Relatório de Fluorescência molecular

Prévia do material em texto

RELATÓRIO DE ANÁLISE INSTRUMENTAL II: 
DETERMINAÇÃO DE QUININO EM ÀGUA TÔNICA POR FLUORESCÊNCIA MOLECULAR
EQUIPE TÉCNICA: 
ANA PAULA MARQUES – Nº 03
ANTÔNIO WANDERSON VIEIRA GOIS – N° 04
CAROLINE DE SOUSA FARIAS – Nº 10
TURMA: 8841 – G1
Salvador – Bahia
Maio, 2015
SUMÁRIO 
 
1. Resumo.................................................................................................................3
2. Introdução............................................................................................................4
3. Objetivos...............................................................................................................8
3.1. Objetivos gerais..............................................................................................8
3.2. Objetivos específicos......................................................................................8
4. Parte de experimental ...........................................................................................9
4.1 Materiais, equipamentos e soluções utilizadas................................................9
4.2 Procedimento experimental............................................................................10
5. Resultados e discussões .......................................................................................12
6. Conclusão .............................................................................................................20
7. Referências ...........................................................................................................21
RESUMO: O trabalho em questão teve por objetivo a determinação de quinino em água tônica se valendo do uso da técnica de fluorescência molecular. A análise fora realizada verificando-se previamente o comprimento de onda de emissão e excitação para o quinino, bem como o efeito do pH e da supressão de haletos na técnica. A análise da amostra de quinino fora realizada, em sequência, sugerindo-se diluições exatas de maneira que as concentrações que quinino na água tônica fossem inclusas nos limites de quantificação da técnica. 
INTRODUÇÃO
A Luminescência é o fenômeno pelo qual espécies emitem luz, em condições específicas e por diferentes causas de excitação. Tais causas de excitação diferem os fenômenos de quimiluminescência, fotoluminescência (fluorescente ou fosforescente), bioluminescência, luminescência de raio X, radioluminescência e eletroluminescência (SILVA, 2000). Em 1669, o médico e alquimista Henning Brandt descobriu o fósforo, que apresentava propriedade de brilhar no escuro, e em contato com o O2 atmosférico inflamava rapidamente. Esta experiência tornou-se a primeira “reação química artificial” denominada “phosfhorus mirabilis”, ou seja, maravilhoso portador da luz. Em 1888 o pesquisador E. Wiedemann (físico alemão) utilizou pela primeira vez o termo quimiluminescência para descrever reações químicas que emitem luz visível e distinguiu a Luminescência da Incandescência, fenômeno no qual há um processo de emissão de radiação eletromagnética por um corpo devido a sua alta temperatura (BILHALBA, 2011).
	Uma das características mais relevantes da fluorescência molecular está na sua sensibilidade intrínseca, a qual frequentemente é de uma a três vezes maior que a espectroscopia de absorção. De fato, para determinadas espécies sob condições controladas, a presença de uma única molécula pode ser determinada pela espectroscopia de fluorescência. Outra vantagem está na faixa linear de concentração dos métodos de fluorescência, a qual é significativamente maior que aquela encontrada na espectroscopia de absorção. Entretanto, os métodos de fluorescência são muito menos aplicados que os métodos de absorção em razão do número limitado de sistemas químicos que fluorescem com intensidade apreciável e de certos interferentes (CROUCH et al., 2006).
	O termo fluorescência foi inventado por Stokes em 1852, derivado da palavra fluoride. Stokes foi o primeiro a estabelecer claramente que a fluorescência era um processo de emissão, e propôs o princípio que hoje conhecemos como “Lei de Stokes”, que estabelece que o comprimento de onda de uma emissão fluorescente é sempre maior que o da excitação (SILVA, 2000). Na fluorescência, a emissão e a absorção ocorrem em um tempo curto, porém mensurável, da ordem de 10-12 a 10-9 segundos. Se ocorrer um retardamento (>10-8 segundos) porque a transição é lenta, o fenômeno é conhecido como fosforescência. O retardamento pode ser de frações de segundo ou de várias semanas (VOGEL, 2002). 
