AULA PRÁTICA 1: PIPETAGEM AUTOMÁTICA E ESPECTROMETRIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUÍZ DE FORA
CAMPUS AVANÇADO GOVERNADOR VALADARES
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
BIOQUÍMICA XIII PRÁTICA
TAINARA SOARES DOS SANTOS
AULA PRÁTICA 1: PIPETAGEM AUTOMÁTICA E ESPECTROMETRIA
Profª. Maísa Silva
GOVERNADOR VALADARES
2021
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUÍZ DE FORA
CAMPUS AVANÇADO GOVERNADOR VALADARES
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
BIOQUÍMICA XIII PRÁTICA
TAINARA SOARES DOS SANTOS
AULA PRÁTICA 1: PIPETAGEM AUTOMÁTICA E ESPECTROMETRIA
Atividade desenvolvida na disciplina Bioquímica XIII prática como requisito parcial para aprovação, a ser entregue no dia 12/11/2021.
GOVERNADOR VALADARES
2021
Sumário
1.INTRODUÇÂO	4
Princípios de espectrofotometria	4
2.MATERIAIS, REAGENTES E QUEPAMENTOS	6
3.PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	6
4. RESULTADOS	6
5. DISCUSSÃO	6
6. CONCLUSÃO	7
REFERÊNCIAS BIBLIOGÁRAFICAS	7
1.INTRODUÇÂO
Os instrumentos de medição são fundamentais em laboratórios que necessitem de aferições exatas de volumes, o que garante a qualidade dos resultados das análises. Dentre os mais utilizados, têm destaque as pipetas, que têm por função a transferência de volumes de um recipiente para outro. A pipeta é um instrumento de uso diário nos laboratórios. Sem ela seria inviável realizar os processos de análise devido aos volumes de reagentes e de amostra envolvidos. As pipetas automáticas foram inventadas na década de 1940 por George Riggs. O invento pretendia ser uma alternativa às pipetas graduadas de vidro, utilizadas pelos inspetores de leite para recolher amostras visando avaliar a presença de bactérias. A pipeta automática facilitaria o trabalho e preveniria a contaminação dos inspetores, pois dispensava a sucção do líquido com a boca.
Atualmente as pipetas automáticas são amplamente utilizadas, principalmente em laboratórios de Biologia Molecular, Microbiologia e Bioquímica. Elas são capazes de transferir pequenos volumes (entre 0,25 µL – 5000 µL) com alta reprodutibilidade e exatidão. Cada pipeta apresenta uma faixa de volume ajustável, e é conhecida pelo volume máximo que pode dispensar. Por exemplo, a P1000 é capaz de dispensar volumes de 200 µL a 1000 µL (1 mL). A pipeta é utilizada desde a extração do ácido nucleico (DNA ou RNA) até a pipetagem da amostra e dos reagentes necessários para a realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma boa pipeta deve ser precisa, exata e de fácil manuseio – não deve apresentar resistência ao abaixar ou levantar o pistão ou ao dispensar a ponteira. Além disso, utilizar ponteiras de boa qualidade e com filtro, para a biologia molecular, ajuda a evitar contaminação de materiais durante as etapas do processo, a pipeta também deve se adequar a diferentes ponteiras.
Princípios de espectrofotometria
Espectroscopia é a técnica de absorção que estuda as interações da luz com as moléculas de um determinado composto. O espectrofotômetro é um aparelho no qual um feixe de luz monocromática, com comprimento de onda adequado à análise de um determinado componente, passa através de uma solução, componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho. O sinal recebido no detector devido à intensidade do feixe emergente, que corresponde a um determinado feixe incidente, é convertido em medida de absorbância para o comprimento de onda da análise. Todo modelo de espectrofotômetro deve necessariamente apresentar os seguintes componentes: fonte de energia radiante, seletor de faixa de radiação, recipiente para conter a amostra e um detector de radiação com um sistema de leitura associado (ROBERTO, et al 2013).
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. A maioria dos métodos utilizados em bioquímica clínica envolve a determinação espectrofotométrica de compostos corados (cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são específicos e muito sensíveis. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao fato de eles absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético) (LANA, et al 2019).
A espectrofotometria, medida de absorção ou transmissão de luz, é uma das mais valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem como em análises clínicas. Por meio da espectrofotometria. Segue a baixo um esquema de funcionamento interno de um espectrofotômetro (LANA, et al 2019).
Fonte: Martinez (2014). Adaptado pelos autores LANA, et al 2019. 
