Seminário Tecnicas Biomol: hibridização

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Camila Luiza Delaix
Laura Boose de Mendonça
Técnicas em Biologia Molecular I - 2021/1
Análise de microarray revelou mudanças na expressão de genes 
inflamatórios após tratamento com LSL60101 no modelo de camundongo 
5XFAD.
Alzheimer e inflamação
Emaranhado de proteínas tau 
deixa de estabilizar 
microtúbulos.
Formação de placas de beta-
amilóide.
Substâncias nocivas 
(PAMPS e DAMPS) são 
reconhecidas por 
macrófagos e astrócitos
Desencadeiam resposta 
imune.
Liberação de mediadores 
inflamatórios
Citocinas
IL-1β
IL-6
IL-12
TNF-α
Essa produção excessiva é 
negativa pois acaba 
levando à destruição de 
neurônios saudáveis e piora 
o quadro de 
neurodegeneração.
Introdução
● Receptor de imidazolina I2 (I2-IR): é 
um receptor não adrenérgico 
encontrado no cérebro relacionado 
com a transmissão de sinais entre os 
neurônios. Quando usamos ligantes 
específicos nesse receptor temos ação 
anti-inflamatória e de neuroproteção. 
→ I2-IR foram encontrados desregulados em 
pacientes com doenças neurodegenerativas, 
como a doença de Alzheimer 
LSL60101: É uma molécula ligante 
de I2-IR e mostrou-se capaz de 
reduzir inflamação na DA, 
indicando modulação de vias 
inflamatórias.
5XFAD mouse model
Transgênico duplo APP/PSEN1
Genes mutados na Doença de 
Alzheimer (DA)
Formação precoce de 
placa (proteína beta 
amiloide)
Gliose
Déficits cognitivos e 
comportamentais
Comprometimento da 
memória 
5XFAD 
Mouse model
Objetivo do trabalho
● Entender o papel de 
LSL60101 e 
consequente 
implicação de I2-IR 
no Alzheimer.
Metodologia
● Analisar uma série de 
painéis de expressão de 
genes relacionados à 
inflamação, pra ver se há 
diferença na expressão no 
WT e após tratamento no 
5XFAD LSL60101.
Resumo da 
metodologia 
empregada
qPCR array
Mix SYBR 
Green
Genes que tiveram
expressão reduzida
após tratamento
com LSL60101.
Genes de 5XFAD
tiveram expressão
aumentada após
tratamento.
Análise de 
agrupamento 
hierárquico
Esses genes foram agrupados em 
três grupos com base no perfil de 
expressão usando o pacote do R 
de heatmap
Análise de 
enriquecimento 
funcional desses três 
grupos no Gene 
Ontology
Grupos 2 e 3 mostram 
alterações em 
processos como 
resposta inflamatoria, 
quimiotaxia, via de 
sinalização mediada 
por quimiocina. 
Análise no GO
Principais vias em que 
os grupos estão 
envolvidos.
● Sinalização de 
quimiocina;
● Interação dos 
receptores de 
citocina.
Análise no KEGG
KEGG 
pathway 
map
Up Down
Regulated
● Tratamento com 
LSL60101 pode 
revertar alguns genes 
inflamatórios 
relacionados com 
perda cognitiva
● Transcriptional 
regulatory networks.
● Genes nos grupos 
2 e 3 podem ser 
regulados por 
NFKB1 e RELA, 
subunidades de 
NK-Kβ -> sugere 
regulação do 
processo 
inflamatório.
TTRUST 
database
KEGG 
signaling 
pathway map
Up Down
Regulated
● De fato, vários 
membros da via 
regulatória de NF-kβ
foram reduzidos após 
tratamento.
Para validar os resultados 
anteriores, 10 genes com maior 
diferença significativa na 
expressão (p-value < 0,05) 
foram selecionados e medidos 
por PCR em tempo real dentro 
de cada grupo.
Validação por 
qPCR
Alterações induzidas por LSL60101 no modelo 5XFAD foram 
validadas para Cxcr2 Tlr5 e Sele.
Validação por 
qPCR
Foi observada uma tendência clara de diminuição no grupo tratado 
com 5XFAD LSL60101 para CD40lg, Ccl7 e Ccr4.
Validação por 
qPCR
Pelo contrário, uma tendência crescente no grupo tratado com 
5XFAD LSL60101 foi encontrada para Ccl12, Ccl8 e Cxcl10.
Validação por 
qPCR
● As alterações induzidas por 
LSL60101 no modelo WT não 
foram estatisticamente 
significativas; 
→ Tendência decrescente para 
CD40lg, Ccl8 e Cxcl10 (Figura 5C, I, J) 
→ Tendência crescente para Ccr4 e 
Ccl7 (Figura 5D-E). 
● Alterações significativas nos grupos 
tratados com WT LSL60101- e 
5XFAD LSL60101 foram 
encontradas para CD40lg, Ccl12, 
Ccl8 e Cxcl10 (Figura 5C, H – J
Validação por 
qPCR
Discussão
➔ O tratamento com LSL60101 nos ratos 5XFAD alterou o perfil de expressão dos
genes.
➔ Dois grupamentos mostraram expressão diminuída de genes após tratamento com
LSL60101, indicando efeito anti-inflamatório.
➔ Tratamento com ligantes de IR-I2 como LSL60101 pode atenuar processos
neuroinflamatórios na doença de Alzheimer (DA), alterando a expressão de
mediadores inflamatórios.
➔ Resultados mostraram redução de citocinas pró-inflamatórias e aumento de citocinas
anti-inflamatórias.
➔ A inibição de NF-Kβ mostra melhora nos déficits cognitivos na DA, → a redução dos
genes regulados por NF-Kβ observado nos tratamentos deve proteger contra
neurodegradação.
Conclusão
➔ O presente estudo demonstrou o potencial do uso de 
ligantes a I2-IR, especialmente LSL60101, para 
tratamento do Alzheimer.