Em ambos os casos, a natureza da partícula, seja a estrutura molecular, a orientação e a isomerização, bem como as condições químicas e físicas em que se encontram, influenciam se a amostra irá ou não apresentar algum destes fenômenos e a intensidade (CROUCH et al., 2009). A fluorescência e a fosforescência são casos particulares da fotoluminescência, um termo geral aplicado aos fenômenos de absorção de luz.
	A técnica que trabalha fotoluminescência mais comum é a fluorimetria, que se distingue das demais pelo fato de a molécula excitada retornar ao estado fundamental imediatamente depois de excitado. Quando uma molécula absorve radiação eletromagnética na faixa do UV/vis, ocorre mudança em seu estado eletrônico, e um de seus elétrons passa para um orbital de energia mais alta (VOGUEL, 2002). 
É importante salientar que a fluorescência dificilmente é resultado da absorção de radiação ultravioleta de comprimentos de onda menores que 250 nm, pois essa radiação é suficientemente energética para causar desativação dos estados excitados pela pré-dissociação ou dissociação. Por exemplo, a radiação a 200 nm corresponde a cerca de 140 kcal/mol. A maioria das moléculas orgânicas tem pelo menos algumas ligações que podem ser rompidas por energias dessa magnitude. Como consequência, a fluorescência decorrente das transições σ*→σ raramente é observada. Ao contrário, esse tipo de emissão é restrito aos processos menos energéticos π*→n (em que um elétron de um orbital não-ligante é promovido a um orbital π anitligante) e π*→π (em que um elétron de um orbital π ligante é promovido a um orbital π antiligante) (CROUCH et al., 2009).
Sabe-se que uma molécula eletronicamente excitada normalmente retorna ao seu estado excitados mais baixo por uma série de relaxações vibracionais rápidas e conversões internas que não produzem emissão de radiação. Assim, a fluorescência origina-se geralmente de uma transição do estado vibracional mais baixo do primeiro estado eletrônico excitado para um dos níveis vibracionais do estado eletrônico fundamental. Dessa forma, para a maioria dos compostos fluorescentes, a radiação é produzida por uma transição π*→π ou π*→n (CROUCH et al., 2009).
A excitação do tipo π*→π provoca fluorescência significativa. A excitação do tipo π*→n produz fluorescência pouco intensa. As transições eletrônicas de bandas de transferência de carga também provocam fluorescência intensa. A energia eletrônica, entretanto, não é o único tipo de energia afetado quando uma molécula absorve um fóton de radiação UV. As moléculas orgânicas têm um grande número de vibrações e cada uma delas contribui com uma série de níveis vibracionais quase igualmente espaçados para cada estado eletrônico. Os vários estados de energia disponíveis para uma molécula podem ser representados por meio de um diagrama de níveis de energia (VOGEL, 2002).
Para que uma molécula emita radiação por fluorescência, ela deve, primeiro, ser capaz de absorver radiação. Nem todas as moléculas que absorvem no UV/vis são fluorescentes e é útil quantificar a fluorescência de uma dada espécie. O rendimento quântico é definido como a fração da radiação incidente que é reemitida como fluorescência em um determinado comprimento de onda (equação 1).
 	 (Eq. 1)
	Algumas das moléculas excitadas podem vir a perder o excesso de energia por dissociação de ligação, o que leva a uma reação fotoquímica, ou podem retornar ao estado fundamental por outros mecanismos. Orendimento quântico será, então, menor do que a unidade e pode chegar a ser muito pequeno. O valor de ϕf é uma propriedade natural, determinada principalmente por sua estrutura. Em geral, um valor alto está associado com moléculas que possuem um sistema extenso de ligações duplas conjugadas em uma estrutura relativamente rígida devido à formação de anéis (VOGEL, 2002).
	A espectroscopia de fluorescência não é considerada uma ferramenta importante para a análise estrutural ou qualitativa, pois as moléculas com pequenas variações estruturais freqüentemente apresentam espectros de fluorescência similares. Também, as bandas de fluorescência em solução são relativamente largas à temperatura ambiente. Contudo, a fluorescência tem demonstrado ser uma ferramenta valiosa na identificação de derramamentos de petróleo. A fonte de um derramamento de petróleo pode às vezes ser identificada por comparação do espectro de emissão de fluorescência de uma amostra do derramamento com um da fonte suspeita. A estrutura vibracional dos hidrocarbonetos policíclicos presentes no petróleo torna esse tipo de identificação possível (CROUCH et al., 2006). 
