no hospedeiro 
 Local de ligação Ribossómica do hospedeiro (RBS) 
Sistema de Expressão pET 
 Plasmídeo pET: - Marca de Resistência a Antibiótico; ORI (em E. coli); MCS; gene LacI 
  
Promotor e Terminador reconhecidos pela 
RNA polimerase do fago T7; Operador lacI 
Utiliza um E. coli modificada que possui o gene que codifica para uma polimerase do fago T7. Este 
gene está sob o controlo do operador lac. 
Num meio sem indutor (IPTG ou alo-lactose), o operão lac está bloqueado por um tetrâmero lacI, e 
não está a ser produzida a polimerase do fago T7 e consequentemente o gene não é expresso. 
Com indutor, o tetrâmero perde afinidade para o DNA e o operador fica livre. 
Sistema de Expressão pLEX 
 O repressor cI do fago λ é transcrito a partir do promotor pcl. O gene de interesse está sob o controlo 
do promotor pL e operador oL, que é regulado pelo repressor cI. 
A 30ºC, o repressor liga-se ao promotor e não há transcrição do gene. 
Um mutante de cI, mais sensível à temperatura, aos 42ºC desnatura e o gene é transcrito 
Plasmídeo YCp e YEp 
Plasmídeos de levedura. 
Conseguem se replicar autonomamente 
YCp 
- Possuem uma região centromérica CEN e 
sequência para replicação autónoma ARS 
 Permitem que o plasmídeo se comporte 
como cromossoma e migre para o fuso 
cromático. Mantêm o número de cópias 
entre célula mãe e filha. 
YEp 
- Possuem ORI e Marcador de levedura STB 
 
YIp 
Não tem região centromérica nem região de replicação autónoma. 
Ao ser inserido numa levedura, só se propaga nas gerações se se inserir no cromossoma. 
A inserção pode ser por: Recombinação simples ou Recombinação dupla. Se um plasmídeo possuir: 
 1 região de homologia – Tendência a Recombinação Simples ~Recombinação 
especializada 
 
 
 
 
 A zona homóloga, após inserção do plasmídeo, aparece duplicada no genoma 
 2 regiões de homologia – Tendência a Recombinação Dupla ~ Recombinação generalizada 
 
 
 
 
Leveduras vs. Bactérias 
Métodos de transformação – Não tem métodos naturais de incorporar DNA 
- Para inserir DNA numa levedura, a construção do plasmídeo é feita em E. coli e depois enviado para 
a levedura após: 
 Tratamento com LiAc que facilita a entrada de DAN 
 Remoção da parede das células, formando spheroplastos e posterior fase de regeneração. 
 Eletroporação 
Seleção de Transformantes 
 Complementação de mutações auxotróficos – células mutantes em genes que afetam a 
biossíntese de nucleótidos ou aminoácidos (ura3, leu2, his3) necessitam do plasmídeo para 
sobreviver sem input desses compostos. 
 Marcas de Seleção Dominantes – resistência a formaldeído, Cu2+, resistência a G418 
Digestão por 
restrição 
Digestão por 
restrição 
Recombinação 
homóloga 
Recombinação 
homóloga 
Genes Repórter 
O produto é fácil de detetar e monitorizar. 
São usados para verificar se um gene foi inserido na célula, localizar o gene ou quantificar a expressão 
génica. 
Ex. GFP, dsRed (green or red fluorescent protein), Luciferase, LacZ (β-galactosidase) 
O gene a medir e o gene repórter têm de estar sobre o controlo do mesmo sistema de tradução. 
 Fusão de Transcrição – Origina duas proteínas diferentes 
– O promotor do gene de interesse controla os dois RBS 
– Não dá informação sobre a localização 
 Fusão de Tradução – Origina uma proteína de fusão (interesse + repórter) 
Estas proteínas de fusão podem também ser usadas para facilitar a extração das proteínas alvo, por 
exemplo ao diminuir a permeabilidade da membrana. 
Células de Mamíferos 
Transfeção – método não viral de entrega de DNA nas células (metodologias físicas e químicas). 
Infeção – método viral de entrega de DNA, no qual os vírus se associam às células e injetam a sua 
carga de DNA. 
Metodologias: 
 Física – microinjeção, eletroporação, biolística; 
 Química – transfeção com fosfato de cálcio, transfeção com base em lípidos; 
 Viral – adenovírus, vírus adeno-associados, lentivírus, vírus herpes simplex, adenovírus canino. 
 
K (Seq. Kozak) 
S (Sequência Sinal) – para excreção da proteína para fora da célula 
T (Tag de afinidade da proteína) – facilita o isolamento da proteína por coluna de afinidade 
P (Local de corte proteolítico) – por ação de uma protease, será clivada neste local - separa a proteína 
da cauda de aminoácidos de afinidade 
SC (Codão stop) 
 
 
 
CRISPR 
Molécula de RNA guia 
Proteína (Cas9) com atividade de clivagem de molécula híbrida de RNA 
5’ UTR GOI P T K S SC 3’ UTR