Uma fonte (lâmpada) emite a luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz é selecionada por um monocromador que transmite em um comprimento de onda específico. A luz monocromática passa através da amostra em uma cubeta com caminho óptico l. Uma parte da luz é absorvida pela amostra dependendo da concentração (quanto maior é a concentração da amostra maior será a luz absorvida). A luz transmitida é medida por um detector.
2.MATERIAIS, REAGENTES E QUEPAMENTOS
· 01 pipeta de 1000 µL;
· 01 pipeta de 100 µL;
· 01 Béquer de 100mL;
· Ponteiras;
· Balança analítica;
· Água destilada;
· 01 Vidro de relógio;
· Papel toalha.
3.PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Com auxílio de uma pipeta automática de 1000 µL, pipetou-se 990 µL de água destilada. Em seguida pesou-se o volume pipetado na balança analítica com auxílio de um vidro de relógio. Anotou-se o resultado.
Com auxílio de uma pipeta automática de 1000 µL, pipetou-se 550 µL de água destilada. Em seguida pesou-se o volume pipetado na balança analítica com auxílio de um vidro de relógio. Anotou-se o resultado.
Com auxílio de uma pipeta automática de 1000 µL e outra de 100 µL, pipetou-se cerca de 237µL de água destilada. Em seguida pesou-se o volume pipetado na balança analítica com auxílio de um vidro de relógio. Anotou-se o resultado.
4. RESULTADOS
1° procedimento: No primeiro procedimento o peso esperado com a pipetagem era de 990mg, porém o peso obtido foi de 903mg.
2° procedimento: No primeiro procedimento o peso esperado com a pipetagem era de 550mg, porém o peso obtido foi de 663mg.
3° procedimento: No primeiro procedimento o peso esperado com a pipetagem era de 237mg, porém o peso obtido foi de 246mg.
5. DISCUSSÃO
Observou-se que os resultados obtidos foram diferentes dos valores esperados, isso se deve a possíveis erros, como por exemplo, a profundidade errada de imersão da ponta: a profundidade correta de imersão da ponta pode aumentar a precisão em até 5%. A ponta deve ser imersa entre 1-2 mm, para pipetas de volume micro, e até 3-6 mm para pipetas normais, dependendo do tamanho da ponta. Se a ponta for imersa muito rápido, o volume de gás nela é comprimido, fazendo com que muito líquido seja aspirado; o ângulo incorreto de pipetagem: o ângulo de imersão da ponta da sua pipeta na amostra deve ser o mais vertical possível, e não deve desviar mais de 20 graus do vertical. Um ângulo mais horizontal faz com que muito líquido seja levado para a ponta, resultando em aspiração imprecisa; ritmo inconsistente de pipetagem: utilize um ritmo consistente de pipetagem entre as amostras. Evite se apressar ou a operação rápida, e obtenha um ritmo para cada etapa no ciclo de pipetagem; dispensação inconsistente: maior precisão e reprodutibilidade para cada amostra podem ser obtidas ao garantir que a última gota é totalmente dispensada e não adere à extremidade da ponta. Para a maioria das aplicações, é recomendado dispensar com a extremidade da ponta que está contra a parede do recipiente, pois reduz ou elimina a quantidade remanescente da amostra na ponta. Essa técnica pode aumentar a precisão. Frente esses possíveis erros, faz-se necessário melhorar o manuseio das pipetas.
6. CONCLUSÃO
Foi possível concluir com esta prática, as vantagens da utilização de instrumentos de medição bem como as pipetas automáticas,estão relacionadas com a possibilidade de se minimizar os problemas de medições, e também fazer transferência de pequenos volumes com precisão. Há inúmeras vantagens atribuídas a técnica espectroscópica, é um método quantitativo, possui baixo custo operacional, é de fácil utilização e produz resultados de interpretação geralmente bastante simples.
REFERÊNCIAS BIBLIOGÁRAFICAS
LAB. Laboratório Integrado de Química: Disponível em: http://labiq.iq.usp.br/paginas_view.php?idPagina=13&idTopico=65#.YYgJEGDMLIU. Acesso em: 07/11/2021.
LABNETWORK. Disponível: https://www.labnetwork.com.br/especiais/a-importancia-da-pipetagem-nos-processos-analiticos/. Acesso em: 07/11/2021.
LANA, C. R. et al; construção de espectrofotômetro visível para fins didáticos. Journal of Exact Sciences – JES. Vol.21, n.1, pp.20-25. 2019.
ROBERTO, L. P. et al. Aplicação do método da espectrofotometria de derivadas na identificação e doseamento simultâneo de sistemas multicomponentes. Rev. Bras. Cienc. Farm. 39 (1). 2013.