Os métodos de fluorescência são empregados para se estudar equilíbrios químicos e cinética da mesma forma que os métodos espectrométricos de absorção. Freqüentemente é possível estudar-se as reações químicas a menores concentrações em decorrência da alta sensibilidade dos métodos de fluorescência. Em muitos casos, nos quais a monitoração da fluorescência não é exeqüível de forma ordinária, as sondas fluorescentes ou marcadores podem ser ligados covalentemente a sítios específicos em moléculas, como as proteínas, tornando-as assim detectáveis via fluorescência. Esses marcadores podem ser utilizados para fornecer informações sobre a energia de processos de transferência, sobre a polaridade da proteína e sobre a distância entre os sítios reativos (CROUCH et al., 2006).
Sobre a amostra
	 A água tônica contém um composto denominado quinino (figura 1), que foi inicialmente adicionada como sendo um composto com efeitos benéficos contra a malária. Segundo o Artigo 25 do decreto 6871/09, n° 6.871, de 4 de julho de 2009, no que diz respeito à padronização das bebidas não alcoólicas (capítulo VII), “água tônica de quinino é o refrigerante que contiver, obrigatoriamente, de três a sete miligramas de quinino ou seus sais, expresso em quinino anidro, por cem mililitros de bebida”. Atualmente, a água tônica contém uma quantidade insignificante de quinino em termos médicos e é somente usada pelo seu sabor (amargo). É, consequentemente, menos desagradável e também frequentemente adocicada. A água tônica é muito usada como uma bebida de mistura para coquetéis, especialmente os que são feitos com gin (por exemplo gin tônico). A água tônica com adição de limão ou lima é conhecida como bitter lemon, "pina de limão" ou bitter lime, respectivamente.
Figura 01. Forma estrutural do quinino
		 Fonte: <http://ferrao.org/quinino.gif>
OBJETIVOS
1. Objetivo geral 
- Utilizar a técnica de fluorescência molecular para determinar a concentração de quinino em amostra de água tônica.
2. Objetivos específicos
- Obter o comprimento de onda de máxima excitação e emissão para o quinino; 
- Investigar o efeito de supressão química pelo efeito de íons haletos e a variação de intensidade de fluorescência em função do pH.
- Construir uma curva analítica com soluções padrões derivadas de quinino;
- Determinar a intensidade de fluorescência de amostra água tônica através do uso de fluorímetro. 
PARTE EXPERIMENTAL
4.1 Materiais, equipamentos e soluções utilizadas 
Tabela 01. Materiais e equipamentos utilizados nos experimentos
	Materiais e equipamentos
	Dados
	Quantidade
	Fluorímetro
	Instrumento: LS55
	1
	Micropipeta
	10-100; 100-1000 µg/L
	2
	Conta gotas
	--
	4
	Balão volumétrico
	100 mL; 50 mL
	19
	Pipeta volumétrica 
	10 mL 
	3
	Pipeta graduada
	25 mL
	5
	Béquer
	--
	8
Tabela 03. Soluções utilizadas nos experimentos
	Soluções
	Concentração
	Água ultrapura
	--
	Soluções tampões 
	--
	Solução estoque de sulfato de quinino
	100 mg/L; 10 mg/L
	Solução de brometo de sódio 
	0,05 mol/L
	Ácido sulfúrico
	0,05 mol/L
	Hidróxido de sódio
	2 mol/L
	Ácido cítrico 
	2 mol/L
	Água tônica 
	--
1.2 Procedimento experimental 
Por meio de uma solução estoque com a concentração de 100 mg/L de sulfato dihidratado de quinino em 0,05 mol/L de ácido sulfúrico, preparou-se uma outra solução estoque contendo 10 mg/L de quinino em água. 
