Bioquimica - Prática II - Proteínas 2021-2 doc

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UNIVERSIDADE DE SANTA CRUZ DO SUL – UNISC 
Departamento de Ciências da Vida 
Módulo: Bioquímica 
 
DESNATURAÇÃO E DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PROTEÍNAS 
 
1. FUNDAMENTAÇÃO 
As proteínas são polímeros formados pela condensação de unidades repetitivas de 
aminoácidos através de uma ligação chamada ligação peptídica, que se dá entre o carbono da 
carboxila (COOH) de um aminoácido e o nitrogênio do grupo amina de outro aminoácido (Figura 1). 
 
 
Figura 1 – União de dois aminoácidos através de uma ligação peptídica. 
 
 A cadeia peptídica resultante dessa condensação caracteriza-se por possuir uma 
extremidade que contém o grupo carboxila (C terminal) e outra extremidade que contém um 
grupo amino (N terminal). A linha formada pelos átomos de carbono e nitrogênio que formam a 
ligação peptídica é chamada de esqueleto peptídico. 
 As proteínas podem apresentar até quatro níveis de organização estrutural: estruturas 
primária, secundária, terciária e quaternária. 
 
1.1 DESNATURAÇÃO DE UMA PROTEÍNA 
As proteínas nativas são apenas marginalmente estáveis em condições fisiológicas. Cada 
uma das várias interações não covalentes nas proteínas – como os efeitos hidrofóbicos, interações 
eletrostáticas e ligações químicas cruzadas – possuem uma grande quantidade de energia e 
mantém a conformação espacial da proteína estável. Portanto, a estrutura de uma proteína é o 
resultado do balanço delicado entre poderosas forças concorrentes. 
A maioria das proteínas apresenta uma conformação espacial globular e são solúveis em 
água. Esta solubilidade pode ser alterada com o uso de algumas técnicas que desnaturam a 
biomolécula. Esta desnaturação implica a perda da conformação nativa da proteína, com 
consequente perda da solubilidade (ocorre precipitação da proteína) e consequente perda da sua 
função biológica. 
As proteínas podem ser desnaturadas pela ação de agentes desnaturantes físicos e 
químicos. Nesta aula prática veremos a ação de sais neutros e de sais de metais pesados, ácidos 
fortes e calor sobre a molécula protéica. Geralmente a ação destes agentes desnaturantes causa 
precipitação da molécula protéica. 
LEMBRETE: a desnaturação não causa quebra da ligação peptídica!!!! 
 
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1.2 DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS 
Ao se quantificar uma determinada proteína em material biológico ou não, vários métodos 
podem ser utilizados: absorção no ultravioleta, método de Folin-Lowry, método de Kjedahl, 
método do biureto, etc. O método do biureto faz uso da propriedade de íons Cu2+ em meio alcalino 
de formar ligações com o nitrogênio das ligações peptídicas. Desta reação (reação de biureto) 
resulta uma coloração púrpura intensa. Este fato pode ser explorado para se determinar por 
colorimetria a quantidade de proteína de uma solução. A cor desenvolvida numa reação de íons de 
Cu2+ em meio alcalino com estas proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua 
intensidade é proporcional à quantidade de tais ligações. A intensidade da cor formada pode ser 
medida espectrofotometricamente a 540 nm. 
 
 
2. OBJETIVOS 
 Reconhecer os ácidos fortes como agentes precipitantes das proteínas; 
 Reconhecer o calor como agente desnaturante das proteínas; 
 Desenvolver habilidade na utilização de técnicas espectrofotométricas; 
 Dosar proteínas por espectrofotometria na região do visível. 
 
 
3. METODOLOGIA 
 
3.1 REAGENTES 
 Solução de proteínas (albumina) 
 Solução saturada de sulfato de amônio (770g/L) – Sal neutro 
 Solução de ácido tricloroacético (100g/L) – Ácido forte 
 Reagente de biureto 
 Solução padrão de caseína (10 mg/mL) 
 
 
3.2 PROCEDIMENTO e registro dos RESULTADOS 
 
3.2.1 Desnaturação de proteínas por ácidos fortes? 
a) Agitar o frasco contendo a solução de proteínas e transferir 1 mL para um tubo de ensaio. 
b) Agitar a solução de ácido tricloroacético e colocar 0,5 mL desta para o tubo contendo a 
solução de proteínas. 
c) Adicionar 5 mL de água destilada. 
d) Observar e interpretar os resultados. 
RESULTADO: ___________________________ 
 
3.2.2 Desnaturação de proteínas pelo calor? 
a) Colocar em um tubo de ensaio 2 mL da solução de proteínas. 
b) Colocar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos. 
c) Retirar o tubo, observar e interpretar os resultados. 
RESULTADO: _________________________________ 
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3.2.3 Determinação da concentração de proteínas por espectrofotometria 
a) Separar e identificar 7 tubos de ensaio; 
b) Seguir o esquema da Tabela 1, utilizando a solução padrão de caseína 10 mg/mL para as 
diluições; 
a. OBS: o tubo 7 não faz parte da curva padrão. É justamente a solução de caseína com 
concentração desconhecida que se deseja encontrar. 
c) Após a adição dos reagentes, agitar e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente; 
d) Após os 30 minutos, agitar os tubos e transferir para as cubetas previamente padronizadas; 
e) Usando o tubo 1 como branco da reação, determinar a absorbância de cada tubo em 540 
nm; 
f) Com os dados de absorbância (ABS) x concentração de caseína ([ ] mg/mL), construir a 
curva-padrão em excel (gráfico de dispersão) e determinar a concentração da solução 
desconhecida (SD) utilizando a equação da reta (y = ax + b, onde: eixo y=absorbância e eixo 
x=concentração da proteína em mg/mL). 
 
Tabela 1 – Esquema para construção da curva padrão 
Tubo Caseína 
(mL) 
Água 
(mL) 
Biureto 
(mL) 
ABS 
(540 nm) 
[ ] 
(mg/mL) 
1 - 1,3 4 0 0 
2 0,2 0,8 4 2 
3 0,4 0,6 4 4 
4 0,6 0,4 4 6 
5 0,8 0,2 4 8 
6 1,0 - 4 10 
Solução de caseína com concentração desconhecida (SD): 
7 0,5 da SD 0,5 4 ? 
 
 
OBS: se precisarem de um auxílio para construção da curva padrão em planilha excel seguem dois 
links de vídeos explicativos: 
https://www.youtube.com/watch?v=sLZ3lJayAZQ&ab_channel=TheBestProfessor-
Profa.Simone%C3%81vila 
 
https://www.youtube.com/watch?v=DGf68DC43tQ&ab_channel=BiosLogus-
DesenvolvimentoPessoal 
 
 
https://www.youtube.com/watch?v=sLZ3lJayAZQ&ab_channel=TheBestProfessor-Profa.Simone%C3%81vila
https://www.youtube.com/watch?v=sLZ3lJayAZQ&ab_channel=TheBestProfessor-Profa.Simone%C3%81vila
https://www.youtube.com/watch?v=DGf68DC43tQ&ab_channel=BiosLogus-DesenvolvimentoPessoal
https://www.youtube.com/watch?v=DGf68DC43tQ&ab_channel=BiosLogus-DesenvolvimentoPessoal