Posteriormente, para se observar o efeito do pH sobre a intensidade de fluorescência de uma solução de quinina, preparou-se as soluções tampões para pH= 2, 3, 4, 5 e 6, utilizando-se determinados volumes de hidróxido de sódio 2 mol/L e ácido cítrico 2 mol/L (Tabela 4)
Tabela 4: Soluções tampões para pH 2, 3, 4, 5 e 6
	 pH 2
	pH 3
	pH 4
	pH 5
	pH 6
	1 mL de NaOH 
2 mol/L e 10mL de ácido cítrico 2 mol/L
	6 mL de NaOH 
2 mol/L e 10mL de ácido cítrico 2 mol/L
	13 mL de NaOH 
2 mol/L e 10mL de ácido cítrico 2 mol/L
	21 mL de NaOH 
2 mol/L e 10mL de ácido cítrico 2 mol/L
	28 mL de NaOH 
2 mol/L e 10mL de ácido cítrico 2 mol/L
	100 mL
	100 mL
	100 mL
	100 mL
	100 mL
Logo após, adicionou-se em balões de 25 mL, 2,0 mL de solução estoque de 10 mg/L de quinino e, em cada balão, completava-se o volume com a solução tampão de pH. Desta forma, obteve-se cinco soluções. Em sequência, as intensidades de fluorescência das soluções são medidas no fluorímetro. 	
Posteriormente, para a avaliação da supressão de haletos, preparou-se, em balões volumétricos de 25 mL, soluções contendo 2 mL da solução estoque de 10 mg/L de quinino e 1, 2, 4, 8 e 16 mL da solução estoque de NaBr 0,05 mol/L. Avolumou-se a solução com ácido sulfúrico 0,05 mol/L. Em seguida, ajustou-se o comprimento de onda de excitação para 365 mn e o maior filtro do equipamento para monitorar a fluorescência à 450 nm. Colocou-se cada uma das soluções no instrumento e mediu-se a intensidade de fluorescência. 	
Com o objetivo de construir uma curva analítica para uma posterior determinação do teor de quinino na água tônica, preparou-se, a partir da solução estoque de quinino 100 mg/L, soluções derivadas de quinino 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 e 2 mg/L. Avolumou-se essas soluções com ácido sulfúrico 0,05 mol/L. Logo em seguida, preparou-se o branco contendo somente ácido sulfúrico 0,05 mol/L. Estas soluções tiveram as intensidades de fluorescência medidas no fluorímetro. 
Com o objetivo de preparar a amostra, diluiu-se, com ácido sulfúrico 0,05 mol/L, 5 mL de água tônica para um balão de 50 mL. Ajustou-se o comprimento de onda de excitação para 365 mn e o maior filtro do equipamento para monitorar a fluorescência à 450 nm. Posteriormente, mediu-se a intensidade de fluorescência para uma posterior determinação do teor de quinino da amostra por meio da curva de calibração. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES
PARTE 1: DETERMINAÇÃO DE COMPRIMENTO DE ONDA MÁXIMO DE EXCITAÇÃO E EMISSÃO
Para a realização deste experimento, foi utilizado uma solução de quinino na concentração de 0,05 mg/L, assim como fora descrito na parte experimental. Primeiramente, foram obtidos os seguintes espectros quando solução de quinino foi analisada no fluorímetro mantendo-se o comprimento de onda de emissão ou de excitação fixo (Figura 2).
Figura 2: Espectros de emissão (coloração azul) e espectro de excitação (coloração vermelha) para o quinino
 Nesse caso, observa-se que quando mantém-se o comprimento de onda de excitação fixo em 365 nm e realiza-se a varredura para a emissão (coloração azul), o comprimento de onda máximo obtido se localiza próximo de 450 nm. Já quando se mantém o comprimento de onda de emissão fixo em 450 nm e realiza-se a varredura para a excitação (coloração vermelha), observa-se que o comprimento de onda de máximo se encontra próximo de 345 nm. Quando variou-se os comprimentos de onda de excitação de 10 em 10 nm, mantendo-se a emissão fixa em 450 nm obteve-se os seguintes espectros(Figura 3):
Figura 3: Espectros de contorno para a superfície do quinino em 2D
 
Com base nesses espectros, pode-se obter um espectro 3D, isto é, um espectro de contorno para a superfície obtida em 3 dimensões (Figura 4)
Figura 4: Mapa de contorno para a superfície do quinino em 3D
 Com base nesse espectro pode observar que, o comprimento de onda de máxima excitação se encontra em 450 nm (eixo x no espectro), assim como fora fixado na programação. Já com relação ao comprimento de onda de excitação pode-se perceber, com base no espectro 3D que a faixa favorável para a excitação está localizada de 345 - 355 nm (eixo y no espectro). Esses resultados também estão de acordo os dados obtidos no experimento anterior, podendo-se inferir que para o quinino a intensidade máxima de fluorescência é obtida quando se utiliza de cerca de 350 nm para excitação e de 450 nm para emissão. Por essa razão, foi utilizado para os experimentos posteriores o comprimento de excitação de 350 nm e de 450 nm para o de emissão.
 
PARTE 2: DEPÊNDENCIA DA FLUORESCÊNCIA EM RELAÇÃO AO PH DA SOLUÇÃO 
Para a realização deste experimento, primeiramente preparou-se soluções contendo a solução de quinino e a solução tampão com pH 2, 3, 4, 5 e 6, como fora descrito na parte experimental. Foram obtidos os seguintes resultados quando essas soluções foram analisadas no fluorímetro (Figura 5). Após organizar-se a intensidade de fluorescência em função do pH em tabela (Tabela 5), pode-se construir o seguinte gráfico (Figura 5). Cabe destacar que a solução de quinino em pH 5 foi analisada novamente em um segundo momento, uma vez que na primeira análise foi percebido que o resultado não condizia com o esperado. Posteriormente, esse resultado foi atribuído à validade da solução tampão de pH 5, sendo necessário para a segunda análise (Figura 6) o preparo de uma nova solução tampão de pH 5.
Figura 5: Espectro obtido após a análise das soluções de quinino em diferentes pHs
Figura 6: Espectro obtido para a solução de quinino em pH 5
Tabela 5: Intensidades de fluorescência obtidas com as soluções de quinino em diferentes pHs
	pH
	Intensidade de fluorescência
	2
	595,24
	3
	424,53
	4
	252,58
	5
	104,00
	6
	7,92
Figura 7: Gráfico do comportamento da fluorescência em função do pH
Com base nos resultados obtidos pode-se perceber que à medida que o pH aumenta, diminui-se linearmente a intensidade de fluorescência. De acordo com a literatura (SKOOG, 2009) geralmente a fluorescência de um composto aromático com anéis substituintes ácidos ou básicos, como é o caso do quinino (Figura 8), é dependente do pH.
Figura 8: Estrutura molecular do quinino
Neste caso, as mudanças na emissão resultam da diferença no número de espécies de ressonância que estão associadas às formas ácidas e básicas das moléculas de quinino. Tanto o comprimento de onda quanto a intensidade de emissão são diferentes para as formas protonadas e desprotonadas. Na medida em que o meio se torna mais básico, há uma maior probabilidade de haver a abstração do hidrogênio do grupamento hidroxila da molécula de quinino pelo grupo hidroxila proveniente da solução tampão. Isso faz com que haja várias estruturas de ressonância, algumas delas podem ser vistas na figura a seguir (Figura 9):
Figura 9: Principais estruturas de ressonância para o quinino em meio básico
Com base nessas estruturas, pode-se inferir que o aumento de pH favorece a diminuição da rigidez estrutural da molécula de quinino. Isso porque a ressonância provocada pela maior concentração de íons hidroxila em meios mais básicos altera as ligações do anel aromático, o que diminui a rigidez pela movimentação dos elétrons. Como a redução da rigidez, também há o aumento da probabilidade de haver perdas energéticas por processos de relaxação não- radioativas (como vibração e conversão interna), o que causa a diminuição de energia gasta com a emissão fluorescente. Assim, para o quinino obteve-se maiores valores de intensidade de fluorescência quando se utiliza de meios menos básicos, já que a molécula de quinino apresenta maior rigidez estrutural quando protonada, havendo também uma melhora da sensibilidade da técnica nessas condições. 	
 PARTE 3: EFEITO DE SUPRESSÃO DE HALETOS
Para a avaliação da supressão de haletos, mediu-se intensidade de fluorescência de soluções com diferentes concentrações de brometo, obtendo-se o espectro que pode ser visto na figura 10. 
Figura 10: Espectro obtido por meio dos valores de intensidade de fluorescência para os diferentes volumes de uma solução de brometo de sódio na análise do efeito de supressão
Por meio desses resultados, construiu-se um gráfico utilizando as intensidades de fluorescência contra o volume de haleto presente no meio. Obteve-se então, uma curva exponencial, com um fator de correlação de 0,9913. O gráfico pode ser visto abaixo: 
Figura 11: Efeito do volume da solução de NaBr 0,05 mol/L, adicionado às soluções padrão de quinina 10 mg/L, sobre a intensidade de fluorescência
Por meio do gráfico, nota-se uma queda exponencial do sinal com o aumento do volume de haleto. Isto é, há queda do sinal de fluorescência com o aumento de concentração do íon Br- no meio, o que evidencia a influência desse íon haleto sobre a intensidade de fluorescência. Esse efeito de supressão, chamado quenching, geralmente refere-se à energia não-radiotiva transferida das moléculas excitadas para outras moléculas, ditas agentes desativadores. Isso faz com que uma parte de moléculas fluorescentes, proporcional aos agentes desativadores, passem para o estado fundamental, diminuindo o rendimento quântico. 
Esse efeito de supressão, chamado de quenching, é colisional, necessitando do contato entre as espécies excitadas e o agente supressor. Desta forma, a concentração do supressor deve ser suficientemente alta para que haja uma alta probabilidade de colisão entre as espécies excitadas e o supressor durante o tempo de vida do estado excitado. 	
Em consequência, a magnitude dessa desativação, causada pelo supressor, ocorre em função da concentração do agente desativador e da sua capacidade de difusão no meio. Desta forma, a supressão reduz tanto a eficiência quântica da fluorescência como o tempo de vida da fluorescência, o que explica o resultado obtido por meio do gráfico, em que notou-se uma queda exponencial do sinal com o aumento do agente supressor, o Br-. Isto é, a magnitude da supressão da fluorescência da quinina é proporcional à quantidade de brometo na mistura. 
CONCLUSÃO
Foi possível aplicar a fluorescência molecular para realizar determinações quantitativas referentes a concentração de quinino em amostras de água tônica. Foi possível ainda determinar experimentalmente que os comprimentos de onda de excitação e emissão nos quais ocorrem a maior intensidade de fluorescência para o quinino se encontra na faixa de 350 nm e 450 nm, respectivamente. Pode-se constatar também que o pH afeta diretamente a fluorescência do quinino, podendo-se perceber maiores intensidades de fluorescência em meios menos básicos. 
A partir dos resultados obtidos, foi possível analisar o efeito de supressão de haletos sobre a intensidade de fluorescência. Verificou-se que a magnitude da supressão da fluorescência da quinina é proporcional à quantidade de brometo na mistura, já que o mesmo funciona como agente desativador da intensidade de fluorescência. Desta forma, por meio do experimento, constatou-se que há queda do sinal de fluorescência com o aumento de concentração do íon Br- no meio. 
REFERÊNCIAS
1. SKOOG, Douglas A.; CROUCH, Stanley. Princípios de análise instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookman, 2009 
2. SKOOG, Douglas A.; WEST, Donald et.al.. Fundamentos de Química Analítica. 8 ed. São Paulo: Cengage Learning, 2011
3. BILHALBA, L. P. Os Fenômenos da Luminescência. Instituto de Física e Matemática da Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2011. 
4. CROUCH, R. S.; HOLLER, F. J.; SKOOG, D.A.; WEST, D.M. Fundamentosde Química Analítica. Tradução da 8ª edição norteamericana. Cengage Learning Edições Ltda. São Paulo, 2006. 
5. CROUCH, S. R.; HOLLER, F. J.; SKOOG, D. A. Fundamentos de Análise Instrumental. 6ª ed, Editora Bookman. Porto Alegre, 2009. 
6. SILVA, I. F. da. Espectroscopia De Fotoluminescência. Universidade Estadual de Campinas. Campinas, 2000
7. BARNES, J. D.; DENNEY, R. C.; MENDHAM, J.; THOMAS, M. J. K. VOGEL - ANÁLISE QUÍMICA QUANTITATIVA. 6ª ed, LTC Editora. Rio de Janeiro, 2002.
Intensidade 	
2	3	4	5	6	595.24	424.53	252.58	104	7.92	pH
Intensidade de fluorescência
fluorescência 	1	2	4	8	16	708.62	613.77	471.61	302.86	15	1.4	Volume de haleto (mL)
Fluorescência 
2